朱萬青， 李偉偉， 李娟

0～14歲兒童呼吸系統(tǒng)疾病占兒科門診就診總數(shù)的1/4[1]。近十年來，兒童支氣管-肺系統(tǒng)病變的發(fā)病率增加了3.6倍，主要是以上、下呼吸道的急性和復(fù)發(fā)性炎癥性疾病為主[2-3]。急性支氣管炎的發(fā)病率也隨著增高，這使兒童門診治療變得非常復(fù)雜[4-6]。許多患者需要住院治療，對(duì)孩子和父母都造成壓力[7-9]。支氣管炎癥不受控制且反復(fù)發(fā)作的急性支氣管炎最終會(huì)導(dǎo)致肺功能下降，進(jìn)而可能導(dǎo)致哮喘的發(fā)生[2,10-12]。治療上多以抗感染、化痰藥及支氣管擴(kuò)張類藥物為主，但疾病易反復(fù)發(fā)作，其臨床療效往往不理想。小兒由于“臟腑嬌嫩，形氣未充”的生理特點(diǎn)決定了小兒肺氣常常不足，故而臨床上治療小兒支氣管炎往往采用清補(bǔ)肺氣的治療原則，且療效顯著。

清宣止咳顆粒是根據(jù)張珍玉教授多年臨床觀察研究而研發(fā)的中成藥，該方是由桑葉、陳皮、白芍、杏仁、紫菀、枳殼、薄荷、甘草、桔梗組成。既往研究表明，清宣止咳顆粒通過減少咳嗽模型大鼠血清中炎癥因子含量，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，抑制氣道中炎癥因子的產(chǎn)生，從而可以改善咳嗽的癥狀[13]；清宣止咳顆?？梢杂行p少咳嗽型小鼠模型肺部充血、炎細(xì)胞浸潤等病變的發(fā)生，進(jìn)而緩解咳嗽、咳痰的癥狀[14]。在臨床診療的過程中發(fā)現(xiàn)，使用清宣止咳顆粒聯(lián)合治療小兒急性支氣管炎，可有效的縮短其病程，明顯改善患兒咳嗽、咳痰癥狀，臨床療效滿意[15]。

圖1 小兒支氣管炎差異表達(dá)基因的熱圖

近年來，微陣列技術(shù)越來越多地用于生命科學(xué)研究，中藥成分與疾病的關(guān)聯(lián)性、基因的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘已廣泛用于差異表達(dá)分析。本研究通過運(yùn)用生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，從分子診斷到分子分類，多層次分析清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的可能潛在機(jī)制。

1 藥物活性成分篩選法

清宣止咳顆?；钚猿煞趾蜐撛诎悬c(diǎn)分別以桑葉、陳皮、白芍、杏仁、紫菀、枳殼、薄荷、甘草、桔梗為關(guān)鍵詞，以類藥性指數(shù)≥0.18[16]以及口服生物利用度≥30%[17]作為篩選條件，對(duì)應(yīng)的藥效成分信息在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫中采集。此外，在數(shù)據(jù)庫Ingredients中獲得篩選得到的清宣止咳顆粒藥物有效化學(xué)活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，并進(jìn)一步在Related Targets中獲得蛋白靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)，再通過Perl軟件篩選出無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)成分，將重復(fù)靶點(diǎn)排除。

2 疾病核心靶點(diǎn)篩選

2.1 微陣列芯片下載 以“Syncytial Virus Genotypes”為關(guān)鍵詞在NCBI GEO數(shù)據(jù)庫搜索微陣列數(shù)據(jù)集，本研究下載了GSE103842數(shù)據(jù)集，本數(shù)據(jù)集描述了5個(gè)非連續(xù)呼吸季節(jié)中呼吸道合胞病毒菌株的遺傳變異性，并評(píng)估了呼吸道合胞病毒亞型、基因型和病毒量對(duì)臨床疾病嚴(yán)重程度的作用。

