劉 圓，肖娟麗，張安紅，2，王志安，趙戰(zhàn)勝，羅曉麗，2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，山西運城 044000；2.棉花種質(zhì)資源利用與分子設(shè)計育種山西省重點實驗室，山西運城 044000；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠 831300)

早熟棉是適宜緩解當(dāng)前糧棉爭地、植棉面積逐漸減少現(xiàn)狀的一種棉花類型，其最主要的特點是生育期短、適于晚春播、初夏播或夏播，可以與冬小麥、油菜等冬季作物實現(xiàn)糧棉一年兩熟，提高復(fù)種指數(shù)，在增加糧食產(chǎn)量、保證糧食安全的同時，確保棉花的種植面積及產(chǎn)量，為國家農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略的實施提供堅實的基礎(chǔ)[1-2]。在春季氣溫低、秋季氣溫下降快、光熱條件差、降水少的西北內(nèi)陸地區(qū)，丘陵、山區(qū)較多且無霜期較短的華北地區(qū)，如遼寧、新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地種植早熟棉還可以提高棉花的霜前花率，改善棉花品質(zhì)[3]。尤其是新疆位于溫帶大陸性氣候區(qū)，夏季降水少，多晴天，晝夜溫差大；緯度較高，夏季白晝較長，光照充足；位于塔里木盆地邊緣山麓地帶，高山冰雪融水豐富，灌溉便利；多沙質(zhì)土壤，透氣性好，有利于棉花生長；收獲季節(jié)多晴朗天氣，有利于棉花采摘；冬季氣溫低，有利于殺死棉花病蟲害。這些得天獨厚的光、熱資源等便利條件，使得新疆棉花以色澤潔白、纖維品質(zhì)好而深受棉紡織企業(yè)和消費者青睞。自20世紀(jì)90年代中期以來，以新疆為主產(chǎn)區(qū)的西北內(nèi)陸棉區(qū)成為全國優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)，2015年以來，新疆棉花播種面積常年占全國播種面積的60%以上，2019年達(dá)到76%，2020年新疆棉花產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的87.3%[4-6]。新疆南北疆共有37個主要棉地，其中北疆21個以種植早熟棉品種為主，南疆16個以種植中早熟棉品種為主。

由于新疆地處西北內(nèi)陸，常年降雨較少，并且耕地普遍有不同程度的沙化，與之伴隨而來的鹽堿化和次生鹽堿化現(xiàn)象較為嚴(yán)重；此外常年連作造成了病蟲害的發(fā)生和棉田雜草危害日趨嚴(yán)重，極大地限制了新疆棉花種植業(yè)的發(fā)展。因此，生產(chǎn)上急需高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)，同時兼具抗旱、耐鹽堿和抗病蟲害的早熟棉花新品種。而通過常規(guī)的育種手段在短時間內(nèi)是很難實現(xiàn)的。因此，培育優(yōu)良的早熟棉品種，對優(yōu)化種植結(jié)構(gòu)，提高種植效益具有重要的意義。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，通過基因工程手段解決上述問題成為了可能。例如，我國在轉(zhuǎn)基因棉花的研究中已經(jīng)取得了較大的成績，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花已經(jīng)得到大規(guī)模的應(yīng)用[7-14]。轉(zhuǎn)基因棉花大部分為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，這就離不開棉花的組織培養(yǎng)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生，但棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生受基因型限制[15-16]，阻礙了生物技術(shù)在棉花遺傳改良中的廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。

早熟棉的體細(xì)胞胚胎發(fā)生受基因型限制尤其嚴(yán)重，目前國內(nèi)轉(zhuǎn)基因棉花的受體親本大部分是生育期在180 d以上的中熟棉，具有目標(biāo)性狀的轉(zhuǎn)基因中熟棉和優(yōu)良早熟棉進(jìn)行雜交轉(zhuǎn)育，存在花期不遇的現(xiàn)象，如通過栽培調(diào)整花期后雜交轉(zhuǎn)育成功，則后代出現(xiàn)生育期延長不能在早熟棉區(qū)種植，這種現(xiàn)象阻礙了生物技術(shù)在早熟棉遺傳改良中的廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展，在棉花轉(zhuǎn)基因工程的研究中，除了分離、克隆目標(biāo)基因，構(gòu)建高效表達(dá)載體等技術(shù)外，從適用于大田生產(chǎn)上廣泛使用的早熟棉中篩選體細(xì)胞能夠再生的品種，通過組織培養(yǎng)技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)篩選出體細(xì)胞胚胎高頻再生的受體材料，建立一套廣為適用的早熟棉組織培養(yǎng)快速再生體系是早熟棉轉(zhuǎn)基因成功的關(guān)鍵因素，因此相關(guān)學(xué)者在早熟棉體細(xì)胞再生方面做了大量的研究工作，并取得了可喜的成績。但是能夠體細(xì)胞再生的早熟棉種質(zhì)資源很少，所以拓展早熟棉花再生基因型、篩選高頻再生品(種)系或株系，對于早熟棉花基因工程具有重要意義。

