李二亮 晏榮保 閆 康 趙寧俠 黃汝芹 馬 瓊 趙海恩 廖 博

(1 空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，西安，710038；2 空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，西安，710038)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)指由各種原因?qū)е伦倒軆?nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)(包括脊髓和神經(jīng)根)及其功能的損害，出現(xiàn)損傷水平及以下脊髓功能(運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射等)障礙，是脊柱骨折的嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。脊髓損傷根據(jù)不同的損傷平面會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙，如呼吸肌麻痹，大小便失禁等癥狀，嚴(yán)重者可引起不同程度的截癱，甚至?xí)＜吧黐2]。相關(guān)研究顯示，我國(guó)SCI年患病率為37/100萬(wàn)，年齡34.7～54.4歲，男性高于女性，汽車(chē)碰撞和高空墜落是SCI的主要原因[3]。盡管創(chuàng)傷性SCI患者的生存率隨著時(shí)間的推移而改善，但患者的病死率仍然超過(guò)年齡匹配的對(duì)照組[4]。目前關(guān)于創(chuàng)傷性脊髓損傷的治療主要包括早期手術(shù)治療、高壓氧治療、針灸治療、中國(guó)傳統(tǒng)藥物治療等[5-11]。

二仙湯由仙茅、淫羊藿、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母組成，是20世紀(jì)50年代初張伯納研制的著名中藥方劑，用于治療骨質(zhì)疏松癥已有幾十年的歷史[12]。桃紅四物湯主要由6味中藥組成，包括桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃，記載于中國(guó)清代吳謙的《醫(yī)宗金鑒》，用于促進(jìn)血流，防止瘀血的發(fā)生，也已廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的治療[13-14]。我院總結(jié)長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)，在傳統(tǒng)中藥制劑二仙湯以及桃紅四物湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訙p，增加了黃芪、延胡索、郁金、香附、陳皮、山藥、丹參，構(gòu)建二仙湯加減中藥方劑用于臨床治療SCI。該方由18味中藥組成：仙茅、淫羊藿、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母、桃仁、紅花、熟地黃、白芍、川芎、黃芪、延胡索、郁金、香附、陳皮、山藥、丹參。見(jiàn)表1。雖然二仙湯加減目前已應(yīng)用于促進(jìn)脊髓損傷患者術(shù)后功能恢復(fù)等方面，然而該方在脊髓損傷術(shù)后治療中的作用機(jī)制尚不明確。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、化學(xué)信息學(xué)、藥理學(xué)和生物信息學(xué)等多學(xué)科交叉，從整體視角出發(fā)，發(fā)現(xiàn)藥物和機(jī)體的復(fù)雜相互作用，為中藥復(fù)方作用機(jī)制的研究提供了有效工具和新的視角[15]。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究，探究二仙湯加減治療脊髓損傷的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)Wistar雌性大鼠(斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證編號(hào)：No.110324200104595445)，動(dòng)物房保持12 h/12 h晝夜交替，保持動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，溫度23～25 ℃，濕度62%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 二仙湯加減藥物組成為：仙茅10 g、淫羊藿30 g、巴戟天10 g、當(dāng)歸10 g、黃柏12 g、知母10 g、桃仁10 g、紅花10 g、熟地黃24 g、白芍30 g、川芎9 g、黃芪40 g、延胡索15 g、郁金12 g、香附12 g、陳皮10 g、山藥20 g、丹參9 g。中藥方劑來(lái)源于本院中醫(yī)科(華潤(rùn)三九配方顆粒，批號(hào)：2101004S)；戊巴比妥鈉(默克公司，德國(guó)，批號(hào)：P11012)，5%復(fù)方利多卡因乳膏(同方藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：2012122)，注射用頭孢唑林鈉(四川制藥制劑有限公司，批號(hào)：210101B)。

1.1.3 試劑與設(shè)備 4%通用型組織固定液(中性)(中暉赫彩生物醫(yī)藥科技公司，批號(hào)：BA1102)；氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：2107032831)；脊髓損傷模型打擊器(北京金源科創(chuàng)科技有限公司，型號(hào)：ZH-ZYQ)；4-0縫線(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司，批號(hào)：21454605)。

