王楊 吉永 匡野 付曉野 楊曉青 李祎

新生兒黃疸（neonatal jaundice）在新生兒中十分常見。有文獻(xiàn)研究表明，其發(fā)病率達(dá)0.35%～0.57%以上［1］，見于80%以上早產(chǎn)兒和60%以上足月兒，占住院新生兒的20%～40%［2］。由于新生兒早期膽紅素的代謝特點(diǎn)、疾病因素，新生兒黃疸可以是預(yù)后良好的暫時(shí)生理現(xiàn)象，也可以是預(yù)后較差的疾病表現(xiàn)。

如果未及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療血清中升高的膽紅素，可能在下列幾個(gè)方面影響到新生兒的遠(yuǎn)期臨床預(yù)后：一、黃疸可能發(fā)導(dǎo)致智力發(fā)育低下、癡呆以及大腦發(fā)育障礙；持續(xù)的黃疸還可能使患兒發(fā)生膽紅素腦病或核黃疸，給患兒大腦造成不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)損害。二、一些嚴(yán)重的黃疸，如溶血性黃疸還會損傷肝腎功能，使患兒多器官衰竭［3］。因此研究能夠有效輔助臨床早期診斷和治療新生兒黃疸的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)顯得尤為重要。而遺傳因素對新生兒黃疸的發(fā)生起著十分重要的作用，G6PD基因突變即是其中一種。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年8月至2019年3月昆明市延安醫(yī)院新生兒黃疸患兒134 例，男性91 例，女性43 例，日齡2 h 至28 天。其中91 例患兒為病理性黃疸，占67.91%，43 例患兒為生理性黃疸，占32.09%。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒科學(xué)》［4］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)：①出生后24 h 內(nèi)即出現(xiàn)黃疸，持續(xù)時(shí)間長，足月兒＞2 周，早產(chǎn)兒＞4 周仍不退；②血清總膽紅素足月兒超過220 μmol/L，早產(chǎn)兒超過257 μmol/L；③每日血清膽紅素升高超過5 mg/dL 或每小時(shí)＞0.5 mg/dL；④結(jié)合膽紅素超過34 μmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)為入院時(shí)合并以下疾病或情況的患兒：早產(chǎn)、過期產(chǎn)、溶血病、感染、顱內(nèi)出血及巨大頭顱血腫、新生兒出血癥、先天畸形（消化道畸形、先天性心臟?。⒓谞钕俟δ艿拖?、唐氏綜合征、紅細(xì)胞增多癥、出生窒息、缺氧缺血性腦病、肝功能異常及直接膽紅素升高。從134 例患兒中留取2018年11月至2019年3月的新生兒黃疸患兒49 例作為G6PD基因突變檢測對象，男性33 例，女性16 例，其中37 例患兒為病理性黃疸，占75.51%，12 例患兒為生理性黃疸，占24.49%。日齡2 h 至20 d。本研究通過院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患兒法定監(jiān)護(hù)人的知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集對49 名新生兒黃疸患兒進(jìn)行靜脈采血1.0～2.0 mL，EDTA 抗凝，-20℃保存。

1.2.2 基因提取

采用吸附柱法，首先利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞內(nèi)核酸釋放出來；然后將釋放的核酸特異性地吸附在特定的硅膠膜上；然后將吸附在硅膠膜上的核酸用洗脫液洗脫下來，得到純化的核酸。用超微量分光光度計(jì)NP80Touch 測定提取的DNA 樣本的濃度和純度，DNA 樣本的OD260nm/OD280nm 應(yīng)在1.6～2.0 范圍之間，且OD260nm/OD230nm≥2.0。

1.2.3G6PD基因突變檢測

使用上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的熒光定量PCR 儀（型號：SLAN-96S），應(yīng)用廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法，批號：17121501、18120601）進(jìn)行G6PD基因突變，具體方法如下：PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系設(shè)為25 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃2 min-95℃10 min→（95℃15 s →65℃～56℃（每個(gè)循環(huán)下降1℃）15 s →76℃20 s）×10 個(gè)循環(huán)→（95℃15 s →55℃15 s →76℃20 s）×50 個(gè)循環(huán)。使用實(shí)時(shí)熒光PCR 儀，共有FAM、HEX、ROX 和Cy5 四個(gè)通道，設(shè)置在55℃退火階段時(shí)采集熒光信號。熔解曲線分析程序設(shè)置如下：95℃1 min →35℃3 min →40℃～85℃以0.4℃/5 s的升溫速率進(jìn)行熔解曲線分析，且在此階段采集FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道熒光信號。將待測樣本八個(gè)檢測通道（A、B 體系中）的熔解峰與野生型對照對應(yīng)通道的熔解峰之間熔點(diǎn)（Tm 值）的差異進(jìn)行比較，從而判斷核酸樣本是否發(fā)生G6PD基因突變。與野生型對照對應(yīng)熔解峰比較差異（ΔTm 值）在±1℃以內(nèi)的樣本熔解峰為野生型峰，差異超過±2℃即為突變型峰。