2.2 數(shù)據(jù)處理和差異表達(dá)基因分析 使用Perl軟件將GSE103842數(shù)據(jù)集由探針的名稱轉(zhuǎn)化為基因名，例如，當(dāng)多個(gè)探針名稱與同一基因名相對(duì)應(yīng)時(shí)，取該基因表達(dá)值的平均值；使用VennDiagram包對(duì)GSE103842數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合，刪除重復(fù)的、無效的基因名稱，篩選出小兒支氣管炎的靶標(biāo)基因。我們?cè)龠\(yùn)用R軟件LIMMA包對(duì)篩選出來的小兒支氣管炎基因表達(dá)矩陣進(jìn)行歸一化處理，獲取小兒支氣管炎基因的表達(dá)值，再以adjustedP<0.05和|log2 FC(fold change)|≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出數(shù)據(jù)集中小兒支氣管炎的疾病基因。

2.3 繪制韋恩圖，獲取共有靶點(diǎn) 使用R軟件中VennDiagram包繪制韋恩圖，篩選出清宣止咳顆粒藥物靶點(diǎn)預(yù)測和小兒支氣管炎的疾病基因集的共有靶點(diǎn)。

2.4 差異表達(dá)基因(differential expressed gene，DEG)的功能富集分析 基因本體(gene ontology，GO)提供了一個(gè)框架來描述所有生物體中基因產(chǎn)物的功能，并識(shí)別高通量基因組的特征生物學(xué)特性或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]。GO注釋分為三個(gè)部分：生物過程、細(xì)胞構(gòu)成和分子功能。基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)向具有高階功能信息的關(guān)鍵數(shù)據(jù)分配DEG集的特定路徑，可用于功能解釋和基因組信息的實(shí)際應(yīng)用[19]。利用基因功能分析的注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov)。David提供的分析模塊將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為加快分析基因組級(jí)數(shù)據(jù)集合的生物學(xué)意義[20]。為了揭示篩選的DEG在小兒支氣管炎進(jìn)展中的生物學(xué)意義，我們使用DAVID對(duì)來自Venn包的DEG進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protein interaction networks，PPI)分析，篩選核心靶點(diǎn) 蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)于理解腫瘤的代謝和分子機(jī)制至關(guān)重要。新版String 10.0數(shù)據(jù)庫覆蓋了2 000多種生物，幾乎是之前版本的兩倍[21]。以通過使用String 10.0數(shù)據(jù)平臺(tái)分析DEG PPI圖譜。在Cytoscape中導(dǎo)入分析的結(jié)果中導(dǎo)入插件使用Cytohubba已經(jīng)下載安裝。以最大團(tuán)中心性(maximal clique centrality，MCC)算法的前十名作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中具有高連通性的Hub基因。

3 分子對(duì)接

“中藥-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖中度數(shù)最高的11種活性成分與KEGG核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。化合物的結(jié)構(gòu)來自PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來自PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)。應(yīng)用MOE(molecule operating environment)軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)接，將受體蛋白設(shè)置為半柔性對(duì)接，選擇LondondG算法，其余設(shè)置默認(rèn)參數(shù)。并使用MOE軟件對(duì)分子對(duì)接分析的結(jié)果進(jìn)行可視化，以獲得2D和3D圖像。

4 結(jié)果

4.1 清宣止咳顆粒組成和目標(biāo)篩選結(jié)果 經(jīng)篩選，目前共搜集到清宣止咳顆粒有效藥物活性成分81個(gè),其中桑葉9個(gè)、薄荷1個(gè)、桔梗1個(gè)、紫菀1個(gè)、白芍1個(gè)、陳皮1個(gè)、甘草56個(gè)，多種藥物共有活性成分11個(gè)。將TCMSP數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的蛋白靶點(diǎn)輸入到uniport數(shù)據(jù)庫中，共獲得基因靶點(diǎn)266個(gè)，相應(yīng)的藥物靶點(diǎn)25個(gè)。

