何玉瑤 劉曉慶 楊艷平 董云芳 趙 赫 韓 樹 張 靖 侯曉瑩

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100010; 2 山東省濰坊市中醫(yī)院,濰坊，261000)

參芪五味子片復(fù)方中的主要藥物組成是南五味子、黃芪、黨參及酸棗仁。在復(fù)方中南五味子斂肺滋腎，寧心安神，黃芪和黨參補氣健脾，生津養(yǎng)血，酸棗仁養(yǎng)血安神，共奏健脾益氣，養(yǎng)心安神之效，在心脾兩虛型的失眠治療中顯示出了良好的療效。中藥復(fù)方由多種中藥配伍組成，其活性成分與作用靶點間具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[6]。參芪五味子片可以通過多靶點、多通路、多機制的協(xié)同或拮抗作用，改善失眠。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為系統(tǒng)高效揭示中藥復(fù)方分子作用機制帶來了新機遇[7]。它通過對多種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行整合分析，建立可視化的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，進(jìn)而預(yù)測藥物治療疾病可能的作用機制，以填補現(xiàn)代藥理學(xué)研究的不足之處[8]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討參芪五味子片治療失眠的潛在作用機制，以期更好地分析和研究參芪五味子片復(fù)方，為中醫(yī)藥的臨床應(yīng)用及藥理學(xué)研究提供一個全新的方向。

1 資料與方法

1.1 參芪五味子片藥物活性成分及靶點的篩選 以參芪五味子片的組方中的藥物“南五味子”“酸棗仁”“黃芪”和“黨參”為檢索詞，將口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)設(shè)為≥30%，類藥性(Drug Likeness，DL)設(shè)為≥0.18，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中篩選出參芪五味子片中藥物的活性成分及相關(guān)靶點[9]。接著，從TCMSP篩選出藥物候選活性成分的相關(guān)靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http//www.Uniprotorg/)將所得到的靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[10]。最后剔除沒有靶點的活性成分，建立藥物有效活性成分及作用靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2 參芪五味子片組方中藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將參芪五味子片組方中的中藥、活性成分及靶點導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建參芪五味子片組方的藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。其中，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點代表特定的中藥、藥物活性成分或蛋白靶點，邊則代表成分與靶點間的相互作用。節(jié)點的度(Degree)值表示與這個節(jié)點所相連的邊的數(shù)量，其Degree值越大，說明該節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中更加具有“中心性”。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoHubba插件對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)鍵靶點的分析，Degree值排前3位的靶點被認(rèn)為是參芪五味子藥物活性成分治療失眠的關(guān)鍵靶點。

1.3 檢索失眠相關(guān)靶點數(shù)據(jù) 以“insomnia”為檢索詞，限定條件為“Homo sapiens”，從Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)，以及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)中獲取失眠相關(guān)的疾病靶點。

1.4 預(yù)測參芪五味子片治療失眠的潛在靶點 借助Venny2.1.0在線繪圖軟件，將參芪五味子片中活性成分的相關(guān)靶點和有關(guān)失眠的靶點取交集，得到參芪五味子片治療失眠的潛在靶點。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析 使用Cytoscape軟件的BiosoGenet插件分別構(gòu)建藥物活性成分相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)和失眠相關(guān)的疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，提取2個PPI網(wǎng)絡(luò)的交集部分構(gòu)成1個新的交集網(wǎng)絡(luò)。對所得到的交集網(wǎng)絡(luò)選用“中介中心性”(Betweenness Centrality，BC)、“接近中心性”(Closeness Centrality，CC)、“度中心性”(Degree Centrality，DC)、“鄰近中心性”(Neighborhood Connectivity，NC)及“局部平均連通性”(Local Average Connectivity，LAC)5個參數(shù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，挖掘出核心節(jié)點。首先篩選出DC值大于2倍中位數(shù)的節(jié)點構(gòu)成顯著交集PPI網(wǎng)絡(luò)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選出同時滿足BC，CC，DC，NC，LAC分別大于中位數(shù)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點構(gòu)成核心PPI網(wǎng)絡(luò)。為了系統(tǒng)地研究化合物之間復(fù)雜的協(xié)同作用，利用上述得到的藥物生物活性成分相關(guān)靶點數(shù)據(jù)和已知的失眠相關(guān)的疾病靶點數(shù)據(jù)分別構(gòu)建2個PPI網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點代表蛋白靶點，邊表示相鄰蛋白之間的相互作用。

