賈艷會 華春珍,* 周明明 俞惠 付盼 王傳清 許紅梅 景春梅 鄧繼巋 陳運生 張婷 張泓 林愛偉 王世富 曹清 周云芳 鄧慧玲 曹三成 赫建華 高巍

(1 浙江大學醫(yī)學院兒童醫(yī)院，國家兒童健康臨床研究中心，杭州 310003；2 復旦大學兒童醫(yī)院，上海 201102；3 重慶醫(yī)科大學兒童醫(yī)院，重慶 400014；4 深圳市兒童醫(yī)院，深圳 518026；5 上海交通大學兒童醫(yī)院，上海 200040；6 山東大學齊魯兒童醫(yī)院，濟南 250022；7 上海兒童醫(yī)學中心，上海 200127；8 西安市兒童醫(yī)院，西安 710002；9 開封市兒童醫(yī)院，開封 475099)

流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae，Hi)是一種革蘭陰性小球桿菌，主要分為有莢膜和無莢膜菌株兩類。大部分的流感嗜血桿菌為機會性致病菌，也是臨床中兒童最常分離到的條件致病菌之一[1-2]，該菌主要引起兒童呼吸道疾病，如社區(qū)獲得性肺炎[2-4]、急性中耳炎、鼻竇炎[2,5]等。該菌在青春前期女童細菌性陰道炎中也是主要的致病菌之 一[6]。嚴重感染可侵入血流引起膿毒血癥、腦膜炎等侵襲性感染[2,4,7]。多年來，治療Hi感染的首選藥物是氨芐西林，但是不同國家和地區(qū)，Hi對氨芐西林的耐藥率差別較大[8-9]，且耐藥率逐年上升趨勢明顯[8-10]。2016年以來，我國兒科細菌感染性疾病監(jiān)測協(xié)作組(Infectious Disease Surveillance of Pediatrics，ISPED)對不同地域9家兒童醫(yī)院的Hi進行耐藥性監(jiān)測[11-12]，發(fā)現(xiàn)Hi菌株對氨芐西林的耐藥率從2016年的58.1%升至2019年的72.1%%，對氨芐西林舒巴坦的耐藥率也從17.6%上升至43.0%，臨床Hi疾病的治療面臨挑戰(zhàn)。新冠疫情之后，在嚴格的防控策略下，兒童各種感染性疾病的發(fā)生率有明顯下降，疫情后ISPED關(guān)于兒童來源的Hi尚未報道，現(xiàn)將2020年我國9家兒童醫(yī)院的Hi耐藥模式進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和鑒定

我國不同地域的9家兒童醫(yī)院組成ISPED協(xié)作組，成員單位包括浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院、復旦大學附屬兒科醫(yī)院、上海交通大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院、上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心、深圳兒童醫(yī)院、西安兒童醫(yī)院、山東大學齊魯兒童醫(yī)院、河南省開封市兒童醫(yī)院。Hi臨床株為2020年1月至12月鑒定者，且在嗜血桿菌選擇性培養(yǎng)基上經(jīng)分區(qū)劃種半定量達“++”以上。細菌培養(yǎng)和鑒定方法按照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)當年指南執(zhí)行。

1.2 β-內(nèi)酰胺酶檢測和藥敏試驗

按照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)2020版指南，采用頭孢硝噻酚紙片(BioMériex,France)法檢測β-內(nèi)酰胺酶，采用MIC法(重慶兒童醫(yī)院和復旦大學兒科醫(yī)院)或Kirby-Bauer法(其他家兒童醫(yī)院)進行藥敏試驗。MIC法使用奈瑟菌/嗜血桿菌檢測試劑盒(重慶圣和源科技有限公司)；Kirby-Bauer法檢測的抗生素包括氨芐西林(10 μg)、氨芐西林/舒巴坦(10 μg/10 μg)、頭孢呋辛(30 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、美羅培南(10 μg)、氯霉素(30 μg)、復方磺胺甲惡唑(1.25/23.75 μg)、左氧氟沙星(5 μg)和阿奇霉素(15 μg)，均購自英國Oxoid公司。流感嗜血桿菌 ATCC49247為質(zhì)控菌株貫穿始終，結(jié)果完全合格。

1.3 統(tǒng)計學方法

計數(shù)資料用n(%)表示，組間耐藥率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標本來源及分布

共分離到Hi 2244株，其中來自呼吸道標本2104株(93.4%)，非呼吸道標本140株(6.23%)。1312株(58.5%)來自男性，患兒的年齡范圍為10 d～16歲，中位數(shù)年齡0.92歲。菌株季節(jié)性分布顯示1～6月份共1146株，占51%，其中以1月份構(gòu)成比最高，共791株，占35.2%。具體標本分布見表1。

