許俊杰，董 悅

(臨沂大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東臨沂 276000)

淡色絲孢菌隸屬于真菌界淡色絲孢菌科，是世界性廣泛分布種。在已知的全部絲孢真菌屬種中，淡色絲孢菌占40%～45%[1]，其中很多屬種都是重要的植物病原菌，可以危害多種經(jīng)濟(jì)作物；除危害植物外還可以用于生物防治，也可以產(chǎn)生抗菌、抗腫瘤等次生代謝物。昆明西山風(fēng)景區(qū)位于有“高原明珠”之稱的滇池湖畔，地勢(shì)北低南高，最高峰海拔2 507.5 m。西山森林公園具有豐富的植物多樣性，是滇中地區(qū)頗具典型性的山地環(huán)境，植物多且集中，分布有167科、59屬、1 086種灌喬木和其他植物。此外，此地還生長(zhǎng)了一些珍稀樹種，如臺(tái)檜、鵝耳櫪、化香樹、八角楓、滇紫荊等四季常青的樹木。四季如春的氣候、豐富的植物資源、典型的地理環(huán)境決定了昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤中具有豐富的真菌資源，因此，開展土壤淡色絲孢菌的研究具有重要的意義。通過昆明市西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色絲孢菌多樣性的研究，旨在為挖掘淡色絲孢菌資源提供理論指導(dǎo)和資源支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集土壤、植物殘?bào)w樣品采集自云南昆明西山風(fēng)景區(qū)竹林、防護(hù)林、草坪、山坡林、菜田、農(nóng)田。按蛇形采樣法，每個(gè)樣地于0～30 cm處進(jìn)行土壤采集，各采樣點(diǎn)鏟取土樣15份，裝于密封袋中，編號(hào)，同時(shí)記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、生境及經(jīng)緯度。土樣帶回后置于陰涼處風(fēng)干，將編號(hào)相同的土樣混合為1份，每個(gè)采樣點(diǎn)混合好取3份土樣作為平行試驗(yàn)組，共18份土壤樣品。置于冰盒中保存24 h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基為水瓊脂+秸稈培養(yǎng)基；純化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB液體培養(yǎng)基(葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、水1 000 mL)[2]。

1.3 土壤真菌的分離、純化利用稀釋涂布平板法[3]進(jìn)行土壤真菌的分離，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，涂布后置于25 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)4～7 d后，對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、編號(hào)、分離、純化、保存。將純化菌株接種PDA培養(yǎng)基平板上，每隔24 h觀察菌落形態(tài)、顏色、培養(yǎng)基顏色，用載玻片培養(yǎng)法[4]觀察其形態(tài)學(xué)特征。

1.4 土壤真菌群落數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1物種豐富度。即群落中的物種數(shù)，在此指各生境采集的土壤樣品中分離得到的淡色絲孢菌的屬級(jí)物種數(shù)，以S表示。

1.4.2種群優(yōu)勢(shì)度。以Berger-Parker優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(di)進(jìn)行計(jì)算，其公式如下：

di=Ni/N

(1)

式中，N為物種總數(shù)，Ni為第i物種個(gè)體總數(shù)(該研究中以屬為單位統(tǒng)計(jì)菌落數(shù))。

1.4.3物種多樣性。以Shannon-Wiener多樣性指數(shù)公式進(jìn)行計(jì)算，其公式如下：

(2)

式中，H′為物種的多樣指數(shù)，n為物種(該研究中為屬級(jí)分類單位)總數(shù)，pi為第i種物種個(gè)體數(shù)占群落總個(gè)體數(shù)的比例[5]。

1.4.4物種均勻度。采用 Pielou 指數(shù)測(cè)定公式[5]計(jì)算物種均勻度，其公式如下：

J=H′/lnS

(3)

式中，J為均勻度，H′為Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，S為物種總數(shù)。

1.4.5相似性分析。采用 Jaccard系數(shù)公式[5]進(jìn)行相似性分析，其公式如下：

Cj=J/(a+b-J)

(4)

式中，J為群落A與群落B共有的物種數(shù)，a為群落A含有的全部物種數(shù)，b為群落B含有的全部物種數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用Excel 2003和DPS 7.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌在不同生態(tài)環(huán)境中的分布情況從表1可以看出，6種不同類型的生態(tài)環(huán)境土壤中，真菌的物種組成與分布存在明顯差異。防護(hù)林土壤中真菌屬種總數(shù)最大，為300株，淡色絲孢菌173株。其中，木霉屬真菌67株，鐮刀菌屬46株，青霉屬28株，支頂孢屬32株；草坪中真菌共有194株，淡色絲孢菌149株，其中木霉屬78株，鐮刀菌屬32株，青霉屬26株，支頂孢屬13株。山坡林土壤中真菌共有176株，淡色絲孢菌115株，其中木霉屬42株，鐮刀菌屬41株，青霉屬24株，支頂孢屬8株。竹林土壤中真菌共有170株，淡色絲孢菌85株，其中木霉屬30株，鐮刀菌屬30株，青霉屬16株，支頂孢屬9株；菜田土壤中真菌共有103株，淡色絲孢菌73株，其中木霉屬17株，鐮刀菌屬29株，青霉屬19株，支頂孢屬8株；農(nóng)田土壤中真菌共有179株，淡色絲孢菌131株，其中木霉屬79株，鐮刀菌屬23株，青霉屬27株，支頂孢屬2株。其他種類的真菌在6種生境中分布各有不同，除節(jié)菱孢屬和鏈格孢屬數(shù)量較多外，其他分布較少。淡色絲孢菌共726株，為土壤真菌菌落中的優(yōu)勢(shì)種群。

