宋立先，劉春紅， 王占青，高 蓉，徐學振

(濱州醫(yī)學院煙臺附院，山東煙臺 264100)

黑皮質(zhì)素受體系統(tǒng)由5個密切相關的G蛋白偶聯(lián)受體組成(MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R)。這些受體參與包括人類在內(nèi)的多細胞動物許多重要的生物學過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，黑皮質(zhì)素途徑在體重調(diào)控中起著重要作用，下丘腦黑皮質(zhì)素信號的增強導致食物攝入減少和能量消耗增加。單基因肥胖伴MC4R功能障礙與能量平衡調(diào)節(jié)密切相關。此外，MC4R基因突變與單基因肥胖和普通肥胖均有顯著相關。MC4R基因突變與脂肪量和肥胖相關(FTO)基因的相互作用顯著增加肥胖風險，尤其是青少年[2]。據(jù)文獻報道，在美國有近12 800名肥胖患者與MC4R的缺陷有關[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，有超過15億的成人和兒童面臨肥胖的困擾，肥胖已經(jīng)作為公共健康問題受到人們的廣泛關注，嚴重威脅人類健康[4]。全球疾病負擔小組估計，2015年BMI值升高導致400萬人死亡，其中2/3的人死于心血管疾病(CVD)[5]。肥胖與2型糖尿病的關系早已被人們所認識，并清楚地解釋了許多國家2型糖尿病的高患病率。許多肥胖高?；颊叩奶卣魇谴x和心血管危險因素并存[6]。眾所周知，過度肥胖對流感易感性增加，包括近年在全世界范圍流行的新型冠狀病毒，對人類的危害堪稱是災難性的。人們通常認為，飲食結(jié)構(gòu)不恰當和缺乏運動是導致肥胖的主要原因，但是有些人即使是健康的生活方式，仍然會面臨肥胖的困擾,因為導致肥胖的原因除了生活方式，還有基因因素參與[7]。有學者在對UK生物銀行的0.5億份樣本進行篩查，發(fā)現(xiàn)了61個MC4R突變體，通過分析發(fā)現(xiàn)，均與BMI、肥胖相關代謝性心肌病密切相關[8]。因此，迫切需要深入探究MC4R突變導致的肥胖。

MC4R是一個有996個堿基配對的七次跨膜受體，定位染色體18Q21.3上，主要分布于下丘腦[7]。犬被認為是研究人類疾病和包括肥胖在內(nèi)的功能失調(diào)機制的理想生物醫(yī)學模型[9]。犬MC4R基因由編碼332個氨基酸的單一外顯子組成，定位在1號染色體上，在各物種之間存在高度同源性[10]。為了探討MC4R突變和肥胖之間的關系，筆者成功構(gòu)建了犬 D298N突變體的真核表達載體，后將其導入MDCK細胞內(nèi)，旨在為進一步探討MC4R突變引起的蛋白功能變化提供信息，同時也為人類肥胖的基因治療提供科研數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株及細胞系。帶His標簽的pcDNA3.1載體、DH5α、PMD18-T Vector、MDCK細胞。

1.1.2主要試劑。Beagle犬新鮮血液；聚合酶rTaqDNA、X-Gal、異丙基硫代半乳糖苷、限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ和BamHI)、DNA Marker、T4-DNA 連接酶、RNA PCR提取試劑盒；Trizol Reagent、培養(yǎng)基、Anti-myc 抗體；G418抗生素、FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑盒；胎牛血清等。

1.2 方法

1.2.1引物設計。根據(jù)GenBank犬MC4R基因，設計引物序列：上游引物A，5′-CGGGATCCGCCAGGATGAACTCCACCCTTCAGC-3′；中間引物B，5′-ATGAGAGGGTTGATGATGGAG-3′；中間引物C，5′-CTCCATCATCAACCCTCTCAT-3′；下游引物D，5′-CCGCTCGAGGTATCTGCTAGACAAGTCAC-3′。引物AB擴增基因長度為115 bp,引物 CD擴增基因長度為902 bp,引物AD擴增基因長度為1 019 bp。

1.2.2提取犬血DNA，擴增D298N突變體基因PCR。

(1)以引物AB、CD進行PCR反應獲得基因片段，分別命名為產(chǎn)物AB、CD。擴增完畢取目的產(chǎn)物20 μL，用凝膠電泳進行檢測，然后將凝膠進行回收、純化，取2 μL進行電泳檢測。

(2)以引物AB、CD產(chǎn)物為模板，用引物A、D進行PCR反應獲得突變體的DNA片段。擴增完畢取目的產(chǎn)物20 μL，用凝膠電泳進行檢測，然后將凝膠進行回收、純化，取2 μL進行電泳檢測。

1.2.3獲得的DNA片段進行TA克隆、測序。將突變體D298N的DNA片段連接到pMD18-T載體，命名pMD18-T-cMC4R-D298N,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞進行藍白斑篩選，提取質(zhì)粒，用BamHI、XhoI進行酶切鑒定，篩選陽性質(zhì)粒送測序，并與犬MC4R基因序列進行比較。