4.2 微陣列芯片下載及獲取疾病基因集 通過GEO數(shù)據(jù)庫以檢索式搜索到有關(guān)小兒支氣管炎的數(shù)據(jù)集GSE103842數(shù)據(jù)集總共收集了小兒支氣管炎患者和健康對(duì)照者的全血樣本，全血表達(dá)的基因使用微陣列進(jìn)行檢測。本研究對(duì)GSE10384數(shù)據(jù)集進(jìn)行校正和歸一化后，獲取小兒支氣管炎的基因集，基因集中共有1 732個(gè)基因，見圖1(插頁1)。并保存為“disease.txt”文本文件。

4.3 獲取藥物和疾病的共有靶標(biāo)結(jié)果 采用EXCEL表將清宣止咳顆粒中發(fā)現(xiàn)的目標(biāo)與小兒支氣管炎進(jìn)行合并以明確清宣止咳顆粒與小兒支氣管炎的關(guān)系，最終得到24個(gè)交叉目標(biāo)，見圖2，然后構(gòu)建韋恩圖來可視化數(shù)據(jù)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)。

圖2 清宣止咳顆粒藥物靶點(diǎn)與小兒支氣管炎相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)韋恩圖

4.4 構(gòu)建“中藥-有效成分-靶向基因”網(wǎng)絡(luò) 利用EXCEL整合中藥靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交叉點(diǎn)，得到24個(gè)靶基因，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2構(gòu)建中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。由此得到106個(gè)節(jié)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)812個(gè)交互關(guān)系?！爸兴?有效成分-靶基因”網(wǎng)絡(luò)見圖3，根據(jù)靶點(diǎn)蛋白與藥物的關(guān)系構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-化學(xué)成分”分析發(fā)現(xiàn)，涉及到的疾病靶點(diǎn)根據(jù)度值選擇前十的基因包括蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)、醛酮還原酶家族1成員B1(aldo-keto reductase family 1 member B1，AKR1B1)、CD163細(xì)胞(cluster of differentiation 163，CD163)、螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)擴(kuò)散激酶(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase,CHUK)、絲裂原活化蛋白激酶14(recombinant mitogen activated protein kinase 14，MAPK14)、花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)。為了能夠更加直觀地探析清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的作用機(jī)制，本研究還對(duì)“藥物-成分-疾病靶點(diǎn)”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，經(jīng)分析可知清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的關(guān)鍵化學(xué)成分為豆甾醇、槲皮素、刺槐素、山奈酚、菜豆素、甘草黃酮、甘草查爾酮乙、異鼠李素、木犀草素、柚皮素，見圖3。

4.5 富集過程分析結(jié)果 富集分析結(jié)果顯示在GO功能富集中，生物過程中，主要參與肽的反應(yīng)、脂質(zhì)定位的調(diào)節(jié)、脂蛋白顆粒的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂蛋白顆粒刺激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在細(xì)胞構(gòu)成中主要富集于管腔分泌顆粒、囊腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等，主要與核受體活性結(jié)合，配位體在分子功能中活化轉(zhuǎn)錄因子活性結(jié)合，RNA聚合酶Ⅱ在DNA中特異結(jié)合。蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關(guān)，脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關(guān)見圖4。此外，在KEGG通路富集結(jié)果中，小兒支氣管炎可能與Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis、Acute myeloid leukemia、Adipocytokine signaling pathway信號(hào)通路等密切相關(guān)，見圖5。

圖3 清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

X軸代表被GO富集的基因的數(shù)目，Y軸代表GO功能。漸變色表示矯正后的P值。P<0.05作為顯著富集的閾值

X軸代表被KEGG富集的基因的數(shù)目，Y軸代表KEGG功能。漸變色表示矯正后的P值。P<0.05作為顯著富集的閾值

4.6 核心基因篩選 將清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線PPI分析，交互閾值設(shè)置為“0.4”以隱藏附加型基因目標(biāo)。圖中的“邊”代表交叉基因之間的關(guān)聯(lián)程度，表示關(guān)聯(lián)程度。因此，關(guān)聯(lián)越大，節(jié)點(diǎn)代表交叉基因的機(jī)會(huì)就越大。結(jié)果如圖6所示：度值最高的前30個(gè)靶點(diǎn)繪制成核心基因柱狀圖，涉及到的疾病靶點(diǎn)前十的包括AKT1、PPARG、STAT3、ABCA1、AHR、AKR1B1、CD163、CHUK、MAPK14、ALOX5。

