徐文濤， 王雪峰， 張秀英， 吳嘉龍， 常一川， 赫昊

流行性感冒(簡(jiǎn)稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、發(fā)病快、易引起流行等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在流感流行季有超過40%的學(xué)齡前兒童及30%的學(xué)齡兒童罹患流感[1]。發(fā)病后患兒多表現(xiàn)為頭痛、高熱、咳嗽、全身酸痛等癥狀，幼兒高熱多為38.5～39 ℃，甚至達(dá)到40 ℃，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致脫水、驚厥等。若不及時(shí)采取針對(duì)性治療措施還可能進(jìn)一步引發(fā)肺炎、心肌炎、腦膜炎等，對(duì)患兒的健康及生命安全造成嚴(yán)重威脅[2]。目前，常規(guī)采用西醫(yī)藥物治療病毒性流感，但由于兒童體質(zhì)和成年人有所差異，多數(shù)抗流感病毒的藥物并不適合兒童使用。且兒童個(gè)體情況差異較大，西醫(yī)藥物如使用不合理，不僅給兒童身體帶來較大副作用，而且容易反復(fù)發(fā)作。中藥在抗流感方面有其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，不良反應(yīng)相對(duì)較低、可縮短發(fā)病時(shí)間，同時(shí)不易形成耐藥性[3-4]。

臨床研究顯示膽木浸膏糖漿可以有效治療兒童流感[5]。但其確切機(jī)制尚不清晰，因此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，篩選出膽木浸膏糖漿有效活性成分和作用靶點(diǎn)，構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”、靶標(biāo)蛋白相互作用、靶點(diǎn)功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡(luò)，為膽木浸膏糖漿用于防治流感提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過文獻(xiàn)檢索獲得膽木浸膏活性成分，構(gòu)建膽木浸膏糖漿潛在活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集。

數(shù)據(jù)庫獲得活性成分潛在靶點(diǎn)。利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選Probability≥0.05的活性成分靶點(diǎn)蛋白(檢索日期：2020年7月6日)，然后將靶標(biāo)信息輸入到Uniprot(https://www.uniprot.org)中進(jìn)行注釋標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過GeneCard database(https://www.genecards.org/),數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“Influenza”，查找與流感相關(guān)的基因，去除重復(fù)和假陽性的基因，獲得流感潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 Drug-Disease靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用Venny平臺(tái)(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將藥物中活性成分靶點(diǎn)與流感靶點(diǎn)進(jìn)行映射并繪制韋恩圖，共同交集靶點(diǎn)為藥物治療流感的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 Compoud-target和Compoud-disease target網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將活性成分及共有靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)表示活性成分或靶點(diǎn)，而邊緣表示它們的交互作用。節(jié)點(diǎn)度表示網(wǎng)絡(luò)中彼此連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protein interaction networks，PPI)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING platform(https://string-db.org/)，限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為高信度[“high confidence(0.700)”]，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，在線繪制PPI，結(jié)果保存成TSV格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1中以獲取拓?fù)鋵傩苑治?。然后我們用App-CytoNCA計(jì)算6個(gè)參數(shù)評(píng)估了節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湫再|(zhì)：度中心性(degree centrality，DC)、中間中心性(betweenness centrality，BC)、緊密中心性(compactness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality，NC)和局部平均連通性(local average connectivity，LAC)。節(jié)點(diǎn)的DC、BC、CC、EC、NC和LAC值高意味著它在網(wǎng)絡(luò)中的重要性?；谏鲜鯬PI的拓?fù)湫再|(zhì)分析結(jié)果，中位數(shù)以上的目標(biāo)被選為核心目標(biāo)并進(jìn)行了兩次篩選[6]，篩選的靶點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.6 功能富集分析 利用RStudio的clusterProfiler包對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)、基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度(P<0.05，Q<0.05)，分別選取排名靠前20的生物過程，細(xì)胞成分和分子功能及KEGG通路。利用R包ggplot2對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖。GO富集分析繪制柱狀圖。KEGG通路繪制氣泡圖。