1.2.4 膽紅素測定

使用美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)的全自動生化分析儀（型號：AU5421），采用北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的總膽紅素測定試劑盒（釩酸鹽氧化法，批號：17-0603、18-0605）和直接膽紅素測定試劑盒（釩酸鹽氧化法，批號：17-0615、18-0612），血清膽紅素在PH3.0 的條件下，會與釩酸反應(yīng)，生成膽綠素，通過檢測膽紅素氧化前后的吸光度變化，可以計(jì)算出樣品血清中膽紅素濃度水平。

1.2.5 葡萄糖6-磷酸脫氫酶活性檢測

采用比值法，在吩嗪二甲酯硫酸鹽遞氫的促進(jìn)下，NADPH 的H 傳遞給氧化型NBT（硝基四氮唑藍(lán)）（黃色），使之轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型NBT（藍(lán)色），藍(lán)色的深淺與NADPH 生成量一致（S1）；同法測定6PG 生成的NADPH 的量（S2），通過S1/S2 判斷NADPH 生成的相對含量，從而判斷G6PD是否缺乏。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 軟件進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)資料以（%）表示；計(jì)量資料以（）表示，各組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G6PD 基因突變檢測結(jié)果

49 例新生兒黃疸患兒之中，共檢出3 例G6PD基因突變，發(fā)生率為6.12%，其中c.1376G＞T純合突變2 例（66.67%），c.95A＞G 純合突變1 例（33.33%）?；蛲蛔兓純壕鶠槟袐?。G6PD基因突變率為6.12%。其余未檢出突變。3 例突變病例均為病理性黃疸，G6PD酶活性均有大幅降低，數(shù)值為0.62±0.24（U/gHb），病理性黃疸突變率為8.10%。

2.2 生理性黃疸和病理性黃疸之間各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)差異

生理性黃疸組與病理性黃疸組之間總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-14.15、-3.55、-14.12、-3.93、-3.62、2.79，P＜0.05）；兩組超敏CRP、紅細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.47、-2.73，P＞0.05）。見表1。

表1 生理性與病理性黃疸之間實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of related laboratory indicators between physiological and pathological jaundice（±s）

表1 生理性與病理性黃疸之間實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of related laboratory indicators between physiological and pathological jaundice（±s）

分組生理性黃疸組病理性黃疸組t 值P 值n 43 91總膽紅素（μmol/L）153.97±49.80 283.69±49.00-14.15＜0.05直接膽紅素（μmol/L）16.67±8.71 23.85±14.60-3.55＜0.05間接膽紅素（μmol/L）137.29±46.63 259.84±47.44-14.12＜0.05超敏CRP（mg/L）2.19±3.11 2.68±4.48-0.47＞0.05血紅蛋白（g/L）142.28±20.09 156.61±18.91-3.93＜0.05紅細(xì)胞（×1012）4.15±0.63 4.44±0.58-2.73＞0.05紅細(xì)胞壓積（L/L）0.41±0.06 0.45±0.05-3.62＜0.05網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對值（×1012）0.18±0.09 0.12±0.07 2.79＜0.05

3 討論

本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果［5］一致，表明了直接膽紅素、間接膽紅素、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積等實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)作為輔助判斷生理性黃疸和病理性黃疸的有效指標(biāo)有一定價(jià)值。當(dāng)數(shù)值較高時(shí)，就可提前預(yù)測病理性黃疸，及時(shí)進(jìn)行預(yù)防。Newman［6］等也曾提出網(wǎng)織紅細(xì)胞可用于診斷新生兒黃疸。

遺傳因素是引起新生兒黃疸的重要原因之一，有研究表明G6PD基因突變、GST基因多態(tài)性、UGT1A1基因多態(tài)性［7］等遺傳因素與新生兒黃疸有明確的相關(guān)性。我國G6PD基因缺陷及其引起的G6PD缺乏癥［8］導(dǎo)致新生兒黃疸臨床多見。2004年美國兒科學(xué)會在《新生兒高膽紅素血癥診療方案》中將G6PD缺乏作為≥35 周新生兒黃疸的高危因素［9］。

至今，世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的140 多種G6PD基因突變型［10］，呈高度異質(zhì)性，除第3 和第13 外顯子外，整個(gè)基因皆可發(fā)生突變，且在所發(fā)現(xiàn)的基因突變型中，85.4%表現(xiàn)為單個(gè)堿基置換的錯(cuò)義突變，另有8.0%為復(fù)合突變［11］。但半數(shù)突變并不影響酶的活性，不引發(fā)溶血。G6PD基因突變在不同的地域以及不同的民族之間有著較高的異質(zhì)性，我國G6PD基因突變的分布情況呈現(xiàn)“南高北低”勢態(tài)［12］，其中尤以云南、四川、貴州、廣東、廣西等地為高發(fā)區(qū)。中國人群中以G1388A、G1376T、C1024T、C1044T、G871A 和A95G6 種點(diǎn)突變多見；非洲人中常見G202A、A376G 和G680T 等點(diǎn)突變；地中海人群中，最常見的突變是C563T。本次研究定性檢測人外周血基因組DNA 中中國人群常見的12 種G6PD基因突變：c.95A＞G、c.383T＞C、

