盧 鈺 ，保超宇 ，李具寶 ，尹本敬 ，劉 暢 ，邱榮能 ，潘斯學(xué) ，何光雄 ，向俊宜 △

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；3.云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650032）

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的膝關(guān)節(jié)退變性疾病，病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)軟骨的退變和磨損、滑膜等關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)的疼痛、變形及功能障礙[1-2]。隨著我國老齡化社會的到來，其發(fā)病率逐年上升，需要手術(shù)的患者也越來越多，給社會帶來巨大的負擔(dān)[3-5]。中醫(yī)藥在治療KOA方面具有獨特的優(yōu)勢，且治療方法多樣[6-7]。通過中藥外敷內(nèi)服、針灸、藥物注射、功能鍛煉、減輕體重等措施對KOA患者進行保守治療，對減輕患者臨床癥狀、降低手術(shù)率具有重要意義[8]。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在KOA治療方面具有悠久的歷史和良好的療效，其中本院的骨痹合劑在多年的KOA臨床使用中獲得了滿意的療效[9-10]，但是其作用機制尚不明確。骨痹合劑含有多種中藥成分，其中的活性物質(zhì)更是種類繁多。骨痹合劑具有補肝腎、強筋骨、祛風(fēng)勝濕、散寒止痛、通筋活絡(luò)等多種功效，其中獨活-羌活-細辛藥物組合在骨痹合劑中起著祛風(fēng)勝濕、散寒止痛的作用。據(jù)文獻報道，獨活、羌活、細辛均顯示抗炎鎮(zhèn)痛的作用，其中，細辛可通過抑制炎癥介質(zhì)釋放、降低毛細血管通透性等環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎作用[11]，獨活、羌活也顯示抗炎鎮(zhèn)痛的作用[12]。獨活、羌活、細辛常被用于治療KOA，在多個方劑中均有使用，但這3味中藥及其合用后對于KOA的治療機制目前尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)、數(shù)據(jù)庫等多學(xué)科技術(shù)，通過高通量成分篩選、分子交換驗證、結(jié)合網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)，分析藥物與疾病之間互作關(guān)系的新興學(xué)科，可以闡明藥物的作用機制，預(yù)測其作用靶點、通路，還可用于方劑的驗證、新藥的研發(fā)設(shè)計[13-14]。該技術(shù)將“藥物-靶點-疾病”之間的線性關(guān)系更替為“藥物-多個活性成分-多個靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其具有的系統(tǒng)性和整體性與中醫(yī)藥的多種藥物、多種有效成分完美匹配，為中醫(yī)藥的研究提供了更科學(xué)、更全面的新方法。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，通過多個數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)收集、特定軟件進行數(shù)據(jù)分析，系統(tǒng)、全面地分析骨痹合劑中重要成分獨活-羌活-細辛在治療KOA中的作用機制，篩選和預(yù)測其中的關(guān)鍵靶點和通路，以明確骨痹合劑治療KOA的部分作用。

1 資料與方法

1.1 成分靶點信息查詢 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺 TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索并獲得羌活、獨活、細辛的活性成分和靶點，所有成分的篩選條件設(shè)置為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18。

1.2 疾病靶點查找 以“knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，在 GeneCards（https：//www.genecards.org/），NCBI基因數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及 CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）進行人類基因檢索，找出KOA已知的相關(guān)靶基因。

1.3 篩選共同靶點并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 將篩選出的藥物靶點與疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到92個共有靶點，作為藥物作用于疾病的預(yù)測靶點進行進一步的通路富集分析。將藥物疾病共有靶點輸入 String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）進行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，得到 PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)合并 為了更好地理解中藥、成分、疾病以及相應(yīng)靶點之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系，以對應(yīng)的中藥、成分、治療疾病以及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建了成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中進行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，并同時繪制中藥-成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，以便更直觀地展示中藥活性成分在治療KOA過程中的多成分、多靶點的作用特點。

1.5 拓撲分析 將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，以degree、betweenness centrality、average shortest path length和closeness centrality這四個參數(shù)為參考標準，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點。

1.6 MCODE聚類分析 本研究通過MCODE分析進行關(guān)鍵基因的篩選。將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中，打開MCODE模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。具體結(jié)果見聚類分析文件夾。

1.7 關(guān)鍵成分篩選 將成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中進行拓撲分析。將成分進行degree排序，選取大于平均度值的成分作為關(guān)鍵活性成分。

1.8 GO富集分析和KEGG通路富集 將藥物疾病共有靶點進行GO的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cell component，CC）富集，引用 String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，將富集的結(jié)果導(dǎo)入R 3.6.3軟件，安裝并引用clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。

將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進行篩選，將富集的結(jié)果導(dǎo)入R 3.6.3軟件，安裝并引用clusterProfiler包后，進行柱狀圖和氣泡圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 活性成分 羌活獲得17個有效成分，52個靶點；獨活獲得11個有效成分，49個靶點；細辛獲得8個有效成分，104個靶點。