1.7 核心化合物與核心靶基因的分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇前五位的核心化合物，從PubChem數(shù)據(jù)庫下載化合物的二維結(jié)構(gòu)圖，導(dǎo)入Chem3D軟件，繪制核心化合物的三維結(jié)構(gòu)圖，優(yōu)化能量，并以mol2格式保存。然后，將這些文件導(dǎo)入到AutoDock Tools-1.5.6軟件中轉(zhuǎn)換成pdbqt格式保存。從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)[7]中下載核心靶基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Pymol軟件中去除水分子和雜分子，導(dǎo)入AutoDock Tools-1.5.6軟件中進(jìn)行氫原子的添加和充電操作，保存為pdbqt格式，并導(dǎo)入Discovery Studio 3.5客戶端軟件以搜索活動(dòng)口袋。將上述核心化合物為配體，將核心靶基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)作為受體，利用AutoDock vina 1.1.2對(duì)受體蛋白與配體小分子分別進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接獲取構(gòu)象并進(jìn)行結(jié)合能打分，取結(jié)合能最好的進(jìn)行作圖分析，并采用PyMOL作三維圖顯示受體蛋白與配體小分子之間的相互作用。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過文獻(xiàn)檢索及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫共篩選出28個(gè)活性成分，對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有544個(gè)。GeneCard database(https://www.genecards.org/)，共收集到流感相關(guān)基因2 574個(gè)。運(yùn)用Venny繪圖軟件，將活性成分潛在靶點(diǎn)和流感相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集，得到189個(gè)共用靶點(diǎn)(commom targets)。結(jié)果見圖1。

圖1 藥物與疾病韋恩圖

2.2 活性成分-靶點(diǎn)及活性成分-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包括572個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 451條邊。活性成分及靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖2(插頁1)。

圖2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共有靶點(diǎn)217個(gè)節(jié)點(diǎn)和514邊?；钚猿煞旨凹膊“悬c(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖3(插頁2)。

圖3 活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選 PPI網(wǎng)絡(luò)共含有169節(jié)點(diǎn)和1 057邊。將TSV數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，利用CytoNCA分析PPI中DC、BC、CC、EC、NC和LAC參數(shù)。第一次篩選的閾值為DC>9，BC>0.03，LAC>4.55，EC>55.50，CC>0.11，NC>5.5，結(jié)果顯示共有86個(gè)節(jié)點(diǎn)和798個(gè)邊緣。然后，進(jìn)一步篩選出18個(gè)目標(biāo)。第二次篩選閾值為DC>16，BC>0.08，LAC 8.47，EC>25.09，CC>0.53，NC>10.08。第二次篩查結(jié)果為54個(gè)節(jié)點(diǎn)和483個(gè)邊緣，核心靶基因?yàn)樘K氨酸蛋白激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶8(recombinant mitogen activated protein kinase 8，MAPK8)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)。結(jié)果見圖4(插頁2)。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

2.4 富集分析 GO富集分析得到了P<0.05的GO條目共計(jì)2 350個(gè)，其中包含生物過程條目2 123個(gè)，細(xì)胞組成條目64個(gè)，分子功能條目163個(gè)。生物過程前20的條目為肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、肽酰絲氨酸修飾、肽酰絲氨酸磷酸化、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)、肌細(xì)胞增殖、對(duì)抗生素的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、MAP激酶活性的調(diào)節(jié)、活化蛋白激酶活性、MAP激酶活性的正調(diào)控、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調(diào)控、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)，見圖5。細(xì)胞組分主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊腔、胞質(zhì)小泡腔、小窩、質(zhì)膜筏、膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)、質(zhì)膜外側(cè)、分泌顆粒腔等，前20的條目為見圖6。分子功能主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、SH2域(Src homology 2 domain)綁定、支架蛋白結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、磷蛋白結(jié)合、胰島素受體底物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活子結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性、血紅素結(jié)合、MAP激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、四吡咯結(jié)合、T蛋白結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、激素受體結(jié)合、蛋白質(zhì)磷酸化氨基酸結(jié)合等，前20的條目見圖7。KEGG通路分析得到了P<0.05的通路159條，排在前20位的主要為乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、PD-L1在腫瘤中的表達(dá)與PD-1檢查點(diǎn)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、胰腺癌、細(xì)胞凋亡、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、內(nèi)分泌抵抗、EB病毒感染、恰加斯病、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、胰島素抵抗、ErbB信號(hào)通路、前列腺癌、弓形蟲病、破骨細(xì)胞分化，見圖8。

圖5 生物過程分析

圖6 細(xì)胞組成分析

圖7 分子功能分析

圖8 KEGG通路分析

2.5 核心活性化合物作用于流感病毒A神經(jīng)氨酸酶的分子對(duì)接結(jié)果 一般認(rèn)為結(jié)合能小于0說明化合物與蛋白可以自發(fā)結(jié)合，化合物與蛋白結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。分子對(duì)接結(jié)果顯示，將在藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值前5位的核心活性化合物3,14-二氫狹花馬錢堿、牛眼馬錢托林堿、烏檀酰胺B、naucleamide E、烏檀醛堿與神經(jīng)氨酸酶(PDB ID：6hfc)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表1(封三)。