1.2.4重組真核表達載體構(gòu)建、測序。用BamHI、XhoI將TA克隆陽性質(zhì)粒和帶His標簽的pcDNA3.1真核表達載體進行雙酶切、電泳，回收目的片段。用T4 DNA連接酶將帶His標簽的pcDNA3.1真核表達載體和MC4R片段在16 ℃條件下14 h進行連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α細胞，用抗生素平板篩選，挑取單克隆菌落鑒定。測序正確后擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA。

1.2.5將基因轉(zhuǎn)染到MDCK細胞。將處于對數(shù)生長期的MDCK細胞重懸在培養(yǎng)基中，接種細胞，培養(yǎng)24 h，使細胞融合率達75%，把空質(zhì)粒及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MDCK細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染24 h后，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，收集細胞。

1.2.6用RT-PCR方法檢測基因的表達。轉(zhuǎn)染3 d后，提取未轉(zhuǎn)染細胞、空載體轉(zhuǎn)染細胞、重組體轉(zhuǎn)染細胞的總RNA，進行凝膠電泳檢測。用RNA PCR 試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄。用cDNA做模板，引物A和D進行PCR反應。取20 μL PCR產(chǎn)物，用凝膠電泳檢測。

1.2.7用Western blot方法檢測蛋白的表達。轉(zhuǎn)染3 d后，用EDTA-胰酶對未轉(zhuǎn)染的細胞、空載體轉(zhuǎn)染細胞、重組體轉(zhuǎn)染細胞進行消化，并提取蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)進行定量檢測(分光光度計)，然后灌膠、點樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入His抗體，孵育過夜，與羊抗鼠二抗反應、顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬的基因組DNA條帶用Beagle犬的新鮮全血提取DNA，結(jié)果見圖1。

圖1 犬基因組DNA 1%瓊脂糖凝膠分離結(jié)果

2.2 犬突變體D298N-MC4R目的片段電泳結(jié)果用overlap PCR技術首先擴增115和902 bp 2個片段，再以這2個擴增得到的片段為模板，擴增D298N-cMC4R目的片段，擴增產(chǎn)物約1 000 bp(圖2) 。

注：1.犬MC4R 115 bp目的產(chǎn)物；2.犬MC4R 902 bp目的產(chǎn)物；3.D298N-cMC4R目的產(chǎn)物；M.DNA Marker 100 bp

2.3 載體pMD18-T-cMC4R-D298的酶切、測序載體pMD18-T的分子量約2.7 kb，擴增PCR產(chǎn)物約1.0 kb，預測pMD18-T-cMC4R-D298N 的大小約為3.7 kb,提取pMD18-T-cMC4R-D298N 酶切、凝膠電泳回收產(chǎn)物(圖3)。測序結(jié)果重組表達質(zhì)粒2處堿基不同，堿基T(777位)→C，堿基G(892)→A(引入的突變位點)。

注：1.pMD18-T-cMC4R-D298N 3 700 bp目的產(chǎn)物；2.pMD18-T 的2 700 bp條帶和犬cMC4R-D298N的1 000 bp目的產(chǎn)物；M.DNA Marker

2.4 重組體酶切、測序pcDNA3.1-myc-His/A分子量約5.5 kb,PCR擴增產(chǎn)物大小約1 000 bp，可以預測pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R的大小6.5 kb，提取的重組體酶切、凝膠電泳回收產(chǎn)物見圖4。測序結(jié)果同T—A克隆結(jié)果見圖5，第298位的天冬氨酸變成天冬酰胺，表明成功構(gòu)建帶突變位點的目的載體。

注：1.pcDNA3.1- myc-His/A-cMC4R重組體;2.pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R經(jīng)Xho I/BamH 酶切產(chǎn)物;M.100～6000 bp DNA分子量對照

圖5 犬MC4R-D298N測序結(jié)果

2.5 重組體轉(zhuǎn)染MDCK細胞、RT-PCR檢測目的基因表達將重組表達載體pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D298N轉(zhuǎn)染入MDCK細胞(圖6)培養(yǎng)3 d，提取細胞總RNA并檢測，結(jié)果見圖7。用RT-PCR進行反轉(zhuǎn)錄，凝膠電泳結(jié)果見圖8。從圖8可見，空載體轉(zhuǎn)染細胞組、未轉(zhuǎn)染細胞組在1 000 bp處無條帶，表明無目的基因表達；轉(zhuǎn)染重組體細胞組在約1 000 bp處有亮帶，表明目的基因成功表達。

注：1.100倍光鏡下未轉(zhuǎn)染細胞；2.100倍光鏡下轉(zhuǎn)染3 d后細胞Note:1.The cells without transfection(100×); 2.The cells were transfected with recombinant plasmid after 3 days(100×)