2.2 疾病靶點篩選 經(jīng)檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到2 040條相關(guān)基因，NCBI數(shù)據(jù)庫獲得148個基因，CTD數(shù)據(jù)庫獲得4 594個靶點。將這3個數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重之后，得到5 768個KOA相關(guān)基因。

2.3 韋恩圖及PPI網(wǎng)絡(luò) 繪制出的韋恩圖顯示，藥物、疾病共同靶點92個，見圖1。得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有92個節(jié)點，738條邊，平均度值為16。圖2為string網(wǎng)站導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，圖3為Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。圖3中的節(jié)點顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整，節(jié)點越大、顏色越深，則度值越大，線從粗到細表示edge betweenness從大到小。

圖1 韋恩圖

圖2 String網(wǎng)站導(dǎo)出的蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 Cytoscape軟件繪制的蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 網(wǎng)絡(luò)合并 以納入的對應(yīng)的中藥、成分、治療疾病以及作用靶點為基礎(chǔ)，通過Cytoscape 3.8.0進行網(wǎng)絡(luò)繪制，以便進一步地理解中藥-成分-疾病-通路-靶點之間的關(guān)系，分別得到中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)（圖4）和中藥-成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)（圖5）。

圖4 中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 中藥-成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 拓撲分析和MCODE聚類分析 根據(jù)得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，進行進一步分析。通過拓撲分析，總共篩選出36個關(guān)鍵靶點，將前20個靶點使用R 3.6.3進行圖片繪制，橫坐標為每個靶點的度值（圖6）。通過聚類分析總共得到5個基因簇和4個核心基因，核心基因為 NOS3，ESR1，ACOX1 和 NR1I2（表1）。

表1 MCODE聚類分析得到的核心基因簇

圖6 拓撲分析得出的關(guān)鍵靶點

2.6 關(guān)鍵成分篩選 通過將成分進行degree排序，得到8個關(guān)鍵成分（表2）。

表2 關(guān)鍵成分信息表

2.7 GO富集分析和KEGG通路富集 GO富集總共富集到1 254條生物過程，129項分子功能相關(guān)，59項細胞組成相關(guān)，將其繪制成柱狀圖（圖7）和氣泡圖（圖 ）。

圖7 GO富集柱狀圖

圖8 GO富集氣泡圖

KEGG富集總共富集到126條信號通路，繪制柱狀圖（圖9）和氣泡圖（圖10）。

圖9 KEGG富集柱狀圖

圖10 KEGG富集氣泡圖

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”的范疇，由于年老體虛、正氣不足、反復(fù)勞損，致肝腎精血虧損，加之復(fù)感風(fēng)寒濕外邪，痹阻經(jīng)絡(luò)日久，氣血運行不暢所致[15]。獨活-羌活-細辛藥物組合的應(yīng)用已有千年歷史，常用于治療膝骨關(guān)節(jié)炎，具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛之功效[16]。目前獨活中的部分化合物已有相關(guān)KOA的研究報道，其中，二氫歐芹素具有較強的鎮(zhèn)痛和抗炎活性[17]，二氫歐芹醇能通過抑制NF-κB等途徑來抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、組胺等物質(zhì)的釋放來達到抗炎、鎮(zhèn)痛作用[18]，香柑內(nèi)酯能提高堿性磷酸酶的活性，促進I型膠原合成[19]；細辛、羌活也同樣具有類似的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[20-21]。其中，細辛中的有效成分——槲皮素能有效抑制關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、TNF-α的水平[22]，進一步研究還發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過抑制p38MAPK通路相關(guān)因子表達而降低骨關(guān)節(jié)炎中的炎性因子表達，保護關(guān)節(jié)軟骨[23]。而羌活中的4-methyl-3-trans-hexenylferulate、（－）-bornylferulate、4-methoxyphenethylferulate、phenethyl-ferulate能顯著抑制NO分泌[24]，此外羌活中部分多炔類成分也表現(xiàn)出顯著抑制NO分泌的作用[25]。因此，羌活具有抗炎能力，被廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的治療中。但是由于中藥成分復(fù)雜，作用于多個靶點、影響多個生物信號通路，并且不同藥物之間還存在相互作用，所以目前的研究依然存在一定的局限性，并不能完全闡明中藥治療疾病的作用機制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用日益健全的多個網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，建立“中藥-成分-靶點”與“疾病-基因-靶點”兩個網(wǎng)絡(luò)，通過相同靶點將兩個網(wǎng)絡(luò)進行映射、關(guān)聯(lián)，從而找出疾病與藥物成分之間的共同靶點，達到預(yù)測中藥治療疾病機制的目的。相較于既往采用實驗驗證藥物作用機制的方法，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有低成本、可重復(fù)的特點，并且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有更為大量的樣本量、更加全面，與中藥成分的多樣性更加適配，可作為后期實驗研究的重要鋪墊，減少實驗驗證的盲目性。