1.6 富集分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。GO注釋分析由生物過程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)3個部分組成。種屬限定為“homo sapiens”，P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 參芪五味子片中藥物的活性成分及其作用靶點 運用TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索出了參芪五味子片中藥物的所有活性成分293個，其中南五味子39個，酸棗仁33個，黃芪87個，黨參134個。再根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，篩選出參芪五味子片中藥物的活性成分共63個，其中南五味子13個，酸棗仁9個，黃芪20個，黨參21個。見表1。應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫得出參芪五味子片藥物的全部作用靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對這些作用靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，最后得到了45個藥物有效活性成分和232相關(guān)靶點。

表1 參芪五味子片藥物活性成分及相關(guān)靶點數(shù)

2.2 參芪五味子片藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 參芪五味子片藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中三角形代表參芪五味子片中的中藥、橢圓形代表藥物活性成分、矩形代表藥物活性成分的靶點,六邊形則代表中藥共有的活性成分。網(wǎng)絡(luò)共有280個節(jié)點,760條邊,平均每個節(jié)點有2.71條邊。節(jié)點的大小代表節(jié)點度的大小。連線越多，表示它們之間的相互作用越強烈。通過CytoHubba插件分析得出Quercetin(槲皮素)、Kaempferol(山柰酚)及Luteolin(木犀草素)是Degree值排名在前3位的藥物活性成分，可認(rèn)為是參芪五味子片治療失眠的關(guān)鍵成分。見圖1。

圖1 參芪五味子片中藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 失眠相關(guān)的疾病靶點的檢索及參芪五味子片治療失眠的潛在作用靶點的預(yù)測 以“insomnia”為主題詞檢索Drugbank、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫，分別獲得9個、83個、69個已知的失眠相關(guān)的疾病靶點。去除重復(fù)后，一共獲得160個失眠相關(guān)的疾病靶點。參芪五味子片作用失眠的潛在靶點有13個，占所有靶點3.4%。見表2、圖2。

表2 參芪五味子片藥物-疾病潛在靶點

圖2 參芪五味子片藥物活性成分靶點與失眠靶點交集韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心節(jié)點篩選 藥物生物活性化合物靶點PPI網(wǎng)絡(luò)有6 775個節(jié)點和16 335條邊(圖3A)，失眠相關(guān)疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)共有3 446個節(jié)點和76 628條邊(圖3B)。通過提取2個PPI網(wǎng)絡(luò)的重疊部分構(gòu)建交集網(wǎng)絡(luò)，獲得藥物生物活性成分-失眠相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共有2 467個節(jié)點和65 942條邊(圖3C)。篩選DC值大于2倍中位數(shù)(DC>68)的節(jié)點為顯著節(jié)點，并構(gòu)建顯著交集PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)具有612個節(jié)點和25 769條邊(圖3D)。在此基礎(chǔ)上篩選出同時滿足BC、CC、DC、NC、LAC分別大于中位數(shù)的節(jié)點作為核心節(jié)點，并構(gòu)建核心PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3E)。BC、CC、DC、NC、LAC的中位數(shù)分別為0.000 772 21、0.469 702 74、107、125.906 997、20.889 080 46。共有55個節(jié)點和451條邊。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析及核心靶點篩選

2.5 富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對上述步驟篩選得出的55個核心靶點進(jìn)行GO注釋及KEGG通路富集分析。GO功能條目中生物過程BP63種、細(xì)胞組分CC83種、分子功能MF93種，選取排名前10且P<0.01的功能進(jìn)行可視化分析。見圖4A～D。其中BP占GO功能富集條目的77.41%，包括mRNA代謝過程的調(diào)控，含核堿基化合物、mRNA、雜環(huán)、細(xì)胞氮化合物、芳香族化合物分、RNA、有機環(huán)化合物的分解代謝過程及mRNA和RNA穩(wěn)定性調(diào)控等；CC占10.65%，包括黏著斑、細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接、細(xì)胞-基質(zhì)連接、黏附連接、錨定連接、剪接體復(fù)合物、染色體端粒、核染色體端粒區(qū)、富含ficolin-1的顆粒腔及細(xì)胞質(zhì)核糖核蛋白顆粒等；MF占11.94%，包括泛素-蛋白質(zhì)連接酶、類泛素-蛋白質(zhì)連接酶、錯誤折疊蛋白質(zhì)、未折疊蛋白、熱激蛋白、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性及鈣黏蛋白等的結(jié)合以及ATP酶活性。通過KEGG通路分析得到了30條信號通路，選取P<0.01且排名前20的通路進(jìn)行分析，通路基本信息見表3。通路氣泡圖見圖4E。X軸表示富集倍數(shù)，Y軸則表示通路名稱，氣泡面積表示通路所富集的基因數(shù)，氣泡顏色的深淺則表示P值的大小。