4.7 核心作用靶點(diǎn)篩選進(jìn)行分子對(duì)接 小兒支氣管炎的發(fā)病機(jī)制可能與Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis、Acute myeloid leukemia、Adipocytokine signaling pathway信號(hào)通路等免疫炎癥相關(guān),根據(jù)KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果，如表1。

圖6 清宣止咳顆粒藥物靶點(diǎn)與小兒支氣管炎疾病蛋白質(zhì)相互作用圖

表1 核心靶點(diǎn)基因通路富集表

分別選取Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的選取的3條信號(hào)通路制作韋恩圖，如圖7所示，選取3條通路的共同的作用靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶蛋白,MAPK14、STAT3、CHUK為3條通路的共同的作用靶點(diǎn),并與清宣止咳顆粒藥物成分豆甾醇、槲皮素、刺槐素、山奈酚、菜豆素、甘草黃酮、甘草查爾酮乙、異鼠李素、木犀草素、柚皮素進(jìn)行分子對(duì)接。

4.8 分子對(duì)接結(jié)果 用MOE中的Dock模塊進(jìn)行分子對(duì)接，選擇基于蛋白和配體間相互作用能的打分函數(shù)ASE，分別得到每個(gè)化合物與受體的對(duì)接打分，打分越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，結(jié)果見表2，總體來說，疾病核心靶點(diǎn)與化合物結(jié)合相對(duì)穩(wěn)定，其中S值小于-7.0的有CHUK與Acacetin；STAT3與Acacetin；MAPK14與isorhamnetin。主要活性成分和核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合情況與預(yù)測關(guān)系相符?，F(xiàn)將結(jié)合能小于-7對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示，見圖8。

表2 核心靶點(diǎn)與藥物共同化學(xué)成分結(jié)合對(duì)接分?jǐn)?shù)表能(kJ/mol)

圖7 Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis韋恩圖

3 討論

急性支氣管炎是由生物、物理、化學(xué)刺激或過敏、感染等因素引起的氣管支氣管黏膜的急性炎癥[22]，故治療多以對(duì)癥治療為主。但對(duì)于反復(fù)發(fā)作，體質(zhì)較弱的嬰幼兒，中醫(yī)藥治療療效顯著。急性支氣管炎屬于中醫(yī)“咳嗽”的范疇，小兒咳嗽常急性起病，由于小兒肌膚薄嫩、易感外邪，病情易反復(fù)。清宣止咳顆粒是由張珍玉教授在民間驗(yàn)方的基礎(chǔ)上研制而成的純中藥制劑，方中桑葉甘苦性涼，薄荷辛涼，疏風(fēng)散熱共為君藥；杏仁、枳殼苦降，桔梗辛散，祛咳止痰共為臣藥；紫菀味苦溫而不熱，白芍味酸斂陰，陳皮苦溫行滯化痰共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥為使藥。全方藥性溫和，不寒不熱，藥物組成以清宣為主，不傷及肺脾，對(duì)小兒常見的發(fā)熱、咳嗽、咽痛咽癢、鼻塞流涕均有較好療效。研究表明，清宣止咳顆粒具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎的藥理作用[23]。然而清宣