表1 標本類型菌株分布及構(gòu)成比[n(%)]Tab.1 Specimen type distribution and composition ratio[n(%)]

2.2 β-內(nèi)酰胺酶檢測和藥敏試驗結(jié)果

2020年9 家醫(yī)院2244株Hi對9種抗生素的耐藥情況見表2。β-內(nèi)酰胺酶陽性株和陰性株對9種抗生素的耐藥率比較見表3。呼吸道來源Hi菌株對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦鈉、頭孢呋辛、復方磺胺甲惡唑和阿奇霉素的耐藥率高于非呼吸道來源菌株(P＜0.01)，見表4。2244株Hi中，β-內(nèi)酰胺酶陽性1451例，占64.6%。β-內(nèi)酰胺酶陽性且氨芐西林舒巴坦耐藥536株，占23.9%。其中175株(7.7%)為β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥Hi(β-lactamase negative and ampicillin-resistant，BLNAR)，BLNAR菌株和β-內(nèi)酰胺酶陽性株對9種抗生素的耐藥率比較見表5。

表2 2020年9家兒童醫(yī)院分離的2244株流感嗜血桿菌對9種抗生素耐藥情況Tab.2 Resistance of antibiotics against 2244 strains of H.influenzaeisolated from patients in 9 children's hospitals in 2020

表3 β-內(nèi)酰胺酶陽性株和陰性株對9種抗生素的耐藥率比較Tab.3 Comparison of resistance rate of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae between β-lactamase positive isolates and negative isolates

表4 呼吸道來源與非呼吸道來源的Hi菌株對9種抗生素耐藥率比較Tab.4 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non-respiratory specimens

表5 BLNAR菌株和β-內(nèi)酰胺酶陽性株對9種抗生素的耐藥率比較Tab.5 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated between BLNAR and β-lactamase positive isolates

2.3 多重耐藥情況

所有菌株中耐3種及3種以上不同種類抗生素的多重耐藥菌株1293株，占57.6%。其中β-內(nèi)酰胺酶陽性株和陰性株的多重耐藥率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，見表6。呼吸道來源和非呼吸道來源的Hi株多重耐藥率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，見表7。最常見的耐藥模式為耐氨芐西林、復方磺胺甲惡唑和阿奇霉素，共735株(56.8%)。同時耐氨芐西林、氯霉素、復方磺胺甲惡唑和阿奇霉素共11株，占多重耐藥株0.9%(11/1293)，同時耐氨芐西林、復方磺胺甲惡唑、阿奇霉素和左氧氟沙星共1株，占0.07%。

表6 β-內(nèi)酰胺酶陽性株和陰性株的多重耐藥率比較Tab.6 Comparison of multidrug resistance rates between β-lactamase positive isolates and negative isolates

表7 呼吸道來源和非呼吸道來源的Hi株多重耐藥率比較Tab.7 Comparison of multidrug resistance rates against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non- respiratory specimens

3 討論

本組Hi的主要標本來源為下呼吸道感染患兒的痰液標本，與該菌是兒童社區(qū)獲得性肺炎最常見的細菌學病原吻合[3]。此外，3.47%的菌株來自有癥狀的陰道炎患兒的陰道拭子，提示該菌亦應是青春前期女童外陰陰道感染的常見病原菌[6]，與Wang等[11]2016年的研究數(shù)據(jù)一致。本組侵襲性菌株少見，僅血流來源12株和腦脊液來源6株，提示該菌引起化膿性腦膜炎侵襲性感染的少見[5,13]，可能與Hi臨床株以無莢膜型為主，菌株侵襲力相對較弱有關(guān)。兒童Hi感染往往有明顯的季節(jié)性，不同地區(qū)或同一地區(qū)的不同年份，因氣候條件存在差異，該菌感染的高峰季節(jié)可能存在一定變遷，本組分離到Hi以1～6月份最多，與既往我國該菌的季節(jié)分布基本一致[11-12]。