注：1.轉(zhuǎn)染重組體MDCK細胞總RNA;2.轉(zhuǎn)染空載體MDCK細胞總RNA;3.未轉(zhuǎn)染MDCK細胞總RNA

注：1.轉(zhuǎn)染重組體的MDCK細胞RT-PCR結(jié)果;2.轉(zhuǎn)染空載體的MDCK細胞RT-PCR結(jié)果；3.未轉(zhuǎn)染的MDCK細胞RT-PCR結(jié)果；M.100 bp DNA 分子量對照

2.6 Western blot檢測蛋白表達犬的MC4R基因由332個氨基酸組成，編碼蛋白的分子量為36.9 kD。載體融合標簽分子量大小約為3 kD，重組體表達的融合蛋白預期大小約為40 kD。Western blot檢測蛋白表達結(jié)果見圖9，可見融合蛋白在40 kD處顯示亮帶，空載體和未轉(zhuǎn)染組處無亮帶，原因為myc基因作為癌基因，細胞本身也有少量表達，因此空載體和未轉(zhuǎn)染細胞組在40 kD處有暗帶。

注：A,1.D298N重組體轉(zhuǎn)染細胞組；2.空載體轉(zhuǎn)染細胞組； 3.轉(zhuǎn)染野生型重組體細胞組;4.未轉(zhuǎn)染細胞組。B,Beta actin 內(nèi)參

3 討論

隨著肥胖病例逐年上升，迫切需要找到一種能調(diào)節(jié)體重和食欲的治療方法。MC4R是新療法的一個有吸引力的潛在靶點，MC4R被激活后，MC4R調(diào)節(jié)能量平衡并減少脂肪生成。同時可以識別多種細胞外刺激物，包括小分子、離子、光子、肽和蛋白質(zhì)，并將刺激物穿過不滲透的膜屏障傳遞到細胞內(nèi)區(qū)域，從而影響細胞功能的變化。信號通過蛋白質(zhì)相互作用和激活事件的級聯(lián)傳遞，從而引起細胞功能的細胞內(nèi)生化介質(zhì)(如第二信使)水平的變化，從而調(diào)節(jié)多種生理功能。MC4R調(diào)節(jié)脂肪組織的形成和能量平衡，被認為是新型肥胖治療的單基因靶點[11]。

MC4R作為瘦素-黑素皮質(zhì)素途徑的一部分，在下丘腦體重調(diào)節(jié)和能量消耗中起著關鍵作用。MC4R突變可導致各種MC4R信號通路發(fā)生截然不同的變化，并突出了受體突變綜合表征的重要性,是單基因肥胖最常見的原因。迄今為止，在肥胖患者中發(fā)現(xiàn)的許多突變在體外系統(tǒng)的過度表達中具有功能特征，其中大部分缺少Gs信號途徑[12]。近年來，有對牛、雞、豬、犬的MC4R基因的相關研究，其中研究較多的為豬和犬。黑皮質(zhì)素受體所有亞型中位于第298位的Asp298的基因序列高度保守[13]。有文獻報道，在豬MC4R基因298位氨基酸突變與豬背膘的肥厚呈相關性[14]，而犬的該位點是否存在突變及突變后對蛋白功能是否有影響，目前尚鮮見文獻報道。然而，今后要想深入研究蛋白功能，載體構(gòu)建即是第一步工作。

筆者所在課題組曾在前期研究中成功構(gòu)建犬MC4R-D90N突變體的真核表達載體，并在融合蛋白中成功表達[15]。目前國內(nèi)有關犬MC4R-D298N氨基酸突變的研究較少，基于此，筆者構(gòu)建了突變體MC4R-D298N重組真核表達載體，第298位的天冬氨酸變成天冬酰胺，后轉(zhuǎn)染到犬的細胞中并獲得成功表達。更多突變位點的發(fā)現(xiàn)，尤其是高度保守區(qū)域氨基酸突變能否導致蛋白功能變化為進一步探索肥胖的原因提供了更多信息。針對肥胖患者飲食調(diào)控的治療過程中，手術治療并未在長期臨床效果中獲益，更加強調(diào)了MC4R激動劑藥物治療的重要性，且只有通過基因篩查后才可以評估患者是否適合手術治療。因此，針對治療肥胖患者的藥物研發(fā)更加重要。篩選導致肥胖的危險基因，當前不僅是為了研究常規(guī)治療肥胖藥物，甚至可為兒科內(nèi)分泌學篩選導致肥胖的基因提供指導意見[16]。因此，可以通過基因突變位點的篩查，對存在MC4R基因突變的兒童進行前期干預，包括飲食、運動及藥物干預。綜上所述，該研究為MC4R基因突變引起蛋白功能變化、MC4R與配體結(jié)合后2個信號傳導通路之間聯(lián)系機制提供了前期科研基礎，同時為臨床上研發(fā)治療肥胖藥物及從兒童期預防肥胖的前期干預提供了科研數(shù)據(jù)。