圖8 分子對(duì)接模式圖

止咳顆粒能夠發(fā)揮治療作用的具體細(xì)胞分子作用機(jī)制仍不明確。故本研究使用生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法研究清宣止咳顆粒和小兒支氣管炎的蛋白基因、有效化學(xué)成分和相關(guān)的生物過程，以探索清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的潛在機(jī)制。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析可知，AKT1、PPARG、STAT3、ABCA1、AHR、AKR1B1、CD163、CHUK、MAPK14、ALOX5這10種基因靶點(diǎn)超過所有度值的2倍中位數(shù)，這些基因靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，提示清宣止咳顆?；钚猿煞峙c這些疾病靶點(diǎn)具有較高的結(jié)合活性。STAT3作用于哮喘越來越受到人們的關(guān)注，它參與了信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活蛋白的研究工作。STAT3能通過介導(dǎo)白細(xì)胞介素-6的免疫反應(yīng)來調(diào)控Th17細(xì)胞的分化。它可以作為轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)炎性基因的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼，使蛋白質(zhì)釋放出來，從而使炎性反應(yīng)擴(kuò)增。這是炎癥基因表達(dá)在哮喘發(fā)病機(jī)制中的基礎(chǔ)[24-25]。

前列腺素內(nèi)過氧化物合酶MAPK又叫做環(huán)氧合酶，它是抗炎藥物的重要靶點(diǎn)，能減少炎癥因子的產(chǎn)生從而起到抗炎、解熱作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)，MAPK14能夠參與到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的過程中來[27]。在CHUK基因編碼的復(fù)合物抑制蛋白激酶-α(IκB kinase-α，IKKα)，是核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路的一種必要調(diào)節(jié)器，而NF-κB信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)是支氣管炎過程中的一個(gè)重要的炎癥介質(zhì)[28]。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎涉及的生物過程主要參與肽的反應(yīng)、脂質(zhì)定位的調(diào)節(jié)、脂蛋白顆粒的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂蛋白顆粒刺激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在細(xì)胞構(gòu)成中主要富集于管腔分泌顆粒、囊腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等，主要與核受體活性結(jié)合，配位體在分子功能中活化轉(zhuǎn)錄因子活性結(jié)合，RNA聚合酶Ⅱ在DNA中特異結(jié)合。蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關(guān)，脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(deoxylnuclesacid)與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關(guān)。

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，小兒支氣管炎涉及的清宣止咳顆粒治療信號(hào)通路主要與Th17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)信號(hào)通路即(AGE-RAGE)信號(hào)通路有關(guān)。

由于Th1/Th2不平衡導(dǎo)致的炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)不平衡在很多疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著舉足輕重的作用[29]。經(jīng)過Th17細(xì)胞的繼鑒定，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子的不均衡已成為各種自身免疫性疾病及其他疾病的理論基礎(chǔ)。Th17和Treg細(xì)胞是Th1和Th2免疫平衡的一個(gè)重要補(bǔ)充。Th1/Th2的不平衡與其本身免疫疾病有著密切的關(guān)系[30-31]。

Th17主要是通過白細(xì)胞介素-22、白細(xì)胞介素-17等細(xì)胞因子的分泌，對(duì)防御細(xì)胞外細(xì)菌感染、介導(dǎo)本身免疫性病癥具有重要意義。其中，分子最多的是白細(xì)胞介素-17。該系統(tǒng)由誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的局部浸潤，例如白細(xì)胞介素-22，導(dǎo)致組織破壞。在機(jī)體免疫系統(tǒng)中，Treg細(xì)胞是負(fù)調(diào)節(jié)的。他們不但對(duì)不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)起到抑制作用，而且在免疫反應(yīng)的范圍、反應(yīng)程度和持續(xù)的免疫反應(yīng)方面也扮演著重要角色，白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-23和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)激活STAT3可誘導(dǎo)Th17分化和白細(xì)胞介素-17細(xì)胞因子產(chǎn)生。此外，STAT3還與維甲酸相關(guān)孤核受體γt(retinoid-related orphan receptor gamma t，RoRγt)協(xié)同對(duì)Th17細(xì)胞及其功能進(jìn)行了穩(wěn)定[32-33]。激活STAT3是白細(xì)胞介素-6調(diào)節(jié)Th17分化所必需的，通過提高RoRγt和RoRα的表達(dá)，STAT3能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞亞群的分化。并在其增殖過程中起著重要的作用，表達(dá)細(xì)胞因子。