c.392G＞T、c.487G＞A、c.517T＞C、c.592C＞T、c.871G＞A、c.1004C＞A、c.1024C＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A。本研究還對49 例新生兒黃疸進(jìn)行了G6PD基因突變檢測，共檢出3 例G6PD基因突變，其中c.1376G＞T 突變是主要的G6PD突變型之一，它也是中國人群中最常見的點(diǎn)突變類型之一，此與湖南長沙地區(qū)［13］、廣西百色地區(qū)［14］、柳州地區(qū)［15］、潮州市［16］、海口地區(qū)［17］等地的主要G6PD基因突變型一致。

G6PD基因位于X 染色體長臂2 區(qū)8 帶（Xq28），長約18 kb，其中含有12 個(gè)內(nèi)含子和13 個(gè)外顯子，可編碼515 個(gè)氨基酸，正常野生型為G-6-PDB。G-6-PD 缺乏癥系由其基因變異所致，是一種伴X染色體不完全顯性遺傳?。?8］，女性純合突變及男性突變均會引起嚴(yán)重臨床表現(xiàn)，呈重度缺陷。而女性雜合突變臨床表現(xiàn)可正常，但也可能將缺陷基因遺傳給下一代，表現(xiàn)正常的女性雜合突變要用基因檢測進(jìn)行診斷［19］。目前認(rèn)為G6PD基因突變主要為單個(gè)堿基置換導(dǎo)致的錯(cuò)義突變改變編碼蛋白質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)的生物功能出現(xiàn)差異。這種改變的完成通常包括兩個(gè)機(jī)制：改變G6PD功能結(jié)構(gòu)區(qū)的功能和影響G6PD二聚體的形成。G6PD功能結(jié)構(gòu)區(qū)包括NADP+（氧化型輔酶Ⅱ）和G6P（葡萄糖-6-磷酸）結(jié)合區(qū)。突變位于氨基酸則引起的臨床癥狀較輕，而突變位于羧基端則引起的臨床表現(xiàn)較重，尤其是位于NADP+結(jié)合區(qū)或G6P 結(jié)合區(qū)時(shí)臨床表現(xiàn)最為嚴(yán)重。當(dāng)c.1376G＞T 突變或c.1388G＞A 突變時(shí)，置換位置出現(xiàn)在NADP+結(jié)合區(qū)的附近，可能影響NADP+結(jié)合區(qū)和G6P 結(jié)合區(qū)的功能，故常出現(xiàn)較為嚴(yán)重的新生兒黃疸及溶血。

G-6-PD 參與的磷酸己糖旁路代謝途徑，是唯一能產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）的來源。NADPH 是一種重要的還原物質(zhì)，存在于紅細(xì)胞中，可將氧化型谷胱甘肽經(jīng)還原反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽（glutathione，GSH），而GSH 可以使巰基的蛋白質(zhì)、酶受到保護(hù)，免受氧化劑（尤其是過氧化物）的損害，保護(hù)紅細(xì)胞膜的完整性。由于G-6-PD 基因變異所致的酶活性下降，會導(dǎo)致GSH 不足，當(dāng)機(jī)體接觸氧化物質(zhì)（如某些藥物）后，血紅蛋白氧化變性，細(xì)胞膜被損傷，發(fā)生溶血，導(dǎo)致患者出現(xiàn)黃疸。

目前針對G6PD基因突變患者的治療無根治療法，以疾病發(fā)作時(shí)對癥治療為主，嚴(yán)重者治療效果不佳，在基因水平上修復(fù)這些突變位點(diǎn)將改善這一現(xiàn)狀。目前，已經(jīng)有學(xué)者成功構(gòu)建了HEK293T穩(wěn)定細(xì)胞株，這是一種能夠敲除G6PD基因c.392G＞T 突變位點(diǎn)的細(xì)胞株，該研究成果為后期研究其基因修復(fù)奠定了基礎(chǔ)［20］。有研究證明［21］，花生四烯酸能夠抑制磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）通路，同時(shí)還能抑制G6PD突變基因的表達(dá)，其機(jī)制是通過p38 絲裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK），磷酸化胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的307 位絲氨酸。還有學(xué)者構(gòu)建動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)可以通過多不飽和脂肪酸激活剪接沉默子而減少G6PD 基因前體mRNA的表達(dá)。

綜上所述，G6PD 基因突變與新生兒黃疸有著密切的相關(guān)性。隨著對G6PD 基因突變與新生兒黃疸的關(guān)系的深入研究，可以對新生兒黃疸患者進(jìn)行基因檢測，判斷G6PD 基因突變型與新生兒膽紅素濃度關(guān)系，從而進(jìn)行黃疸動物模型建立考察藥物或基因編輯等手段對黃疸的消退作用，預(yù)測新生兒黃疸的可能性并及時(shí)對癥處理。