廖彩翔 黎國(guó)偉 秦曉鏵

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，多發(fā)于中老年人。近年來(lái)，隨著靶向藥及造血干細(xì)胞移植的應(yīng)用，MM 患者預(yù)后明顯改善，但因MM 為異質(zhì)性極強(qiáng)的腫瘤，患者生存期從數(shù)月到數(shù)十年不等［1］。決定MM 患者預(yù)后異質(zhì)性的主要因素為細(xì)胞遺傳學(xué)異常，MM 患者最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)異常為1 號(hào)染色體異常，其中45%MM 患者1q 擴(kuò)增均涉及1q21［2］。1q21 包含一個(gè)CKSIB基因，為高度保守的細(xì)胞周期蛋白激酶亞基1 蛋白家族成員之一，該家族與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）互相作用，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，因此可能在MM 發(fā)病機(jī)制中有一定應(yīng)用價(jià)值［3］。p53基因最易發(fā)生異常，野生型p53 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［4］。但目前鮮有報(bào)道關(guān)于p53基因在MM 患者中的表達(dá)情況，而國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)CKSIB在MM 患者中的作用。本研究通過(guò)分析MM 患者化療后骨髓CKSIB、p53基因表達(dá)，旨在探討其在MM 患者中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月至2022年3月收治于惠州市中心人民醫(yī)院的86 例MM 患者作為研究對(duì)象。所有患者化療4 個(gè)療程（硼替佐米+地塞米松+來(lái)那度胺，28d 為1 個(gè)療程）后根據(jù)2014 國(guó)際骨髓瘤工作組標(biāo)準(zhǔn)將86 例MM 患者分為有效組（n=53）和無(wú)效組（n=33）。其中男59 例，女27 例；平均年齡（68.15±4.57）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際骨髓瘤工作組診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②有完整的臨床資料及隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他血液系統(tǒng)疾??；②患有認(rèn)知障礙患者。所有患者或家屬均已簽署知情同意書(shū)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)［5］

完全緩解（CR）：血清和尿液免疫固定電泳均為陰性，軟組織漿細(xì)胞瘤消失，骨髓中漿細(xì)胞＜5%；部分緩解（PR）：M 蛋白減少≥50%，24 h 尿M蛋白減少≥90%或降至＜200 mg/24 h；骨髓內(nèi)漿細(xì)胞數(shù)量減少≥50%；疾病穩(wěn)定（SD）：血清M 蛋白減少≥50%；疾病進(jìn)展（PD）：M 蛋白最低值≥5 g/dL，尿M 蛋白≥200 mg/24 h，骨髓漿細(xì)胞比例增加25%。

1.3 FISH 法檢測(cè)骨髓CKS1B、p53 基因表達(dá)

漿細(xì)胞純化：采用CD138 抗體MACS 分選漿細(xì)胞，詳細(xì)步驟參考文獻(xiàn)［6］，將分選的漿細(xì)胞用常規(guī)方法低滲，將染色體置-20℃條件下備用。

CKS1B/CDKN2C 所用試劑盒：安必平（LBP）1q21/1p32 基因探針，廠家：安必平；P53 所用試劑盒：慢性淋巴細(xì)胞白血病染色體及基因異常探針檢測(cè)試劑盒TP53/CEP17 雙色探針，廠家：康錄生物。取出標(biāo)本，用甲醇/冰醋酸（3∶1）固定液，然后氣千法滴片，在37℃2×SSC 中老化30 min，分別在70%、85%、100%乙醇各脫水2 min。把標(biāo)本用70%甲酰胺/2×SSC 變形3 min。每個(gè)標(biāo)本滴加探針1 μL，用雜交稀釋液4 μL 混合均勻，水?。?2℃）變性5 min。加探針5 μL 于帶雜交區(qū)，蓋玻片后雜交過(guò)夜。將玻片放入72℃0.4×SSC/0.3%吐溫中2 min，2×SSC/0.1%吐溫中1 min 后將玻片晾干。待15 min 后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，具體探針閾值：1q21 擴(kuò)增為5.5%、P53 缺失為6.0%。CKS1B（1q21）擴(kuò)增、CDKN2C（1p32）缺失、TP53 的陽(yáng)性截?cái)嘀禐?0。每例MM標(biāo)本分析≥100 個(gè)骨髓瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)的百分率，超過(guò)截?cái)嘀祫t判定為陽(yáng)性［7］。