1.2 方法

1.2.1 SCI模型制備 使用戊巴比妥鈉腹腔麻醉8周SPF級(jí)Wistar雌性大鼠，在胸椎節(jié)段(T9)進(jìn)行椎板切除術(shù)，直至脊髓從一側(cè)到另一側(cè)完全暴露，利用脊髓損傷模型打擊器參照Allens法從50 mm高度進(jìn)行脊髓打擊，形成損傷組(50 mm損傷)，假手術(shù)組僅進(jìn)行椎板切除而不進(jìn)行脊髓打擊，術(shù)后用4-0縫線分層縫合肌肉和皮膚，術(shù)后皮下給予注射用頭孢唑林鈉2 mL、5%復(fù)方利多卡因乳膏鎮(zhèn)痛以及保溫處理，如有膀胱功能障礙，每天行膀胱排空1次，直至恢復(fù)膀胱功能(圖1A-F)。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作過(guò)程

脊髓損傷造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)擺尾反射、雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)后雙下肢癱瘓[21]。造模后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)分，損傷動(dòng)物Basso、Beattie和 Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分≤2的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被選用[22]。

1.2.2 分組和干預(yù) 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組，中藥組(50 mm損傷+藥物)，對(duì)照組(50 mm損傷+水)，假手術(shù)組。中藥組給予大鼠常規(guī)灌胃約2 mL(3 g合劑)二仙湯加減藥液，對(duì)照組給予大鼠常規(guī)灌胃2 mL生理鹽水，假手術(shù)組不做任何處理。

1.2.3 行為學(xué)評(píng)價(jià)及蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色 為評(píng)估SCI后肢功能行為學(xué)，通過(guò)BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)，該量表用于評(píng)估關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)、行走能力、軀干穩(wěn)定性、肢體協(xié)調(diào)性、尾部位置和爪的精細(xì)運(yùn)動(dòng)。評(píng)分范圍為21～0，分別表示運(yùn)動(dòng)正常和完全癱瘓。由兩名分組設(shè)盲并接受充分培訓(xùn)的研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SCI前后進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分。如果2名研究者的評(píng)分不一致，則通過(guò)討論確定共識(shí)評(píng)分。

HE染色：取脊髓損傷后第7天大鼠脊髓組織標(biāo)本按標(biāo)準(zhǔn)HE染色技術(shù)處理。具體方法：用4%通用型組織固定液(中性)固定脊髓組織，在乙醇中脫水，然后包埋。隨后對(duì)脊髓切片(3 μm)并進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.2.4 構(gòu)建二仙湯加減中藥-中醫(yī)癥狀-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀網(wǎng)絡(luò)圖 通過(guò)SymMap(https://www.symmap.org/)在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲得二仙湯加減中藥成分以及對(duì)應(yīng)的中醫(yī)癥狀、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖[17]。

1.2.5 中藥成分挖掘 將二仙湯加減的18味中藥材在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中進(jìn)行挖掘，收集中藥成分。以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)成分篩選，得到中藥活性成分集合[16]。

1.2.6 成分靶標(biāo)篩選 活性成分進(jìn)一步在TCMSP中挖掘其對(duì)應(yīng)靶標(biāo)，將篩選的靶標(biāo)成分與Uniprot(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，獲得靶標(biāo)基因。

1.2.7 SCI靶標(biāo)基因篩選 分別以關(guān)鍵詞“SCI”“Spine Cord Injure”“spine cord injure”在Genecards(https://www.genecards.org)，DrugBank(https://go.drugbank.com/)在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)基因，將獲得的數(shù)據(jù)匯總后去重，得到SCI靶標(biāo)基因。

1.2.8 構(gòu)建藥物疾病韋恩圖 獲得二仙湯加減中藥靶標(biāo)與SCI基因后，取二者的交集靶標(biāo)基因，繪制韋恩圖。

1.2.9 構(gòu)建藥物疾病交集靶標(biāo)基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò) 將二仙湯加減方與SCI的交集靶標(biāo)基因輸入到STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)的Multiple proteins選項(xiàng)，Network type設(shè)置為full network，minimum required interaction score設(shè)置為medium confidence(0.400),得到PPI網(wǎng)絡(luò)信息，再導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。

1.2.10 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將二仙湯加減與SCI的交集靶標(biāo)基因輸入到Metascape在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/gp/index)，設(shè)定Min Overlap：3，P Value Cutoff：0.01，Min Enrichment：1.5.分別選擇GO相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)以及KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入生信云平臺(tái)(http://www.ehbio.com)繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 有效作用靶點(diǎn)篩選 二仙湯加減中藥-中醫(yī)癥狀-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀網(wǎng)絡(luò)圖表明18味中藥與SCI相關(guān)的中醫(yī)癥狀共有21個(gè)，對(duì)應(yīng)的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀為26個(gè)，其中相關(guān)性最高的前5個(gè)中藥分別為川芎、當(dāng)歸、香附、丹參、延胡索；中醫(yī)癥狀和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀前10個(gè)為痛、腫痛、脹痛、跌撲腫痛、腰膝酸軟、疼痛、牽扯痛、放射痛、灼燒痛、壓迫痛。見(jiàn)圖2。