表1 不同生態(tài)環(huán)境中土壤的淡色絲孢真菌及其他物種組成和分布

2.2 昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色絲孢菌屬的組成及優(yōu)勢(shì)度從采集的18份土壤樣品中分離獲得土壤真菌18屬1 122株，其中淡色絲孢菌726株(表1)。18個(gè)屬分別為青霉屬Penicillium、鐮刀菌屬Fusarium、盾殼霉屬Trichothecium、木霉屬Trichoderma、脈孢菌屬Neurospora、節(jié)菱孢屬Arthrinium、帚霉屬Scopulariopsis、鏈格孢屬Alternaria、彎孢屬Curvularia、聚單端孢屬Trichothecium、酵母屬Pichia、支頂孢屬Acremonium、葡孢霉屬Botryosphaeria、盤多毛孢屬Neopestalotiopsis、毛色二孢屬Lasiodiplodia、黑孢霉屬Nigrospora、殼囊孢屬Cytospora、未知菌屬。其中，青霉屬、鐮刀菌屬、木霉屬和支頂孢屬為淡色絲孢菌。

參考昆蟲物種優(yōu)勢(shì)度(di)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，di>0.10為優(yōu)勢(shì)屬，0.01

表2 不同生境中土壤淡色絲孢菌及其他物種的優(yōu)勢(shì)度

2.3 昆明西山風(fēng)景區(qū)生境中土壤淡色絲孢菌群落多樣性從表3可以看出，土壤淡色絲孢菌在昆明西山風(fēng)景區(qū)6種不同生境中的物種豐富度存在較明顯差異，防護(hù)林生境中物種豐富度最高(18)，它包含了18屬，其次為山坡林豐富度(16)，菜田生境中物種豐富度最低(10)，而農(nóng)田、菜田、草坪和竹林生境的物種豐富度較接近。山坡林和防護(hù)林生境中土壤淡色絲孢菌的H′指數(shù)均大于2，而其他4個(gè)生境中的多樣性指數(shù)略低，但是均大于1.78。菜田的均勻度最大(0.864 5)，農(nóng)田的均勻度最小(0.694 9)，其他生境的均勻度非常接近。防護(hù)林土壤中多樣性指數(shù)、物種豐富度和物種數(shù)均最大，說明防護(hù)林人為干擾活動(dòng)少、土壤物種穩(wěn)定；菜田土中物種豐富度和物種數(shù)均最小，說明人為活動(dòng)和耕作方式等影響真菌的數(shù)量和種類。防護(hù)林、山坡林的H′指數(shù)均較大，說明這種生境的土壤中有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)較為豐富，較適合真菌的生長(zhǎng)與繁殖。草坪、竹林、農(nóng)田和菜田土真菌H′指數(shù)相對(duì)較低，說明其生境植被種類單一，可能會(huì)導(dǎo)致真菌數(shù)量和種類減少。從均勻度看出，菜田土真菌均勻度最大(0.864 5)，農(nóng)田土真菌均勻度最小(0.694 9)，其他類型的生境中真菌均勻度介于菜田土和農(nóng)田土之間，也較為相近。由表3可知，不同生境中淡色絲孢菌數(shù)量和物種數(shù)各不相同，說明淡色絲孢菌的數(shù)量與土壤結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)成分等因素密切相關(guān)。

表3 不同生態(tài)類型土壤中淡色絲孢菌及其他物種的群落特征

2.4 昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色絲孢菌不同生境類型的群落相似性根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)原理，當(dāng)相似性系數(shù)(Cj)為0～0.25時(shí)，為極不相似；當(dāng)0.25

表4 土壤淡色絲孢菌在不同生境類型的群落相似性

3 結(jié)論與討論

陸地真菌資源豐富，截至2000年，陸地真菌總數(shù)約5萬(wàn)種[7-9]。該研究首次對(duì)昆明西山風(fēng)景區(qū)土壤淡色孢菌資源及其群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，共分離得到1 122株真菌，其中淡色絲孢菌726株，主要包含于鐮刀菌、支頂孢、青霉和木霉4個(gè)屬之中。這雖然初步揭示了該地區(qū)真菌種群的分布特征，但從數(shù)量和種類上講挖掘的遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。目前各個(gè)領(lǐng)域針對(duì)微生物菌群多樣性的分析方法主要分為培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法2種，其中培養(yǎng)法由于條件限制只能分離鑒定出少數(shù)微生物。自然界中只有0.1%～1.0%的微生物通過常規(guī)方法能被培養(yǎng)，說明應(yīng)用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法導(dǎo)致了微生物多樣性的嚴(yán)重丟失。因此，非常有必要應(yīng)用非培養(yǎng)[10-12]的分子生物學(xué)方法來研究土壤中的真菌菌落組成，以此達(dá)到較為完整地獲取土壤中真菌多樣性信息的目的，同時(shí)也期望將來能找到一套更為科學(xué)的分離培養(yǎng)方法，從土壤中挖掘出更多的淡色絲孢菌。

生態(tài)學(xué)多樣性測(cè)定的局限性在于取樣地點(diǎn)和取樣本數(shù)量的局限性，在一個(gè)生態(tài)區(qū)域取樣時(shí)，只能按照統(tǒng)計(jì)學(xué)取樣要求進(jìn)行定點(diǎn)取樣，樣本數(shù)量雖然能夠反映出土壤中微生物的大部分信息，但是卻包含不了其中所有的種類。綜上所述，要想準(zhǔn)確分析土壤中淡色絲孢菌的多樣性，必須改進(jìn)真菌分離方法，采用多種手段相結(jié)合的方式對(duì)微生物多樣性進(jìn)行合理分析。