1.4 臨床資料收集

收集所有患者的相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、（Durie-Salmon，DS）分期、國(guó)際分期體系（International Staging System，ISS）分期、修正的國(guó)際分期體系（Revised-International Staging System，R-ISS）分期、血β2-微球蛋白、C 反應(yīng)蛋白、血鈣、乳酸脫氫酶、血紅蛋白等。MM 患者疾病分期依據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［8］中DS 分期、ISS 分期及R-ISS 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。其中R-ISS 分期Ⅰ期：乳酸脫氫酶（LDH）水平正常和細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)危患者；Ⅱ期：不符合R-ISS-Ⅰ期和Ⅲ期患者；Ⅲ期：符合R-ISS-Ⅲ期且為細(xì)胞遺傳學(xué)高危或LDH 偏高患者。

1.5 隨訪

所有患者均通過(guò)電話或門(mén)診復(fù)診形式隨訪，患者疾病進(jìn)展情況及生存狀態(tài)，本研究中末次隨訪截止日期為2022年5月31日，無(wú)失訪。隨訪時(shí)間至少3年，69 例疾病穩(wěn)定，17 例疾病進(jìn)展。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)；并以Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析骨髓CKS1B、p53表達(dá)與MM 患者預(yù)后的關(guān)系。以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并以Log-Rank法進(jìn)行組間生存差異檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組骨髓CKS1B、p53 陽(yáng)性表達(dá)率比較

有效組MM 患者骨髓CKS1B、p53陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于無(wú)效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組骨髓CKS1B、p53 陽(yáng)性表達(dá)率比較［n（%）］Table 1 Comparison of positive expression rates of CKS1B and p53 in bone marrow between two groups［n（%）］

2.2 骨髓CKS1B、p53在MM患者療效監(jiān)測(cè)中的價(jià)值

繪制CKS1B、p53 對(duì)MM 患者療效監(jiān)測(cè)的ROC曲線分析顯示，CKS1B、p53 的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.78、0.51，AUC 分別為0.851、0.896，敏感度為75.75%、90.90%，特異度為77.35%、83.01%。見(jiàn)表2、圖1。

表2 骨髓CKS1B、p53 在MM 患者療效監(jiān)測(cè)中的價(jià)值Table 2 The value of bone marrow CKS1B and p53 in curative effect monitoring of MM patients

2.3 骨髓CKS1B、p53 陽(yáng)性表達(dá)與MM 患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系

MM 患者的骨髓CKS1B、p53 陽(yáng)性表達(dá)與R-ISS 分期、C 反應(yīng)蛋白、血紅蛋白有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與年齡、性別、DS 分期、ISS分期、血β2-微球蛋白、血鈣、乳酸脫氫酶無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 骨髓CKS1B、p53 陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床特點(diǎn)的關(guān)系Table 3 The relationship between positive expression of CKS1B and p53 in bone marrow and clinical characteristics of patients

2.4 影響MM 患者預(yù)后的單因素分析

本研究MM 患者的3年生存率為80.23%（69/86）。單因素分析結(jié)果顯示，白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、乳酸脫氫酶、血β2-微球蛋白、CKS1B 及p53 是影響MM 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 影響MM 患者預(yù)后的單因素分析［n（%）］Table 4 Univariate analysis affecting the prognosis of MM patients［n（%）］

2.5 影響MM 患者預(yù)后的Cox 回歸分析

以MM 患者預(yù)后為因變量進(jìn)行Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示，白細(xì)胞、血紅蛋白、CKS1B 及p53 為MM 患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表5。其中，CKS1B 陽(yáng)性表達(dá)組（71.42%）3年生存率低于陰性表達(dá)組（90.90%），p53 陽(yáng)性表達(dá)組（50.00%）3年生存率低于陰性表達(dá)組（82.00%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5、圖2。

表5 影響MM 患者預(yù)后的Cox 回歸分析Table 5 Cox regression analysis affecting the prognosis of MM patients

圖2 骨髓CKS1B、p53 表達(dá)與MM 患者3年生存率的相關(guān)性Figure 2 Correlation between the expression of CKS1B and p53 in bone marrow and the 3-year survival rate of MM patients

