王海如 侯亞彬 李艷芳 郝崇華

(山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，山西省人民醫(yī)院，太原 030001)

血流感染是一種非常嚴(yán)重的全身性疾病，常伴隨著不良的臨床結(jié)局，不僅增加了患者死亡率，延長了住院時(shí)間，還增加了醫(yī)療費(fèi)用[1]。大腸埃希菌是引起血流感染的主要病原菌，2018年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(China Antimicrobial Surveillance Network,CHINET)數(shù)據(jù)顯示，大腸埃希菌在血流感染病原菌中占23.1%[2]。有研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌血流感染后 30 d的全因死亡率約為16%，并隨著耐藥性的增加而增加[3]。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum betalactamases，ESBLs)是大腸埃希菌的主要耐藥機(jī)制[4]。本文重點(diǎn)對(duì)血流感染大腸埃希菌進(jìn)行耐藥表型和分子流行學(xué)調(diào)查，為經(jīng)驗(yàn)性用藥和制定預(yù)防感染措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集2019年10月至2020年9月山西省人民醫(yī)院住院患者血培養(yǎng)中的大腸埃希菌，同一患者同一住院期間連續(xù)多次培養(yǎng)出大腸埃希菌時(shí)，只收集首次培養(yǎng)的菌株?？偣彩占?6株大腸埃希菌，其中男性患者34例，女性患者占42例，平均年齡(62.1±14.9)歲。

1.1.2 儀器與試劑

法國生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀及配套試劑，美國Bio-Rad公司的ST1000 PCR擴(kuò)增儀，德國Bruker公司的MicroflexMALDI- TOF MS全自動(dòng)生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，英國Oxoid公司的藥敏紙片及M-H培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)

用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定，用VITEK-2 Compact和相應(yīng)的AST-GN16藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和ESBLs確證試驗(yàn)。藥敏結(jié)果參考CLSI M100[5]進(jìn)行判讀。大腸埃希菌ACTT25922和ACTT35218做質(zhì)控菌株。

1.2.2 耐藥基因檢測

對(duì)表型確認(rèn)為ESBLs陽性的菌株進(jìn)行耐藥基因的篩查，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測ESBLs基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1,-2,-8,-9,-25組、blaVEB、blaGES、blaOXA-1,-2,-10組和blaPER，引物序列見表1[6]。提取DNA模板采用煮沸法，參考Zhao等[7]的步驟，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[6]，將陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果在BLAST數(shù)據(jù)庫比對(duì)，以確定其基因亞型。

表1 耐藥基因引物序列及目的片段大小Tab.1 PCR primers of the drug resistance genes and size of the target fragments

1.2.3 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

通過PCR擴(kuò)增大腸埃希菌的7個(gè)管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA。在EnteroBase數(shù)據(jù)庫中對(duì)管家基因序列進(jìn)行在線比對(duì)，獲得管家基因的序列號(hào)，形成相應(yīng)的等位基因譜，最后進(jìn)行序列型分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。我們將分類變量的值表示為它們所屬組的百分比。用卡方檢驗(yàn)比較分類變量。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

76株大腸埃希菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，達(dá)到90.7%，其次是環(huán)丙沙星、頭孢唑林、左氧氟沙星和頭孢曲松，耐藥率分別為69.7%、65.7%、63.1%和56.5%。對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、厄他培南、亞胺培南、阿米卡星和替加環(huán)素全部敏感。76株大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs的檢出率為56.5%。產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松全部耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南和慶大霉素的耐藥率分別為86.0%、83.7%、65.1%和60.4%，不產(chǎn)ESBLs菌株耐藥率最高的是氨芐西林，耐藥率是78.7%，其次是環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲惡唑、慶大霉素和左氧氟沙星，耐藥率分別為48.4%、45.5%、42.4%和36.3%。產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株(P＜0.05)，詳見表2。

表2 血流感染大腸埃希菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率Tab.2 The resistance rates of Escherichia coli causing bloodstream infections to common antibiotics

2.2 分子特征

2.2.1 ESBLs基因檢測結(jié)果

在43株產(chǎn)ESBLs菌株中，總共檢出71個(gè)耐藥基因，其中僅攜帶一個(gè)ESBLs基因的有19株菌，攜帶兩個(gè)ESBLs基因的有20株菌，攜帶3個(gè)ESBLs基因的有4株菌。檢出率最高的是blaCTX-M-14(39.4%，28/71)基因，其次是blaTEM-1(28.2%，20/71)、blaCTX-M-15(14.1%，10/71)、blaOXA-1(9.8%，7/71)和blaCTX-M-55(8.5%，6/7 1)。未發(fā)現(xiàn)b l aSHV、b l aCTX-M-2,-8,-25組、blaGES、blaVEB、blaOXA-2,-10組或blaPER基因。

2.2.2 多位點(diǎn)序列分型(MLST)和GoeBURST分析

通過MLST分析，在76株分離株中鑒定出28種STs型。如圖1所示，具體的STs型為ST131(19.7%，15/76)、ST69(15.7%，12/76)、ST38(7.8%，6/76)、ST1193(6.5%，5/76)、ST648(5.2%，4/76)、ST73(5.2%，4/76)、ST46(3.9%，3/76)、ST405(3.9%，3/76)、ST117(2.6%，2/76)、ST450(2.6%，2/76)、ST2003(2.6%，2/76)、ST2448(2.6%，2/76)和其他是1株菌的ST10、ST44、ST95、ST155、ST167、ST393、ST490、ST410、ST457、ST493、ST542、ST773、ST1163、ST1284、ST2179、ST4503型。在產(chǎn)ESBLs菌株中，以ST131(27.9%，12/43)為主，在不產(chǎn)ESBL菌株中，以ST69(24.2%，8/33)為主。