該研究對我國近年來早熟棉體細(xì)胞再生和早熟棉轉(zhuǎn)基因研究的進(jìn)展做了總結(jié)，遴選出了能夠候選為轉(zhuǎn)化受體的早熟棉優(yōu)良品種，并對早熟棉轉(zhuǎn)基因研究提出了展望，以期為創(chuàng)制抗病蟲、抗除草劑、抗旱和耐鹽堿的早熟棉新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 國內(nèi)早熟棉體細(xì)胞再生研究進(jìn)展

自張寶紅等[17]將泗棉3號進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得了具有高頻胚胎發(fā)生的愈傷組織、胚狀體和小植株后，朱生偉等[18]以陸地棉(GossypiumhirsutumL.)新疆推廣品種“新陸早4號”進(jìn)行體細(xì)胞再生研究并在6～7個月獲得了再生植株。于婭等[19]以陸地棉“中棉所24”為材料進(jìn)行了全固體體細(xì)胞培養(yǎng)，獲得了愈傷組織和再生植株。王芳等[20]對新疆2個陸地棉品種新陸早1號、新陸早7號的胚狀體發(fā)生及植株再生進(jìn)行研究，結(jié)果表明胚狀體發(fā)生、萌發(fā)、成苗各階段，品種間存在明顯差異。正常植株率最高分別達(dá)65.7%、85.7%。周小鳳等[21]以15個新疆主栽優(yōu)良品種(系)以及2個對照品種ZY-1和Y668為研究對象，利用下胚軸做外植體進(jìn)行胚胎發(fā)生能力的比較研究，篩選出5個能夠胚胎發(fā)生的基因型，即新陸早12、新陸早17、新陸早22、新陸早32和新陸早33，其中新陸早32和新陸早33能在3個月左右分化，且分化率較高，可達(dá)90%左右，具備作為棉花優(yōu)良遺傳轉(zhuǎn)化受體的基本特征。

陳天子等[22]以新疆4個主栽棉花品種新陸中20、新陸早24、新陸早 33和 03298為材料，通過不同濃度的激素組合成功地誘導(dǎo)獲得了體細(xì)胞胚并在6～8個月內(nèi)獲得了再生植株。嚴(yán)勇亮等[23]以新疆棉區(qū)的新陸中15號、新陸中18號、系9、黃河流域棉區(qū)的中棉所35號、中棉所44號及對照品種柯字312為研究對象，比較新疆和黃河流域2個生態(tài)區(qū)棉花品種的體細(xì)胞再生能力，優(yōu)化棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的相關(guān)條件參數(shù)，除新陸中18號外其他5個獲得了再生植株，建立高效棉花體細(xì)胞再生體系，并且得出新疆棉區(qū)和黃河流域棉花品種的植株再生潛力沒有明顯差別，新陸中15號的愈傷組織分化率及胚胎萌發(fā)率都比較高，具備作為棉花優(yōu)良遺傳轉(zhuǎn)化受體的基本特征，但新疆棉花品種細(xì)胞胚胎發(fā)生所需的時間長的結(jié)論。羅曉麗等[24]以8個早熟或特早熟棉花為材料，通過不同激素組合(1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L KT、0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT)誘導(dǎo)其愈傷組織，成功使晉棉5號、中棉所27號和遼棉10號3個早熟棉品種在5～7個月內(nèi)通過體細(xì)胞胚胎分化獲得再生小苗。周晶等[25]以新疆陸地棉主栽品種新陸早19號和新陸早23號下胚軸為外植體，通過對再生體系的研究，首次獲得了胚性愈傷組織并在6～8個月獲得了大量再生植株。劉麗等[26]以新疆主栽品種新陸早32號、33號和對照YZ1為研究材料，通過不同濃度的激素組合成功誘導(dǎo)獲得了體細(xì)胞胚，并在8個月內(nèi)都成功得到再生苗。焦天奇等[27]以新陸早33號為對照研究新疆主栽品種新陸早42號的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，新陸早42號在140 d內(nèi)獲得了有根系發(fā)育良好的能嫁接植株(株高7～8 cm)。李鵬飛等[28]以新疆棉區(qū)主栽品種新陸早33 號和新彩棉7 號為試驗材料，比較不同激素組合對二者體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的影響，在6個月內(nèi)獲得再生植株。李有忠等[29]以新疆主栽早熟棉品種新陸早13號、新陸早26號、新陸早33號為試材，通過不同質(zhì)量濃度的激素組合成功誘導(dǎo)并獲得體細(xì)胞胚，在8個月內(nèi)都能成功獲得再生苗。馬盼盼等[30]以模式品種Coker312為對照研究新疆主栽陸地棉品種新陸早33號的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生，新陸早33號在180 d 獲得根系發(fā)育良好的再生幼苗，而 Coker312 完成這一過程則需要210 d。葛書婭等[31]利用(0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT)的激素組合成功建立了陸地棉新陸早45號的胚胎發(fā)生再生體系，150 d左右獲得了再生植株。

