王能強(qiáng), 吳思琪, 王新鳳, 黎小軍, 徐櫻翠, 高 健

(1. 湖南科技大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 湘潭 411201; 2. 新余學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室, 江西 新余 338004)

1 前 言

手性醇是一類重要手性模塊化合物，在醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有極高的應(yīng)用價(jià)值[1-3]，如(S)-(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲醇、(S)-3-氯-1-苯基-1-丙醇和(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯可分別合成抗過(guò)敏藥物倍他司汀[4]、抗抑郁藥氟西汀[5]和降壓藥物卡托普利[6]等。利用還原酶或全細(xì)胞為催化劑不對(duì)稱生物還原潛手性羰基化合物是制備手性醇的有效途徑。還原酶是一類以NAD(P)H 為輔酶、在酶學(xué)分類上屬于短鏈脫氫酶/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)類，因具有立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、安全性和環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，日益受到研究者關(guān)注，且投入大量研究工作[7-9]。隨著生物技術(shù)和手性技術(shù)的快速發(fā)展，還原酶的需求越來(lái)越大，開(kāi)發(fā)更多高效、新型還原酶催化劑已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。

(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇((R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol，(R)-BTPE)是合成阿瑞吡坦、福沙吡坦和羅拉吡坦等藥物的關(guān)鍵手性模塊[10-11]。(R)-BTPE 的制備方法有化學(xué)法合成[12-13]、酶法拆分[14-15]和生物催化不對(duì)稱還原[11,16-25]等，基于還原酶或全細(xì)胞為催化劑的不對(duì)稱生物還原法具有高立體選擇性、副產(chǎn)物少和理論產(chǎn)率可達(dá)100% 等特征，越來(lái)越多的還原酶或微生物細(xì)胞被報(bào)道用于不對(duì)稱還原制備(R)-BTPE，如Leifsoniaxyli[17]、Lactobacillus kefir[11,18]、Penicilliumexpansum[19]、Microbacteriumoxydans[20]、TrichodermaasperellumZJPH0801[21]、Chryseobacteriumsp.CA49[22]、Burkholderiacenocepacia[23]、Leifsoniasp.S749[24]和固定化的酮還原酶[25]等。然而，大多數(shù)報(bào)道的還原酶在生物催化制備(R)-BTPE 時(shí)存在催化活性低、底物濃度限制和反應(yīng)條件敏感等問(wèn)題，不利于工業(yè)化應(yīng)用。本研究基于基因挖掘技術(shù)和還原酶保守序列分析，經(jīng)篩選和設(shè)計(jì)獲得不對(duì)稱生物催化還原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮(3,5-bis(trifluoromethyl)acetophenone，BTAP)制備(R)-BTPE 的新型還原酶SDR05；以表達(dá)還原酶SDR05 的重組大腸桿菌為催化劑，采用單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 法構(gòu)建重組菌不對(duì)稱還原BTAP 制備(R)-BTPE 的反應(yīng)體系，提高還原酶SDR05 的催化效率，克服底物濃度限制，實(shí)現(xiàn)底物在高質(zhì)量濃度下轉(zhuǎn)化。

2 材料和方法

2.1 試劑

[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮、(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇、(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇、十二烷、異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)和卡那霉素、酵母抽提物、胰蛋白胨、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)等。

2.2 菌體培養(yǎng)和收集方法

(1) 種子培養(yǎng)：從解凍的甘油管中取0.5 mL 菌液接種于裝有50 mL Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，然后置于37 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h。

(2) 重組菌靜息細(xì)胞的獲得：取1.0 mL 培養(yǎng)好的種子液，接種于裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于37 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)90 min(菌體的光密度值OD600nm為0.25～0.30)，無(wú)菌條件下加入終濃度為0.6 mmol·L-1IPTG，再置于29 ℃、150 r·min-1條件下繼續(xù)培養(yǎng)14 h，然后在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心5 min，棄上清液后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9% 的NaCl 溶液洗滌2 次，即得重組濕菌體。