表1 活性成分與流感神經(jīng)氨酸酶分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

膽木浸膏糖漿由膽木組成，膽木又名山熊膽、熊膽樹、烏檀，是我國原產(chǎn)唯一的茜草科烏檀屬植物，主要分布于海南、廣東、廣西等地[8]。研究顯示，膽木中的化學(xué)成分主要包括生物堿類、酚酸類、五環(huán)三萜及其皂苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮和倍半萜等[9-11]。《黎族醫(yī)藥》一書記載其莖皮均能入藥，在海南黎族人作為民間常用草藥用于治療感冒、發(fā)熱等呼吸系統(tǒng)疾病[12]。臨床研究顯示，膽木浸膏糖漿治療小兒流感療效顯著，但其機(jī)制尚不清晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過篩選藥物活性物質(zhì)、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)、構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)、富集信號(hào)通路并進(jìn)行分析，進(jìn)而揭示藥物活性成分和疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)之間的潛在機(jī)制。分子對(duì)接是一種運(yùn)用計(jì)算機(jī)技術(shù)基于受體特性以及受體與藥物分子之間相互作用方式的藥物設(shè)計(jì)方法。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)初步揭示了膽木浸膏糖漿治療流感的分子機(jī)制。

研究結(jié)果現(xiàn)實(shí)，共檢索到有效活性成分28個(gè)，對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)544個(gè)，疾病靶點(diǎn)2 574個(gè)，交集靶點(diǎn)189?；钚猿煞?疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，平均每個(gè)活性成分作用6個(gè)靶點(diǎn)，其中烏檀酰胺B、3,14-二氫狹花馬錢堿、naucleamide E、牛眼馬錢托林堿、烏檀醛堿，分別作用41、40、38、38、34，推測(cè)烏檀酰胺B、3,14-二氫狹花馬錢堿、naucleamide E、牛眼馬錢托林堿、烏檀醛堿可能為膽木浸膏糖漿治療流感的主要藥效成分。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示共含有169節(jié)點(diǎn)和1 057邊。經(jīng)過2次篩選獲得54個(gè)節(jié)點(diǎn)和483個(gè)邊，度值前5位的靶點(diǎn)AKT1、STAT3、MAPK8、EGFR等。研究顯示流感病毒感染可以激活細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)通路，加快流感病毒的增殖[13]。STAT3是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，為介導(dǎo)干擾素應(yīng)答的重要效應(yīng)分子，與病毒感染密切相關(guān)。MAPK8基因則是腫瘤壞死因子α作用途徑中的重要信號(hào)分子,不但可作為細(xì)胞凋亡機(jī)制中的重要基因,通過誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C而啟動(dòng)死亡信號(hào)途徑和細(xì)胞凋亡[14]。肺泡上皮細(xì)胞是流感病毒進(jìn)入肺泡后首先遇到的細(xì)胞。感染的上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，吸引和激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致上皮內(nèi)皮屏障受損，流感病毒感染時(shí)EGFR可增強(qiáng)人肺泡上皮細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答。因此，推測(cè)膽木浸膏糖漿主要通過作用于AKT1、STAT3、MAPK8、EGFR等靶點(diǎn)發(fā)揮抗流感的作用。

GO富集分析結(jié)果顯示核心基因參與的生物過程主要有肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、肽酰絲氨酸修飾、肽酰絲氨酸磷酸化、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)等；涉及的細(xì)胞組分主要有膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊腔、胞質(zhì)小泡腔、小窩、質(zhì)膜筏、膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)、質(zhì)膜外側(cè)、分泌顆粒腔；分子功能主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、SH2域綁定、支架蛋白結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、磷蛋白結(jié)合、胰島素受體底物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活子結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性、血紅素結(jié)合、促分裂素原活化蛋白激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、T蛋白結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG通路分析結(jié)果顯示主要通路包括細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化通路、ErbB信號(hào)通路等凋亡、炎癥及免疫調(diào)控通路。研究顯示，在甲型流感病毒感染呼吸道的過程中，肺組織可發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而出現(xiàn)肺損傷[15-17]分子對(duì)接的研究結(jié)果顯示，膽木浸膏糖漿中主要藥效成分與流感病毒神經(jīng)氨酸酶具有較好的結(jié)合力?；谏鲜龅慕Y(jié)果推測(cè)膽木浸膏糖漿一方面可通過與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合發(fā)揮抗流感病毒的作用，另一方面通過作用于細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化通路、ErbB信號(hào)通路等發(fā)揮免疫調(diào)控及抗炎作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的方法對(duì)膽木浸膏糖漿防治流感的中潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行分析，探討了膽木浸膏糖漿通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來發(fā)揮抗流感的治療作用，為深入研究膽木浸膏糖漿防治流感的藥理機(jī)制提供新的思路。但鑒于數(shù)據(jù)庫和軟件的參數(shù)設(shè)置的局限性，因此對(duì)于膽木浸膏糖漿治療流感的有效性及確切機(jī)制，還需進(jìn)一步通過臨床試驗(yàn)和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。