10年前，日本和韓國的Hi對氨芐西林的耐藥程度遠較中國嚴重，但之后他們的菌株對氨芐西林的耐藥率上升幅度并不大，多在70%以內(nèi)[9-10,14-15]，而本組耐藥性分析顯示，2020年的Hi菌株對氨芐西林的耐藥率已達72.1%，較2016年報道的58.1%有較大幅度上升[11]，值得高度關(guān)注，至于是否與耐藥克隆在地區(qū)克隆播散密切有關(guān)，有待對菌株進行遺傳背景研究再明確。Hi對氨芐西林耐藥的機制有2種，分別是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶破壞抗生素和青霉素結(jié)合蛋白3(PBP3)突變導致與氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力下降(即BLNAR機制)，其中產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是我國Hi耐氨芐西林的主要機制[6,11-12]，而在本次研究中，β-內(nèi)酰胺酶陰性耐氨芐西林的菌株占7.7%，較呂志勇等[16]在2015—2019年對Hi耐藥性分析中β-內(nèi)酰胺酶陰性耐氨芐西林的菌株3%有大幅提升，提示BLNAR耐藥機制已不容忽視。此外，本研究發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株對其他抗菌藥物的耐藥率、多重耐藥率也顯著高于β-內(nèi)酰胺酶陰性菌株，其原因可能與流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的主要機制和對復方磺胺甲惡唑、氯霉素耐藥的機制均由質(zhì)粒介導，這些耐藥基因可整合在同一質(zhì)粒接合子上,從而導致聯(lián)合耐藥[17-18]。BLNAR因PBP突變，菌株對氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸耐藥。但本組中β-內(nèi)酰胺酶陽性的菌株中也有23.9%的對含酶抑制劑的復合制劑不敏感，這些產(chǎn)酶菌株耐氨芐西林/舒巴坦的機制，是否同時存在fts基因突變導致其編碼的PBP3的氨基酸序列改變所致，值得進一步研究。

本研究Hi菌株對氨芐西林的耐藥率較國內(nèi)外以往研究結(jié)果均明顯升高，氨芐西林不再適用于首選臨床經(jīng)驗治療用藥，但本研究Hi對氨芐西林/舒巴坦敏感率為65%，較氨芐西林、頭孢呋辛、復方磺胺甲惡唑、阿奇霉素敏感率高，且β-內(nèi)酰胺酶陽性且氨芐西林舒巴坦耐藥占23.9%，氨芐西林舒巴坦仍是可以選擇的藥物之一。Hi對第三代頭孢菌素頭孢噻肟和頭孢曲松敏感率高，對美羅培南的耐藥率僅為0.6%，與我國新型冠狀病毒肺炎流行前的研究數(shù)據(jù)大致一致[6,11-12]，提示對于兒童Hi感染，頭孢噻肟或頭孢曲松可作為首選用藥。而對于嚴重感染或者威脅生命的侵襲性Hi感染，可考慮使用美羅培南等碳氫霉烯類抗生素[19]。

Hi也可引起泌尿、生殖道感染，同一地區(qū)的同一人群中，Hi耐藥模式可因感染部位不同而存在較大差異。日本Deguchi等[20]比較呼吸道來源和泌尿道來源的Hi發(fā)現(xiàn)，呼吸道來源的Hi中BLNAR株構(gòu)成比明顯高于泌尿道菌株，而BLNAR正是日本Hi耐氨芐西林的主要機制。本研究組既往也曾對兒童呼吸道來源和陰道來源的Hi作過耐藥性比較，發(fā)現(xiàn)呼吸道菌株對氨芐西林、頭孢呋辛、克拉霉素、甲氧芐啶-磺胺甲基惡唑的耐藥率顯著高于陰道菌株[6]，與本多中心研究結(jié)果高度一致，提示對于Hi的抗感染治療，抗生素的選擇因感染部位不同而異。

Hi是一種條件致病菌，常寄居于人的上呼吸道，當前社區(qū)及醫(yī)院對于兒童呼吸道感染在無細菌培養(yǎng)、無藥敏指導下抗生素應用普遍廣泛，可能導致高度耐藥的定植Hi，本研究大多數(shù)菌株非無菌標本，所以不能排除定植菌來源，且本次研究侵襲性菌株少見，僅18株，其中氨芐西林耐藥率為55%(10/18)，王高良等[21]研究兒童侵襲性Hi感染提示其氨芐西林耐藥率為48%，可見侵襲株耐藥率反而低。

本研究的局限是，大多數(shù)菌株為非無菌標本來源，不能排除定植菌來源，Hi是否為引起患兒感染的病原需結(jié)合臨床分析；另外未能對分離到的Hi菌株進行血清分型。隨著Hib疫苗的廣泛接種，nontypableHaemophilus influenzae(NTHi)成為全球Hi疾病常見的菌型[22]。NTHi產(chǎn)生β-內(nèi)酰酶的幾率高于有莢膜的菌型，同時開展耐藥性監(jiān)測、耐藥機制和血清分型研究是研究者今后努力的方向。