2.3 還原酶基因挖掘、設(shè)計(jì)及含還原酶基因的重組菌構(gòu)建

以還原酶氨基酸序列(GenBank：AGW01025)為探針，利用基因挖掘技術(shù)從 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中通過(guò)序列比對(duì)獲得與探針序列相似度為70%～80% 的還原酶基因，文獻(xiàn)檢索篩選出還原酶功能未被報(bào)道的基因?yàn)槟康幕?；再基于還原酶高度保守氨基酸的序列分析，對(duì)篩選獲得的目的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，比對(duì)探針序列和已報(bào)道的相關(guān)還原酶序列，改變目的基因氨基酸殘基，使其保守氨基酸序列得以保留，得到新型還原酶基因，并在其5’和3’端添加NcoI 和Hind III 酶切位點(diǎn)，然后送于蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因全合成和構(gòu)建含還原酶基因的重組菌。

2.4 重組菌靜息細(xì)胞不對(duì)稱還原制備(R)-BTPE 的條件研究

(1) 單因素實(shí)驗(yàn)構(gòu)建反應(yīng)體系：以2.2 節(jié)部分獲得的濕菌體為催化劑，基于單因素實(shí)驗(yàn)，考察反應(yīng)溫度、緩沖液pH 值、添加劑種類和濃度、底物濃度和菌體濃度等對(duì)產(chǎn)物(R)-BTPE 產(chǎn)率的影響，構(gòu)建還原反應(yīng)體系。單因素實(shí)驗(yàn)初始反應(yīng)體系：異丙醇體積分?jǐn)?shù)為25%，重組菌濕菌體質(zhì)量濃度為40 g·L-1，BTAP濃度為300 mmol·L-1和一定體積的0.1 mmol·L-1、pH 7.4 磷酸緩沖液組成5 mL 反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為30 ℃、150 r·min-1和12 h。

(2) Box-Behnken 法確定重要因素的最優(yōu)水平：基于Box-Behnken 法，考察影響重組菌催化還原反應(yīng)顯著因素(菌體濃度、異丙醇體積分?jǐn)?shù)和NAD+濃度)的交互作用，以反應(yīng)12 h 的產(chǎn)物產(chǎn)率為響應(yīng)值，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果二次方模型的回歸分析和方差分析，確定它們的最優(yōu)水平，驗(yàn)證最優(yōu)水平下產(chǎn)物產(chǎn)率。

(3) 反應(yīng)時(shí)間和較大規(guī)模對(duì)重組菌靜息細(xì)胞制備(R)-BTPE 的影響：在以構(gòu)建獲得的重組菌靜息細(xì)胞不對(duì)稱還原BTAP 的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，考察不同反應(yīng)時(shí)間和較大規(guī)模反應(yīng)體系對(duì)生物還原制備(R)-BTPE 的影響。

2.5 酶活力、催化常數(shù)kcat 和米氏常數(shù)Km 測(cè)定

(1)酶活力測(cè)定：實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建獲得的反應(yīng)體系(異丙醇體積分?jǐn)?shù)為69%，重組菌質(zhì)量濃度為300 g·L-1，NAD+濃度為3.9 mmol·L-1，MgCl2濃度為1 mmol·L-1、BTAP 濃度為3 000 mmol·L-1和一定體積的0.1 mol·L-1、pH 7.4 磷酸緩沖液)中，32 ℃和150 r·min-1條件下，反應(yīng)30 min 后萃取，用氣相色譜法分析和計(jì)算產(chǎn)物和剩余底物濃度。定義每分鐘催化BTAP 產(chǎn)生1 μmol(R)-BTPE 所需酶量(細(xì)胞質(zhì)量，g)為一個(gè)酶活力單位(U)。

(2)催化常數(shù)kcat和米氏常數(shù)Km測(cè)定：以構(gòu)建獲得的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，分別配制底物質(zhì)量濃度為256、384、512、640 和768 g·L-1的反應(yīng)體系，在32 ℃、150 r·min-1的條件下，反應(yīng)30 min 后，乙酸乙酯萃取、離心收集乙酸乙酯相，氣相色譜法分析、計(jì)算產(chǎn)物和剩余底物濃度。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法，以產(chǎn)物(R)-BTPE 的生成速度倒數(shù)與底物濃度倒數(shù)作圖，求出kcat和Km。