根據(jù)國內(nèi)早熟棉體細(xì)胞再生和早熟棉轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀文獻(xiàn)報道，以及筆者對早熟棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生體系建立[24]所做的研究，總結(jié)出大田生產(chǎn)上廣泛使用并能夠進(jìn)行體細(xì)胞再生的早熟棉品種有新陸早1號、4號、7號、12號、13號、17號、19號、22號、23號、32號、33號、45號，中棉所16號、24號，泗棉3號，晉棉5號，遼棉10號等；中早熟棉品種能夠進(jìn)行體細(xì)胞再生的有新陸中15號、20號、24號、中12、中13、中17、中19、中27、中35、中44、冀棉7、冀棉11、冀棉14、冀棉19、冀棉20、冀棉27、晉棉7、晉棉12、魯棉1號、魯棉2號、魯棉6號、蘇棉12號等。其中獲得體細(xì)胞再生植株重復(fù)報道的有新陸早33號(7次)、新陸早1號(2次)、新陸早32號(2次)、泗棉3號(2次)。

2 國內(nèi)早熟棉轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

隨著轉(zhuǎn)基因棉花在國內(nèi)大面積的種植，在早熟棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生研究的基礎(chǔ)上，以早熟棉為受體的早熟棉轉(zhuǎn)基因研究也開展起來。自王偉等[32]以新疆陸地棉栽培品種新陸早1號為轉(zhuǎn)化受體，通過根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑(CPTI)基因?qū)胄玛懺?號并在7～8個月獲得轉(zhuǎn)基因再生植株后，有關(guān)早熟棉轉(zhuǎn)基因的研究便一直備受相關(guān)科研人員的重視。吳慎杰等[33]以陸地棉泗棉3號的下胚軸為外植體，建立了高效的轉(zhuǎn)化體系，得到了大量的轉(zhuǎn)基因植株。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)重點實驗室以早熟棉中棉所24號為受體獲得大量的轉(zhuǎn)基因棉花，其中將擬南芥過表達(dá)基因AtCIPK23、AtAKT1和AtCBL1轉(zhuǎn)入早熟棉中棉所24號中，張斌等[34]對轉(zhuǎn)基因棉花苗期耐低鉀的差異及機(jī)制進(jìn)行了研究。孟顥光[35]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將雙價抗真菌病基因幾丁質(zhì)酶基因(Chitinase)和β-1，3-葡聚糖酶基因(Glucanase)導(dǎo)入中棉所 24 中，獲得了抗性穩(wěn)定的抗病植株；張興華等[36]對轉(zhuǎn)雙價抗病基因(Chi+Glu)棉抗枯黃萎病競爭能力進(jìn)行了研究；劉小玲等[37]對轉(zhuǎn)RRM2和ACO2-E6基因棉花冠層特征和光合特性與產(chǎn)量形成的關(guān)系進(jìn)行了分析；楊作仁[38]利用T-DNA 激活標(biāo)簽轉(zhuǎn)化中棉所 24號所獲得的pagoda1 突變體為研究對象，對棉花T-DNA激活標(biāo)簽突變體 pagoda1 的分子機(jī)制進(jìn)行研究并應(yīng)用。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所的李靜等[39]為拓展可再生陸地棉的基因型，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)直接改良已有的優(yōu)良早熟棉品種，設(shè)置不同濃度的2，4-D和激動素(KT)4種組合進(jìn)行誘導(dǎo)，用6～8個月成功獲得體細(xì)胞胚和再生植株，構(gòu)建早熟棉品種“中棉所16”再生體系，并利用該體系將EDT1抗旱耐鹽基因成功導(dǎo)入“中棉所16”基因組，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。利用早熟棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化并獲得成功的有新陸早1號、中棉所24號、泗棉3號、中棉所16號等4個棉花品種。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所分子遺傳改良實驗室以中棉所24號作為早熟棉轉(zhuǎn)基因受體的模式品種建立了規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系，在早熟棉種質(zhì)創(chuàng)制和功能基因驗證方面發(fā)揮了重要的作用。但是目前還沒有早熟棉直接作為受體轉(zhuǎn)化選育的轉(zhuǎn)基因早熟棉品種用于生產(chǎn)。