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘，揭示獨活-羌活-細辛有山柰酚、β-谷甾醇、芝麻脂素、異紫花前胡苷、紫花前胡苷、O-乙酰二氫歐山芹酯等關(guān)鍵成分，這些成分具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。獨活-羌活-細辛與膝骨關(guān)節(jié)之間存在92個共有靶點，通過建立中藥-成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)以及中藥-成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，更直觀地反映獨活-羌活-細辛藥物組合在治療KOA的復(fù)雜作用機制。

通過Cytoscape進行拓撲分析，發(fā)現(xiàn)AKT1、ESR1、JUN、CASP3等為關(guān)鍵靶點，其中多項研究表明AKT1可以增加骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞增殖并且抑制其凋亡，是骨關(guān)節(jié)炎的治療的重要靶點[26]，由此延伸出許多針對AKT1靶點基因的研究[27]；JUN蛋白在骨關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的表達顯著升高，抑制B細胞活化轉(zhuǎn)錄因子/JUN的轉(zhuǎn)錄活性，減少MMP的表達，減輕OA小鼠的軟骨細胞損傷[28]；ESR1同樣能抑制軟骨細胞凋亡，促進軟骨細胞增殖[29]；CASP3在膝骨關(guān)節(jié)炎患者中表達顯著增加，與軟骨細胞凋亡有關(guān)[30]。

MCODE聚類分析找出了其中的核心基因NOS3、ESR1、ACOX1、NR1I2。XbaI和 PvuII限制酶識別位點在ESR1基因中的多態(tài)性與多種疾病有關(guān)，其中包括骨關(guān)節(jié)炎[31]，進一步的研究認為ESR1中rs2234693的多態(tài)性與KOA的發(fā)生存在相關(guān)性[32]；NR1I2可以激活p16-CDK 4/6-pRb-E2F信號通路，減輕軟骨細胞的氧化應(yīng)激和細胞衰老，從而達到治療膝骨關(guān)節(jié)的目的[33]；目前部分研究認為ACOX1與肝細胞內(nèi)脂肪沉積和某些癌癥具有相關(guān)性，但是缺乏ACOX1與膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究[34]；有研究認為NOS3與阿爾茨海默病、高血壓、腦卒中等多種疾病相關(guān)，缺乏研究證明NOS3與膝骨關(guān)節(jié)炎存在相關(guān)性，甚至有研究認為NOS3與骨關(guān)節(jié)炎之間并沒有相關(guān)性[35]。對此情況，筆者認為，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也存在其不足之處，可能導(dǎo)致了本次研究結(jié)果的偏頗，但是ACOX1、NOS3也可能是膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)基因，只是目前尚未明確，這也為未來的研究提供了新的方向。

通過GO富集分析進一步確定了獨活-羌活-細辛可能起作用的生物過程、信號通路、分子功能、細胞組分，其中主要有類固醇激素反應(yīng)性、脂多糖反應(yīng)性、脂肪酸代謝過程、活性氧代謝過程、對細菌分子、藥物、抗生素反應(yīng)性以及對異物來源的反應(yīng)及細胞反應(yīng)，提示獨活-羌活-細辛可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程來治療膝骨關(guān)節(jié)炎。有研究認為類固醇激素水平可能與男性全膝、全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)存在相關(guān)性[36]，但是目前的研究還不能準確闡明其機制和相關(guān)性[37]；脂多糖可以誘導(dǎo)軟骨細胞的凋亡，促進骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，而抑制脂多糖可以減少軟骨細胞的凋亡[38]；脂肪酸代謝過程也與骨關(guān)節(jié)炎存在相關(guān)性，不飽和脂肪酸可能對預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎有益，而飽和脂肪酸則相反[39]；關(guān)節(jié)內(nèi)的氧化應(yīng)激和活性氧過高會導(dǎo)致軟骨細胞衰老和凋亡，細胞外基質(zhì)合成和降解以及滑膜炎癥和軟骨下骨功能障礙[40]。其余生物過程也有部分已經(jīng)被證明與膝骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)，也有部分缺乏相關(guān)研究。

KEGG通路富集的結(jié)果中，主要有AGE-RAGE通路和TNF通路。AGE-RAGE通過引起軟骨基質(zhì)降解與軟骨細胞凋亡以及促進軟骨及滑膜組織的炎性反應(yīng)等方式在OA發(fā)病中發(fā)揮重要作用，并且通過抑制AGE-RAGE通路可以明顯減緩骨關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展[41]。TNF作為重要的炎癥因子，介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中至關(guān)重要[42]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從分子生物學(xué)的角度證明了骨痹合劑治療膝骨關(guān)節(jié)炎的有效性，初步預(yù)測了獨活-羌活-細辛治療膝骨關(guān)節(jié)炎的有效化學(xué)成分，可能的信號通路、生物過程、核心基因，為后續(xù)獨活-羌活-細辛治療膝骨關(guān)節(jié)炎有效成分的分析和作用機制探索提供了參考方向和依據(jù)。