2.6 產(chǎn)物的分離純化及鑒定

還原反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，離心收集乙酸乙酯相，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸餾獲得產(chǎn)物濃縮液。產(chǎn)物濃縮液上樣硅膠層析柱，用洗脫劑(體積比V(石油醚):V(乙酸乙酯)=8:1)進(jìn)行洗脫分離，用硅膠薄板層析檢測(cè)所含產(chǎn)物的收集液，合并含產(chǎn)物的收集液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸餾，即得產(chǎn)物。用氣相色譜法和旋光法測(cè)定產(chǎn)物純度和旋光度，用CDCl3溶解后進(jìn)行氫譜1H-NMR 和碳譜13C-NMR 分析。

2.7 氣相色譜法測(cè)定產(chǎn)物產(chǎn)率和對(duì)映體過(guò)量值

還原反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用一定體積的乙酸乙酯萃取，離心收集乙酸乙酯相(即氣相分析樣品)，參照文獻(xiàn)[26]，采用氣相色譜法測(cè)定產(chǎn)物和剩余底物濃度，計(jì)算產(chǎn)物產(chǎn)率(yield)和對(duì)映體過(guò)量值(enantiomeric excess，ee)，方法分別為yield = (cP/c0)100%和ee = [(cR-cS)/(cS+cR)] × 100%，其中，c0為底物的起始濃度，cP為產(chǎn)物濃度，cR、cS分別為產(chǎn)物(R)-BTPE 和(S)-BTPE 的濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 還原酶基因的挖掘、設(shè)計(jì)及其重組菌構(gòu)建

以LeifsoniaxyliHS0904 源還原酶(GenBank：AGW01025)為探針，利用基因挖掘技術(shù)從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)序列比對(duì)獲得15個(gè)來(lái)源于不同微生物種屬的還原酶基因，它們與探針序列相似度為70%～80%；經(jīng)文獻(xiàn)檢索篩選出5 個(gè)還原酶功能未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基因?yàn)槟康幕?，它們均屬于SDR 家族的氧化還原酶基因，GenBank 號(hào)分別為 WP_134172672、BAP47552、WP_066039821、WP_147782688 和WP_180934612；基于還原酶保守氨基酸的序列分析，比對(duì)目的基因與探針高度保守氨基酸殘基(如T14G15-(X)3-G19-X-G21，D65，N90-N91-A92-G93，催化四聯(lián)體N116-S144-Y157-K161，N179，P187-G188和T192。)和其他已報(bào)道具有催化功能的還原酶序列，對(duì)選定的5 個(gè)目的基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，改變其氨基酸殘基，使目的基因保留高度保守氨基酸殘基，或同時(shí)對(duì)其他位置的氨基酸進(jìn)行適當(dāng)改變，獲得5 個(gè)新型還原酶(命名為SDR01、SDR02、SDR03、SDR04 和SDR05)基因，并分別進(jìn)行全基因合成和構(gòu)建含相應(yīng)還原酶基因的重組菌。對(duì)構(gòu)建獲得的重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以培養(yǎng)獲得的重組菌靜息細(xì)胞為催化劑，進(jìn)行不對(duì)稱還原BTAP 制備相應(yīng)手性醇的功能驗(yàn)證。結(jié)果表明，表達(dá)還原酶SDR05 的重組菌具有較高的不對(duì)稱還原BTAP 制備(R)-BTPE 的能力(產(chǎn)物產(chǎn)率為35.1%，ee 值為99.9%)，而表達(dá)還原酶SDR01(產(chǎn)率為0)、SDR02(產(chǎn)率為0)、SDR03(產(chǎn)率為0)和SDR04(產(chǎn)率為1.2%)的重組菌沒(méi)有或僅有較低的催化能力。比對(duì)原有目的基因序列，還原酶SDR01、SDR02 和SDR03 分別改變0、1(K179N)和1(K179N)個(gè)氨基酸殘基，僅使高度保守氨基酸序列保留；還原酶SDR04 和SDR05 分別改變8(E60R/K61A/A148S/K179N/T182V/N183V/H191R/V249T)和18(L27T/R42E/G43E/E46N/T49V/V73E/E80V/A81E/P129D/V145I/S154Y/G163A/H175Y/Q178K/Q179N/A197S/A202D/A249T)個(gè)氨基酸殘基，它們不僅使高度保守氨基酸序列保留，且通過(guò)比對(duì)探針和其他已報(bào)道具有催化功能的還原酶序列，對(duì)其他位置氨基酸殘基進(jìn)行改變。功能驗(yàn)證和序列分析結(jié)果表明，還原酶只保留高度保守氨基酸殘基序列，不能確保其具有催化活性，其他位置的保守氨基酸對(duì)其催化活性也有較大的影響。