表3 KEGG排名前20的通路基本信息(P<0.01)

圖4 富集結(jié)果分析

3 討論

心神司人之寤寐，失眠的病位主要在心。臨床對失眠病因病機的描述有許多，如“胃不和則臥不安”“思慮傷脾，脾血虧損”等，總結(jié)起來歸人體陰陽失調(diào)，營衛(wèi)失和，陽不入陰，因此在治療上當(dāng)補虛瀉實，調(diào)整陰陽。參芪五味子片是一種對南五味子、黨參、黃芪及酸棗仁等中藥成分進(jìn)行提取而得到的復(fù)方制劑，具有健脾益氣、養(yǎng)心安神的功效。張俠[11]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)參芪五味子片可以有效延長小鼠的睡眠時間、減少睡眠中小鼠的自發(fā)活動；烏冬梅等[12]在對參芪五味子片對失眠大鼠神經(jīng)遞質(zhì)影響的研究中發(fā)現(xiàn)參芪五味子片可以升高大鼠腦干及下丘腦內(nèi)的5-羥色胺含量，降低去甲腎上腺素含量，從而改變失眠大鼠的睡眠狀況[13]。在臨床中參芪五味子片治療失眠患者的有效率高達(dá)90.63%，也有相關(guān)研究表明參芪五味子片對失眠的治療效果明顯優(yōu)于鎮(zhèn)靜催眠類西藥[14-15]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討參芪五味子片治療失眠的作用機制，區(qū)別于單純的西藥治療的單分子、單通路模式，通過一系列網(wǎng)絡(luò)模型的建立，彰顯出中藥復(fù)方通過多種成分、多個靶點和多類通路治療疾病的優(yōu)勢。

通過TCMSP篩選出參芪五味子片中藥物活性成分共63個，作用于失眠的潛在靶點13個。其中Drgee值排在前3位的藥物活性成分分別是槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)及木犀草素(Luteolin)。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，它可以激活或者抑制許多蛋白質(zhì)的生物活性，具有一定的抗炎及抗氧化特性，也有研究報道說它具有潛在的抗抑郁作用。山柰酚是γ氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶抑制劑，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮的效果[16-17]。體外實驗研究證實木犀草素可以通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)，抑制炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，如白細(xì)胞介素-1β及白細(xì)胞介素-2等細(xì)胞因子，改變相應(yīng)的信號通路，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生等通路發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用[18-19]。