MAPK14、STAT3、CHUK是根據(jù)KEGG富集分析出的與AGE-RAGE、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的靶點(diǎn)。AGE-RAGE信號(hào)通路參與了支氣管上皮細(xì)胞TGF-1和NF-2分泌的尼古丁調(diào)控[34]。對(duì)支氣管炎發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行調(diào)控；在調(diào)節(jié)炎癥的過程中，NF-κB是一個(gè)關(guān)鍵的因素。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在全身性炎癥中進(jìn)行了研究，并已在支氣管患者中發(fā)現(xiàn)。在滅活狀態(tài)下，NF-κB位于胞質(zhì)溶膠中并與抑制蛋白kappa B(inhibitor of NF-κB，IκB)復(fù)合。IκB β僅被某些刺激物磷酸化，包括脂多糖和白細(xì)胞介素-1β，而IκB α磷酸化由大多數(shù)NF-κB激活劑觸發(fā)。在呼吸道上皮受多種細(xì)胞外刺激作用的受體時(shí)，即激活I(lǐng)κB激酶(IκB kinase，IKK)[35]。因此，NF-κB通路產(chǎn)生的細(xì)胞因子在炎癥細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用，并在小兒支氣管炎發(fā)展過程中加強(qiáng)氧化應(yīng)激，進(jìn)一步加重病情。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，清宣止咳顆粒中的活性成分槲皮素、刺槐素、異鼠李素、山奈酚與蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的結(jié)合性。槲皮素具有抗炎、抗氧化作用，既往研究證實(shí)，槲皮素則可通過減少氧化應(yīng)激、調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)和MMP-12的表達(dá)來防止呼吸道炎癥的進(jìn)展。槲皮素還可通過多種途徑來抑制肺炎鏈球菌的感染[36]。劉萍等[37]研究表明槲皮素能保護(hù)支氣管上皮細(xì)胞的作用機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。有研究表明山奈酚對(duì)銅綠假單胞菌、幽門螺旋桿菌等致病菌有較好的治療作用，同時(shí)對(duì)登革熱病毒及腦炎病毒有抑制作用，這與它能刺激NF-κB信號(hào)通路，增加白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子的表達(dá)下調(diào)白細(xì)胞介素-6有關(guān)[38-41]。研究還顯示異鼠李素對(duì)金黃色葡萄球菌及鏈球菌有顯著的抑制作用[42]。刺槐素是一種天然黃酮類化合物,研究表明，刺槐素可通過抑制Srt A活性,降低金黃色葡萄球菌毒力，提高金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率,降低金黃色葡萄球菌感染小鼠腎膿腫模型中腎臟膿腫程度[43]。

綜上所述，清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎主要的活性成分為槲皮素、異鼠李素、刺槐素、山奈酚等，通過調(diào)控Th17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等炎癥信號(hào)通路，作用于MAPK14、STAT3、CHUK靶點(diǎn)，從而起到抗炎、保護(hù)支氣管平滑肌的作用，改善支氣管炎的臨床癥狀。

4 結(jié)論

總之，本研究證明了基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法治療小兒支氣管炎的潛在清宣止咳顆粒效應(yīng)機(jī)制。我們揭示了槲皮素、刺槐素、異鼠李素和山奈酚通過影響STAT3、MAPK14、CHUK等因子在小兒支氣管炎中起關(guān)鍵作用。此外，我們的分子對(duì)接研究還表明，清宣止咳顆粒的主要活性成分(槲皮素、刺槐素、異鼠李素、山奈酚)可以與STAT3、MAPK14、CHUK很好地對(duì)接，為進(jìn)一步研究提供了重要依據(jù)。然而，這項(xiàng)研究也有一定的局限性，因?yàn)樗幚韺W(xué)和臨床研究仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)。