如圖1 所示為用ESPript 3.0[27]在線繪制的還原酶SDR05 氨基酸序列的BLAST(Basic Local alignment search tool)比對(duì)分析圖， 發(fā)現(xiàn)還原酶 SDR05 氨基酸序列與其原有目的基因[來(lái)源于Nocardioidesungokensis的還原酶(GenBank：WP_180934612)]有最高的序列相似性(92.83%)，與探針序列有81.27%的序列相似性；與文獻(xiàn)報(bào)道的催化制備(R)-BTPE 的Leifsoniasp. S749 源還原酶(GenBank：BAD99642)有75.70%的序列相似性。還原酶SDR05 與unclassifiedLeifsonia(GenBank：WP_018191686)、Cryocolasp. 340MFSha3.1(GenBank：WP_020077127)和Pimelobactersimplex(GenBank：WP_038681732)源的酶也有較高的序列相似性，分別為80.88%、80.48% 和80.48%。因此，SDR05 是一種新型的還原酶，確定表達(dá)還原酶SDR05 的重組菌為本研究的后續(xù)菌株。

圖1 還原酶SDR05 氨基酸序列的BLAST 比對(duì)分析(還原酶的保守序列用“*”標(biāo)記)Fig.1 Blast analysis of amino acid sequences of reductase SDR05 and other proteins (The conserved sequence of reductases were marked with "*")

3.2 構(gòu)建重組菌靜息細(xì)胞不對(duì)稱還原BTAP 的反應(yīng)體系

3.2.1 反應(yīng)溫度和緩沖液pH 值對(duì)還原反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度和緩沖液pH 值是不對(duì)稱生物還原反應(yīng)的關(guān)鍵影響因素。圖2 為不同反應(yīng)溫度和緩沖液不同pH 值對(duì)還原產(chǎn)率和ee 值的影響，從圖2 中可看出，最佳反應(yīng)溫度和緩沖液pH 值分別為32 ℃和7.4。

圖2 反應(yīng)溫度和pH值對(duì)生物催化還原的影響Fig.2 Effects of reaction temperature and pH on biocatalytic reduction

3.2.2 添加劑對(duì)還原反應(yīng)的影響

金屬離子[28]、NAD+[24]和NADP+等添加劑可作為酶蛋白結(jié)構(gòu)的一部分或作為輔助因子對(duì)酶蛋白的穩(wěn)定性和活性有一定促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)體系中添加金屬離子、NAD+和NADP+等對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率和ee 值的影響(見(jiàn)圖3(a))。結(jié)果表明，反應(yīng)體系中添加MgCl2和NAD+對(duì)還原反應(yīng)有促進(jìn)作用，尤其是NAD+可顯著提高產(chǎn)物產(chǎn)率，可能是因?yàn)檫€原酶SDR05是NADH 依賴型還原酶(輔酶依賴型與探針還原酶一致[28])，NAD+的添加能強(qiáng)化輔酶的再生?？疾旆磻?yīng)體系中不同濃度的MgCl2和NAD+對(duì)還原反應(yīng)的影響(見(jiàn)圖3(b))，結(jié)果表明，MgCl2的最佳添加濃度為1 mmol·L-1，與不添加MgCl2相比，產(chǎn)物產(chǎn)率提高了11.5%；NAD+最佳添加濃度為3 mmol·L-1，產(chǎn)物產(chǎn)率為96.1%，與不添加NAD+相比，產(chǎn)率提高了111.2%。