以上早熟棉品種經(jīng)體細(xì)胞再生或作為轉(zhuǎn)基因受體的重復(fù)驗證均獲得再生植株或轉(zhuǎn)基因再生植株，可根據(jù)不同早熟棉種植區(qū)的需要選擇作為轉(zhuǎn)基因受體的優(yōu)良品種。其他已報道具備體細(xì)胞再生的早熟棉和中早熟棉作為拓展早熟棉花再生基因型，經(jīng)過體細(xì)胞再生試驗、篩選高頻再生品(種)系或株系可作為備用轉(zhuǎn)化受體，這對于早熟棉花基因工程具有重要意義。

3 早熟棉轉(zhuǎn)基因研究建議

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟棉高效轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵是以高頻(50%以上)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的優(yōu)良早熟棉品種受體為基礎(chǔ)，以高效的轉(zhuǎn)化率(50%以上)為保障，為廣泛高效的開展早熟棉轉(zhuǎn)基因研究，創(chuàng)制生產(chǎn)上急需的早熟棉種質(zhì)為目的。轉(zhuǎn)基因早熟棉研究應(yīng)將以下2點作為重點。

3.1 早熟棉高頻再生純合系的篩選以該研究闡述的能夠體細(xì)胞再生且品質(zhì)優(yōu)良的(中)早熟棉品種為候選品種，如新陸早33號、新陸早32號、新陸早1號、新陸早45號、中棉所16號、中棉所24號、泗棉3號等，以這些品種的脫絨種子為材料，根據(jù)文獻(xiàn)已報道的資料和筆者長期研究總結(jié)得出的結(jié)果[24，40]，調(diào)整早熟棉體細(xì)胞再生各階段所需培養(yǎng)基組成成分，培養(yǎng)時間及繼代次數(shù)，根據(jù)早熟棉生長發(fā)育特點調(diào)整組織培養(yǎng)條件。

參照吳家和等[41]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)進(jìn)行早熟棉高頻再生純合系篩選，將生長健壯的無菌苗(30株)分株進(jìn)行下胚軸組織培養(yǎng)，選擇不同單株10個克隆的可育再生單株，收獲T0自交單鈴種子。T0種子的無菌苗(T1)第2次組培，收獲胚胎發(fā)生和再生周期短(150 d)的T0 株系的再生單株自交T1種子。種植T1種子，收獲農(nóng)藝性狀優(yōu)良的T2自交株行種子并擴(kuò)繁，獲得早熟棉高頻再生純合系轉(zhuǎn)化親本。高頻再生純合系轉(zhuǎn)化親本的獲得可將轉(zhuǎn)基因過程縮短到6～8個月，篩選流程如圖1所示。

圖1 早熟棉高頻再生純合系篩選流程

3.2 建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟棉高效轉(zhuǎn)化體系根據(jù)已有研究與實踐結(jié)果[42-43]，要建立早熟棉高效的轉(zhuǎn)化體系必須以提高菌株活力降低轉(zhuǎn)化材料的泛菌率和降低轉(zhuǎn)基因棉花畸形苗和不育率為前提。