圖1 最小生成樹(MST)，每個(gè)圓的面積對(duì)應(yīng)于本研究的MLST數(shù)據(jù)中ST的出現(xiàn)頻率Fig.1 Minimum spanning tree(MST),the area of each circle corresponds to the frequency of St in MLST data

3 討論

耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)和傳播一直是公眾關(guān)注的問題。研究報(bào)告顯示，抗生素耐藥性細(xì)菌每年在全世界造成大約70萬人死亡，如果不采取有效行動(dòng)，預(yù)計(jì)到2050年每年將造成1000萬人死亡[8]。同濟(jì)醫(yī)院1998—2017年耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示大腸埃希菌產(chǎn)生ESBLs的比例顯著增加，從1998—2002年的0增加到2008—2012年的76.2%[9]。不同醫(yī)院之間的微生物流行病學(xué)和耐藥率可能存在很大差異[10]，臨床醫(yī)生在選擇適當(dāng)?shù)目咕貢r(shí)應(yīng)考慮當(dāng)?shù)匚⑸锪餍胁W(xué)。本研究分析了山西省人民醫(yī)院血流感染中大腸埃希菌的藥物敏感性、耐藥基因分布及菌株間的同源性特征。

本研究表明，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星等常用抗生素高度耐藥，但對(duì)碳青霉烯類、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和替加環(huán)素全部敏感，與樓頌羔等的報(bào)道一致[11]，建議這些藥物作為早期經(jīng)驗(yàn)治療的選擇。本研究中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的檢出率為56.5%，低于Ma等[12]報(bào)道的河南產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的檢出率61.9%和Wang等[6]報(bào)道的上海產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的檢出率67.8%，但是高于意大利產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的檢出率37.6%[13]和日本產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的檢出率26.1%[14]。不同地區(qū)大腸埃希菌產(chǎn) ESBLs 檢出率不同，這種差異形成的原因可能與不同醫(yī)院對(duì)感染控制力度不同、使用抗生素情況不同以及各地衛(wèi)生條件不同等因素有關(guān)[15]。

本研究中，76株大腸埃希菌中多重耐藥菌株有56株，其中42株是產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，14株為不產(chǎn)ESBLs菌株。43株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中40株攜帶blaCTX-M基因，這些菌株對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松全耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率高于80%。在全球范圍內(nèi)，大腸埃希菌中最常見的ESBLs基因類型是blaCTX-M基因[16]，本研究的結(jié)果與之相符。在我們的研究中，blaCTX-M-14是blaCTX-M的主要亞型，其次是blaCTX-M-15和blaCTX-M-55，而在德國和荷蘭[17-18]的研究顯示，blaCTX-M-15是blaCTX-M的主要亞型，這表明，大腸埃希菌blaCTX-M基因的亞型分布存在地理差異。43株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中有19株菌攜帶一個(gè)ESBLs基因，有20株菌同時(shí)攜帶兩個(gè)ESBLs基因，有4株菌同時(shí)攜帶3個(gè)ESBLs基因，進(jìn)一步證明我院大腸埃希菌耐藥情況嚴(yán)重，多重耐藥模式復(fù)雜。

GoeBURST分析結(jié)果表明，引起血流感染的大腸埃希菌并不是由獨(dú)特的祖先背景進(jìn)化而來的，存在遺傳多樣性。我們的結(jié)果顯示，在產(chǎn)ESBLs菌株中主要的ST型是ST131型，ST131型是目前公認(rèn)的全球流行性克隆群和多重耐藥譜系之一[19]，Ranjan等[20]的研究發(fā)現(xiàn)ST131型大腸埃希菌有更強(qiáng)的致病性和更好的生存能力，這有助于ST131的流行，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌數(shù)量的大量增加可能與ST131的克隆擴(kuò)增有關(guān)[21]。本研究中80%的ST131型菌株攜帶blaCTX-M基因，說明ST131型與blaCTX-M有很強(qiáng)的相關(guān)性，這與Alireza等[22]的研究一致。我們的結(jié)果顯示，在不產(chǎn)ESBLs菌株中，主要的ST型是ST69型，而荷蘭van Hout等[23]的一項(xiàng)研究表明，ST73是不產(chǎn)ESBLs菌株中最常見的序列類型，與我們的研究不一致，這表明，不同地區(qū)大腸埃希菌的ST型分布存在明顯差異。我們的研究還發(fā)現(xiàn)ST131型菌株對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南和慶大霉素的耐藥率高，ST69型菌株對(duì)氨芐西林、慶大霉素和復(fù)方磺胺甲惡唑的耐藥率高，與Souza等[24]的研究結(jié)果一致，這表明不同ST型對(duì)不同藥物的敏感性存在一定差異，臨床需根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的抗菌藥物。

綜上所述，本院大腸埃希菌對(duì)大多數(shù)常用抗生素具有耐藥性。經(jīng)驗(yàn)性用藥，碳青霉烯類、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星和替加環(huán)素可能是較好的選擇。本院血流感染中大腸埃希菌主要流行的耐藥基因型為blaCTX-M型，MLST分析表明，菌株間存在遺傳多樣性。合理使用抗生素和監(jiān)測病原體的流行病學(xué)特征是必要的，以減少耐藥細(xì)菌的擴(kuò)散和流行。