圖3 添加劑對(duì)生物催化還原的影響Fig.3 Effects of additives on biocatalytic reduction

3.2.3 底物濃度對(duì)還原反應(yīng)的影響

制備手性醇的底物是有機(jī)物質(zhì)，在不對(duì)稱還原反應(yīng)中，它們存在底物水溶性差、對(duì)細(xì)胞有毒性、底物抑制和產(chǎn)物抑制等問(wèn)題，導(dǎo)致底物濃度受到限制，影響反應(yīng)效率。目前已報(bào)道的大多數(shù)制備(R)-BTPE 用催化劑存在底物濃度限制，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。考察了底物BTAP 不同濃度對(duì)生物催化還原的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著B(niǎo)TAP 濃度增大，產(chǎn)物濃度也明顯增多，但產(chǎn)物產(chǎn)率下降，BTAP 濃度為3 000 mmol·L-1時(shí)，產(chǎn)物濃度最大(943.7 mmol·L-1)，產(chǎn)物產(chǎn)率為31.5%。為了實(shí)現(xiàn)底物在高濃度下的轉(zhuǎn)化，確定反應(yīng)體系中底物添加濃度為3 000 mmol·L-1。

圖4 BTAP 濃度對(duì)生物催化還原的影響Fig.4 Effects of BTAP concentration on biocatalytic reduction

3.2.4 菌體質(zhì)量濃度對(duì)還原反應(yīng)的影響

因反應(yīng)體系底物濃度(3 000 mmol·L-1)增加，生物催化劑的用量也要提高。因此，實(shí)驗(yàn)考察菌體質(zhì)量濃度對(duì)生物催化還原的影響(見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明，菌體質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率有顯著影響，當(dāng)菌體質(zhì)量濃度由20 g·L-1增大到150 g·L-1時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率由16.4% 提高到51.5%；繼續(xù)提高菌體質(zhì)量濃度，產(chǎn)物產(chǎn)率也繼續(xù)增大，但提高幅度不明顯。當(dāng)菌體質(zhì)量濃度為300 g·L-1時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率為56.6%，菌體質(zhì)量濃度增大到400 g·L-1時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率僅增加了0.5%，因此，確定最佳菌體質(zhì)量濃度為300 g·L-1。

圖5 靜息細(xì)胞質(zhì)量濃度對(duì)生物催化還原的影響Fig.5 Effects of resting cells concentration on biocatalytic reduction

3.2.5 異丙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)還原反應(yīng)的影響

輔酶的持續(xù)再生是生物催化不對(duì)稱還原反應(yīng)關(guān)鍵影響因素。異丙醇作為輔酶再生的偶聯(lián)基質(zhì)，其添加量對(duì)還原反應(yīng)的輔酶再生至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)考察異丙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)還原產(chǎn)率和ee 值的影響(見(jiàn)圖6)。結(jié)果表明，隨著異丙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，產(chǎn)物產(chǎn)率大幅度提高，在異丙醇體積分?jǐn)?shù)為60% 時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率最大(83.4%)，比優(yōu)化前(異丙醇體積分?jǐn)?shù)為25% 時(shí)的產(chǎn)物產(chǎn)率為56.6%)提高了47.3%，可能是因?yàn)楫惐甲鳛檩o酶再生的偶聯(lián)基質(zhì)，能強(qiáng)化輔酶再生，且異丙醇作為有機(jī)溶劑，可以增加細(xì)胞膜的通透性和底物溶解性，有利于底物進(jìn)入胞內(nèi)和產(chǎn)物流出胞外，從而提高還原反應(yīng)的效率；繼續(xù)提高異丙醇體積分?jǐn)?shù)，產(chǎn)物產(chǎn)率下降，可能是因?yàn)檫^(guò)量的異丙醇，會(huì)對(duì)菌體有毒性，使酶失活，降低反應(yīng)效率。因此，異丙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖6 異丙醇添加量對(duì)生物催化還原的影響Fig.6 Effects of isopropanol amounts on biocatalytic reduction

3.3 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要因素的最優(yōu)水平

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，菌體質(zhì)量濃度(A)、異丙醇體積分?jǐn)?shù)(B)和NAD+濃度(C)是影響不對(duì)稱還原制備(R)-BTPE 的顯著因素。研究采用Box-Behnken 法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察3 個(gè)顯著因素間的交互作用以及對(duì)還原反應(yīng)的影響，并確定它們最優(yōu)水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。表1 中A=-1、0、1 分別為菌體質(zhì)量濃度100、200、300 g·L-1對(duì)應(yīng)的水平值，B=-1、0、1 分別為異丙醇體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%對(duì)應(yīng)的水平值，C=-1、0、1 分別為NAD+濃度1、3、5 mmol·L-1對(duì)應(yīng)的水平值。

表1 Box-Behnken法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of Box-Behnken method