3.2.1提高菌株活力降低轉(zhuǎn)化材料的泛菌率。分別挑取攜帶目的基因的農(nóng)桿菌菌落接種于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平LB液體培養(yǎng)基中，菌株活力旺盛的在28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后OD600值可達(dá)到0.5～0.7，未達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)的菌株不能用作轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)基因體系要隨時檢測菌株的活力。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌菌液用LB稀釋100倍后加入50 mg/L的乙酰丁香酮(AS)，26～28 ℃振蕩培養(yǎng)(180～200 r/min)0.5～1.0 h浸染棉花無菌苗下胚軸外植體切段8～10 min，浸染后吸干外植體上的菌液、低溫共培(21 ℃)48 h。 經(jīng)共培養(yǎng)后的下胚軸切段轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中，在常規(guī)條件下[棉花遺傳轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)條件均為：溫度(28±2)℃，光照長度12 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx],先暗培養(yǎng)1個月，然后光培養(yǎng)1個月后再次轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中，光培養(yǎng)1個月進(jìn)行二次誘導(dǎo)篩選，愈傷組織直徑達(dá)到0.5～1.0 cm，未誘導(dǎo)出愈傷組織的下胚軸切段淘汰。

通過浸染液的稀釋、浸染后吸干外植體上的菌液、低溫共培、暗培養(yǎng)和二次篩選，并嚴(yán)格繼代操作規(guī)范等可將外植體及愈傷的泛菌現(xiàn)象降低到5%以下，菌株活力的增強(qiáng)可使轉(zhuǎn)化率提高到50%以上。

3.2.2降低轉(zhuǎn)基因棉花畸形苗和不育率。通過二次篩選誘導(dǎo)培養(yǎng)后將愈傷組織置入增殖培養(yǎng)基時即時抽掉激素；縮短胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)時間(10～15 d)至胚狀體出現(xiàn)；分化的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基M5時，用無菌透氣封口膜封口、增加培養(yǎng)基固化劑含量(3.5 g/L Phytagel)，以改善分化愈傷組織的培養(yǎng)條件。采取胚狀體培養(yǎng)時降低培養(yǎng)基中糖含量(25 g/L葡萄糖)，成苗培養(yǎng)基中改變固化劑和糖分含量(3.25 g/L Phytagel，20 g/L葡萄糖)等技術(shù)措施，可以降低棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的畸形苗和玻璃化苗，使正常苗的產(chǎn)生率達(dá)到90%以上。將分化-見苗的組織培養(yǎng)時間控制在90～120 d，可使轉(zhuǎn)化再生株的不育率降低到30%以下。獲得再生植株并在嫁接前取試管苗葉片進(jìn)行目標(biāo)基因序列檢測，嫁接陽性再生植株，這樣可使轉(zhuǎn)化過程縮短2～3個月，轉(zhuǎn)化率提高到50%以上。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟棉高效轉(zhuǎn)化體系建立的關(guān)鍵是以高頻(50%以上)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的優(yōu)良早熟棉品種受體為基礎(chǔ)，該研究總結(jié)并部分驗證出能夠體細(xì)胞再生的早熟棉品種，從中遴選出作為早熟棉轉(zhuǎn)基因受體的候選品種，其中新陸早33號經(jīng)研究人員的驗證，可作為新疆早熟棉轉(zhuǎn)基因受體的優(yōu)選品種，另外還有新陸早1號和新陸早32號；黃淮海棉區(qū)以中棉所24號、中棉所16號為早熟棉轉(zhuǎn)基因受體的優(yōu)選品種；長江流域棉區(qū)以泗棉3號為早熟棉轉(zhuǎn)基因受體的優(yōu)選品種。并結(jié)合吳家和等[41]的方法研究出高頻再生純合系的篩選技術(shù)，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的中熟棉轉(zhuǎn)基因體系為基礎(chǔ)，對影響轉(zhuǎn)化體系的各因子進(jìn)行優(yōu)化，研究出建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟棉高效轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵技術(shù)。以早熟棉高頻再生純合系種子為轉(zhuǎn)化受體，利用高效的(轉(zhuǎn)化率50%以上)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系將不同功能的目標(biāo)基因直接轉(zhuǎn)入早熟棉，將消除早熟棉雜交轉(zhuǎn)育改良時花期不遇和改良后代生育期延長的現(xiàn)象，培育適宜新疆棉區(qū)、黃淮海棉區(qū)麥棉夏播套種、長江流域棉區(qū)麥和油菜后直播等一熟棉區(qū)以及輕簡化種植所需的中早熟棉和早熟棉種質(zhì)資源，可加快早熟棉轉(zhuǎn)基因育種和基因功能分析的進(jìn)程，提高棉花的綜合利用價值。