3 討論

決定MM 患者預(yù)后異質(zhì)性的主要因素為細(xì)胞遺傳學(xué)異常。近年來(lái)，有研究顯示CKS1B 基因位于染色體1q21，為SCFSkp2 泛素化復(fù)合體的主要成分，可降解大部分細(xì)胞周期調(diào)控因子，在多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展占重要作用［9］。CKS1B 在Skp2 與磷酸化的p27kip1 的結(jié)合中起促進(jìn)作用，使p27kip1 泛素化和隨后經(jīng)蛋白酶體降解中有重要意義。p27kip1 與Cdk2/cyclin A 復(fù)合體結(jié)合并抑制細(xì)胞周期G1-s 期轉(zhuǎn)換，所以其降低異?？梢l(fā)細(xì)胞惡性增殖、細(xì)胞周期紊亂。

已有相關(guān)報(bào)道CKS1B 表達(dá)過(guò)高可導(dǎo)致腫瘤形成，此類患者預(yù)后較差［10］。p53 可誘導(dǎo)細(xì)胞周期紊亂或細(xì)胞凋亡，從而維持基因組的穩(wěn)定。而腫瘤的特征之一即為基因組不穩(wěn)定，因此p53 功能異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目前臨床研究較多報(bào)道CKS1B、p53 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的應(yīng)用，但關(guān)于CKS1B、p53 功能異常在MM 發(fā)生、發(fā)展的作用的研究較少。本研究結(jié)果表明CKS1B、p53 與MM 發(fā)病有關(guān)。兩者陽(yáng)性表達(dá)差異可反映化療療效，可作為MM 患者化療后療效評(píng)估的輔助指標(biāo)。繪制CKS1B、p53 對(duì)MM 患者療效監(jiān)測(cè)的ROC 曲線分析顯示，CKS1B、p53 的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.78、0.51，AUC 分別為0.851、0.896，敏感度為75.75%、90.90%，特異度為77.35%、83.01%。提示骨髓CKS1B、p5 可能對(duì)MM 患者有一定的診斷價(jià)值。有研究發(fā)現(xiàn)［11］，miR-1258 可能通過(guò)靶向CKS1B 調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移，提示CKS1B 是癌腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。CKS1 高表達(dá)提示腫瘤預(yù)后較差和生活質(zhì)量低下，p53 的高表達(dá)與眾多疾病的預(yù)后相關(guān)，提示兩者是疾病預(yù)后的影響因素。本研究發(fā)現(xiàn)MM 患者的骨髓CKS1B、p53 陽(yáng)性表達(dá)與R-ISS 分期、C 反應(yīng)蛋白、血紅蛋白有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與年齡、性別、DS 分期、ISS 分期、血β2-微球蛋白、血鈣、乳酸脫氫酶無(wú)明顯相關(guān)性。本研究MM 患者的3年生存率為80.23%（69/86）。與楊玉［12］、Li 等［13］的研究類似。白細(xì)胞、血紅蛋白、CKS1B、p53 高表達(dá)可能是導(dǎo)致MM 患者生存期縮短的原因。Hao 等［14］的研究報(bào)道染色體1q21/CKS1B 的增加或擴(kuò)增是骨髓瘤的高危因素，p53 基因缺失也被認(rèn)為是MM 的高危特征。本研究進(jìn)一步進(jìn)行Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示，白細(xì)胞、血紅蛋白、CKS1B 及p53 為MM 患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素，提示CKS1B 及p53 的異常表達(dá)對(duì)MM 預(yù)后帶來(lái)不良影響，有可能成為病情監(jiān)測(cè)與預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)之一。

綜上，骨髓CKSIB、p53 對(duì)MM 患者療效監(jiān)測(cè)有一定價(jià)值，MM 中骨髓CKSIB、p53 陽(yáng)性表達(dá)與白細(xì)胞、血紅蛋白及預(yù)后密切相關(guān)。有望成為MM 療效及預(yù)后評(píng)估的特異性指標(biāo)，但本研究不足之處在于樣本量較少，日后需加大樣本量延長(zhǎng)隨訪時(shí)間驗(yàn)證相關(guān)指標(biāo)在MM 患者中所發(fā)揮的作用。