利用Design-Expert 10.0.7 軟件，對(duì)表1 響應(yīng)值(產(chǎn)率)進(jìn)行模型二次方回歸分析和方差分析(見(jiàn)表2)，建立二次回歸方程Y= 70.58 + 12.24A+ 6.50B+ 1.84C+6.80AB-0.22AC- 0.95BC-3.93A2-8.40B2- 0.93C2。模型方程決定系數(shù)R2、校正決定系數(shù)R2adj和預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2pred分別為0.998、0.996 和0.978，它們的數(shù)值均接近于1，且相互間的差值較小，表明模型的擬合程度良好，模型可較準(zhǔn)確反映實(shí)驗(yàn)值，可較好地預(yù)測(cè)結(jié)果和優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)。由表2 可知，模型一次項(xiàng)A和B、二次項(xiàng)A2和B2、交叉項(xiàng)AB具有高度顯著性(概率p＜0.000 1)，模型一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)C2，交叉項(xiàng)BC具有顯著性(p＜0.050 0)。二次回歸方程的三維響應(yīng)面曲線圖(見(jiàn)圖7)也表明，因素A(菌體質(zhì)量濃度)和B(異丙醇體積分?jǐn)?shù))為顯著變量，對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)率影響較大，而C(NAD+濃度)在選定濃度范圍內(nèi)僅有輕微影響，結(jié)果與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致。此外，回歸模型的高F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值(F值=445.13)和低概率(p＜0.000 1)表明，回歸模型方程具有高度顯著性，可以預(yù)測(cè)最佳反應(yīng)條件。預(yù)測(cè)結(jié)果為菌體質(zhì)量濃度300 g·L-1、異丙醇體積分?jǐn)?shù)69% 和NAD+濃度3.9 mmol·L-1，模型預(yù)期產(chǎn)物產(chǎn)率為84.4%。由于預(yù)測(cè)的最佳反應(yīng)條件未包括在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的17 組實(shí)驗(yàn)中，需驗(yàn)證和確認(rèn)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)物產(chǎn)率為88.1%，稍高于預(yù)期的產(chǎn)率，基本與預(yù)期產(chǎn)率相符。

表2 Box-Behnken法二次方模型的回歸分析和方差分析Table 2 Regressive analysis and ANOVA results of the Box-Behnken quadratic model

圖7 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)二次回歸方程的三維響應(yīng)面曲線圖Fig.7 Analysis of the experimental results by Box-Behnken method

3.4 反應(yīng)時(shí)間和較大規(guī)模對(duì)重組菌靜息細(xì)胞制備(R)-BTPE的影響

在50 mL 反應(yīng)瓶中加入質(zhì)量濃度為300 g·L-1的重組菌、體積分?jǐn)?shù)為69%的異丙醇、濃度為3.9 mmol·L-1的NAD+、1 mmol·L-1的MgCl2、3 000 mmol·L-1的BTAP 和一定體積的pH 7.4 的磷酸緩沖液組成5 mL 反應(yīng)體系，在32 ℃和150 r·min-1條件下分別反應(yīng)不同時(shí)間。結(jié)果表明(見(jiàn)圖8)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物產(chǎn)率增大，當(dāng)時(shí)間為18 h，產(chǎn)物產(chǎn)率為 98.3%，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，產(chǎn)物產(chǎn)率增加不大(98.8%/21h，99.1%/24h)，因此，確定反應(yīng)時(shí)間為18 h。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，產(chǎn)物ee 值變化不大，都保持在99.9% 以上。研究結(jié)果與優(yōu)化前相比，BTAP 濃度由300 mmol·L-1提高到3 000 mmol·L-1，實(shí)現(xiàn)底物在高濃度下轉(zhuǎn)化；與文獻(xiàn)報(bào)道的不對(duì)稱生物還原制備(R)-BTPE 用還原酶相比，如Chryseobacteriumsp.CA49 源還原酶ChKRED20[22](底物濃度為586 mmol·L-1，產(chǎn)率為92%)、Codexis源還原酶P1B2[25](底物濃度為586 mmol·L-1，產(chǎn)率為97%)、LeifsoniaxyliHS0904 源突變還原酶LXCAR-S154Y[29](底物濃度為1 000 mmol·L-1，產(chǎn)率為98.7%)、Lactobacillus kefir源還原酶LkCR[18](底物濃度為1 191 mmol·L-1，產(chǎn)率為96.7%)和Leifsoniasp.S749 源還原酶KR01[24](底物濃度為2 344 mmol·L-1，產(chǎn)率為98.3%)等，本研究篩選和設(shè)計(jì)獲得的新型還原酶SDR05 具有最高的底物濃度(底物濃度為3 000 mmol·L-1，產(chǎn)率為98.3%)。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組菌制備(R)-BTPE 的影響Fig.8 Effects of reaction time on (R)-BTPE preparation by recombinant E. coli cells