基于藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖、韋恩圖以及PPI網(wǎng)絡(luò)圖得到參芪五味子片治療失眠的潛在靶點有13個，分別為IL-6、CRP、GABRA1、GABRA2、GABRA3、EIF6、CYP3A4、CYP1A2、AHR、DRD1、SLC6A3、SLC6A4、NR3C1。失眠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡失調(diào)相關(guān)。γ氨基丁酸是大腦中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮等作用。GABRA1、GABRA2及GABRA3是γ氨基丁酸的門控離子通道，它們可以功能性地抑制γ氨基丁酸能突觸的形成。臨床大多數(shù)鎮(zhèn)靜催眠藥物是通過γ氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)或刺激GABRA受體來發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用，可見GABRA類門控離子通道參與調(diào)節(jié)的神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路以及相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞在失眠的治療中起著不可或缺的作用[20-23]。芳烴受體是一類能夠被配體所激活的轉(zhuǎn)錄激活因子，它參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，通過抑制影響晝夜節(jié)律的核心成分周期晝夜調(diào)節(jié)蛋白1(Period Circadian Regulator1，PER1)水平表達(dá)來調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。5-羥色胺和多巴胺是人大腦內(nèi)重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。5-羥色胺的各受體亞型可以調(diào)節(jié)人的睡眠及覺醒周期，在一定條件下，如果激動突觸前的5-羥色胺1A受體，則可以延長人的慢波睡眠，減少覺醒次數(shù)；相反，如果激動突觸后5-羥色胺1A受體，則可以抑制睡眠使人覺醒。溶質(zhì)載體家族6成員4(Solute Carrier Family 6 Member 4，SLC6A4)它是一種5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要功能是影響5-HT分子在突觸間的再利用，調(diào)節(jié)其信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在介導(dǎo)5-羥色胺對5-羥色胺能系統(tǒng)其他受體可用性的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。多巴胺具有維持覺醒的作用，SLC6A3通過對突觸前末端的高親和力鈉的重攝取來終止多巴胺使覺醒的作用，從而維持人的睡眠狀態(tài)；IL-6是細(xì)胞因子的重要成分，在炎癥反應(yīng)中處于核心地位。文獻(xiàn)為吳偉等[24]不是Friedman等通過對74例慢性失眠患者的研究發(fā)現(xiàn)其血清中IL-6水平高于正常人群，在提高睡眠質(zhì)量以及改善患者的社會關(guān)系后，血清中IL-6的水平顯著下降。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IL-6主要由大腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，它通過激活相關(guān)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使神經(jīng)再生減少。也有研究顯示，IL-6對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響與突觸的形成相關(guān)。它還可能通過色氨酸/犬尿氨酸以及甘油磷酸酯的代謝分泌通路進(jìn)一步影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。C反應(yīng)蛋白是感染性病因的重要標(biāo)志物，它通過其鈣依賴性特征與磷酰膽堿的結(jié)合來促進(jìn)凝集，干擾吞噬作用和補體固定，也可以與DNA及組蛋白相互作用，清除受損的循環(huán)細(xì)胞所釋放的核物質(zhì)。Bauml等[25]通過系統(tǒng)性研究發(fā)現(xiàn)失眠患者組C反應(yīng)蛋白水平顯著高于正常組，由此可見炎癥介質(zhì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用可能是產(chǎn)生失眠的機制之一。

KEGG富集分析主要涉及MAPK信號通路，包括癌癥中的蛋白多糖、軍團菌、麻疹和甲型流感等疾病通路，細(xì)胞周期通路，糖皮質(zhì)激素受體通路，剪接體、非同源末端連接、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工等遺傳信息處理通路，抗原加工和呈遞免疫通路以及雌激素信號通路等。其中促分裂原活化的蛋白激酶級聯(lián)是一個高度保守的模塊，涉及到多種細(xì)胞功能的執(zhí)行，如：細(xì)胞的增殖、遷移和分化。它在細(xì)胞外刺激所引起的細(xì)胞反應(yīng)性級聯(lián)中起著不可忽視的作用，Nakatani等[26]研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病伴失眠及焦慮患者血清中常存在著促分裂原活化的蛋白激酶表達(dá)的升高，在失眠及焦慮癥狀緩解后，促分裂原活化的蛋白激酶的表達(dá)也相應(yīng)地降低。睡眠與炎癥密切相關(guān)，軍團菌、麻疹、甲型流感等疾病誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一些炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)擴散進(jìn)入大腦在一定程度上會刺激和損傷人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列病理生理變化，改變其活動和睡眠調(diào)節(jié)，產(chǎn)生失眠。失眠也與細(xì)胞的死亡及衰老等周期性變化相關(guān)，它使與DNA損傷和細(xì)胞衰老相關(guān)的基因表達(dá)增加，如衰老信號標(biāo)志物周期蛋白依賴性激酶抑制因子(Cyclin-dependent KinaseInhibitor 2A，CDKN2A)，抑制人體細(xì)胞周期的進(jìn)展。晝夜節(jié)律可以調(diào)節(jié)炎癥活性及夜間皮質(zhì)醇的短暫釋放，當(dāng)人體血中皮質(zhì)醇與糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合被阻斷時，CD4和CD8T細(xì)胞分泌的IL-2和TNF細(xì)胞因子就會增加，這些炎癥介質(zhì)進(jìn)入人體大腦，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生失眠。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討參芪五味子片治療失眠的生物活性成分和潛在的作用機制，結(jié)果表明，參芪五味子片具有多種成分、多個靶點和多類通路治療失眠的作用機制，其潛在機制涉及神經(jīng)遞質(zhì)代謝、炎癥、細(xì)胞周期等方面，雖然目前仍有一些通路及機制尚未得到實驗驗證，但可以為今后闡明參芪五味子片治療失眠的具體機制提供思路，也可為參芪五味子片臨床治療失眠提供更多依據(jù)。