進(jìn)一步考察了較大規(guī)模反應(yīng)體系(2.0 L反應(yīng)瓶中加0.4 L反應(yīng)液)對(duì)制備(R)-BTPE的影響。結(jié)果表明，在32 ℃、150 r·min-1的條件下反應(yīng)18 h，產(chǎn)物產(chǎn)率和ee值分別為97.8% 和99.9%。單位質(zhì)量(每克)細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)物量為9.8 mmol·L-1，與文獻(xiàn)報(bào)道的最高值7.7 mmol·L-1相比[24]，提高了27.2%。

3.5 酶活力、催化常數(shù)kcat和米氏常數(shù)Km測(cè)定

在構(gòu)建獲得的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，測(cè)得還原酶SDR05的酶活力為0.023 U，單位質(zhì)量每克菌體細(xì)胞酶活力為43.5 U。以產(chǎn)物(R)-BTPE的生成速度倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)作圖獲得雙倒數(shù)方程y=62.665x+0.207(R2=0.992)，得出Vmax(最大反應(yīng)速率)、Km和kcat分別為4.8 g·L-1·min-1、300.8 g·L-1和0.016 min-1。

3.6 產(chǎn)物的分離純化與鑒定

上述較大規(guī)模制備(R)-BTPE 的反應(yīng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸餾和硅膠柱層析等方法分離，獲得274 g 的分離產(chǎn)物，分離收率為90%，經(jīng)氣相色譜檢測(cè)，產(chǎn)物純度為99% 以上。分離產(chǎn)物經(jīng)CDCl3溶解后進(jìn)行1H-NMR 和13C-NMR 鑒定[1H-NMR (600 MHz, CDCl3):7.83 (單峰s，2H)，7.79 (s，1H)，5.04 (四重峰q，1H，耦合常數(shù)J=6.78 Hz)，2.46 (s, 1H)，1.56 (雙峰d，3H，J=6.78 Hz)]，碳譜13C-NMR(100 Hz，CDCl3)，化學(xué)位移δ= 147.9，131.7，131.8，125.6，124.9，121.8，121.1，119.4，69.4，25.5]，確定分離產(chǎn)物為BTPE，再經(jīng)過(guò)旋光度測(cè)定([α]D25= +21.5)及與標(biāo)準(zhǔn)品(R)-BTPE 的氣相結(jié)果比對(duì)分析，確證產(chǎn)物為(R)-BTPE。

4 結(jié) 論

基于基因挖掘技術(shù)和還原酶保守序列分析，經(jīng)篩選和設(shè)計(jì)獲得新型還原酶SDR05；以表達(dá)還原酶SDR05 的重組菌為催化劑，通過(guò)向反應(yīng)體系中添加異丙醇和NAD+，強(qiáng)化輔酶再生，獲得了不對(duì)稱還原BTAP 制備(R)-BTPE 的反應(yīng)體系(質(zhì)量濃度為300 g·L-1的重組菌，濃度為3.9 mmol·L-1的NAD+，濃度為1 mmol·L-1的MgCl2，體積分?jǐn)?shù)為69% 的異丙醇，濃度為3 000 mmol·L-1的BTAP 和一定體積的0.1 mol·L-1、pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液)和反應(yīng)條件(32 ℃、150 r·min-1和18 h)，提高了還原反應(yīng)效率(產(chǎn)物產(chǎn)率98.3% 和ee 值99.9%)，克服了底物濃度限制，實(shí)現(xiàn)底物在高質(zhì)量濃度(768 g·L-1)下的轉(zhuǎn)化，為工業(yè)化制備(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇等手性化合物奠定了基礎(chǔ)。