圖2 二仙湯加減方中藥-中醫(yī)癥狀-現(xiàn)代醫(yī)學(xué)癥狀網(wǎng)絡(luò)

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠術(shù)后不同時(shí)間段BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分均為21分，說(shuō)明單純椎板開(kāi)窗，對(duì)脊髓并未造成損傷。對(duì)照組大鼠在術(shù)后0 h至7 d出現(xiàn)雙下肢完全癱瘓，BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分為0分，顯示大鼠脊髓損傷并且在7 d內(nèi)自愈效果較差；而中藥組在0～24 h下肢完全癱瘓，BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分為0分和對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著時(shí)間的推移(24 h至7 d)，中藥組在大鼠可見(jiàn)明顯逐漸恢復(fù)，在SCI后7 d時(shí)中藥組BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019 8)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠術(shù)前及術(shù)后BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組見(jiàn)正常大鼠脊髓組織(圖4A)，對(duì)照組可見(jiàn)脊髓組織出現(xiàn)大片空洞(圖中藍(lán)色箭頭所指)(圖4B)，中藥組可見(jiàn)脊髓組織大片空洞明顯縮小(圖中藍(lán)色箭頭所指)(圖4C)，正常脊髓組織替代原有損傷區(qū)域。

圖4 各組大鼠術(shù)后脊髓組織(HE染色，×40)

2.3 二仙湯加減方效應(yīng)成分集構(gòu)建 共檢索到5 353個(gè)基因，去重篩選后共獲得319個(gè)基因。

2.4 二仙湯加減治療SCI效應(yīng)成分靶標(biāo)發(fā)現(xiàn) 從GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到3 226個(gè)基因，DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索11個(gè)基因，合并去重后共獲得2 638個(gè)基因，SCI與二仙湯加減交集基因216個(gè)(3.76%)。見(jiàn)圖5。

圖5 二仙湯加減靶標(biāo)基因-脊髓損傷靶標(biāo)基因韋恩圖

2.5 二仙湯加減靶標(biāo)和SCI疾病基因關(guān)聯(lián)分析 結(jié)果表明，19種蛋白Degree值大于100，分別為AKT1、ALB、IL6、TP53、MAPK3、VEGFA、TNF、EGFR、CASP3、MAPK1、EGF、JUN、MAPK8、MYC、MMP9、ESR1、FOS、PTGS2、CXCL8。見(jiàn)圖6。

圖6 二仙湯加減-SCI蛋白靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO分析與KEGG通路分析 GO富集共有8 912個(gè)條目，其中生物學(xué)途徑共有個(gè)6 712個(gè)條目，包括藥物反應(yīng)、凋亡過(guò)程負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞增殖正向調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控、血管生成正調(diào)控等。見(jiàn)圖7A。633個(gè)條目與細(xì)胞組分有關(guān)，包括胞外間隙、神經(jīng)元投射、線粒體外膜、受體復(fù)合物、線粒體、膜筏等。見(jiàn)圖7B。1 034項(xiàng)與分子功能相關(guān)，包括酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、核受體活性、藥物結(jié)合、蛋白激酶活性等。見(jiàn)圖7C。共納入533條信號(hào)通路，包括cAMP信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。見(jiàn)圖7D。

圖7 各種相關(guān)富集分析

3 討論

作為哺乳動(dòng)物的常見(jiàn)模型動(dòng)物,目前脊髓損傷基礎(chǔ)研究領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有大鼠和小鼠。大鼠因其在體型以及可操作性上優(yōu)于小鼠，所以是脊髓損傷中最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。一般選擇180～220 g雌性大鼠，Allens法在大鼠的撞擊部位形成囊性空洞，并進(jìn)一步引起局部炎癥反應(yīng)[18-20]。在造模時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)擺尾反射、雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)后雙下肢癱瘓，BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)分≤2被確認(rèn)脊髓損傷造模成功[21-22]。

由于中藥方劑成分的復(fù)雜性，存在一些亟待解決的問(wèn)題。值得注意的是，中藥在成分靶點(diǎn)研究方面與西藥比較存在一定的滯后性，并且二者之間無(wú)有效的交互作用，這是中藥有效成分基礎(chǔ)研究和相關(guān)機(jī)制研究目前存在的問(wèn)題之一。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，逐漸將公開(kāi)的藥物數(shù)據(jù)與遺傳-疾病相關(guān)性、基因表達(dá)信息和PPI數(shù)據(jù)整合，從而進(jìn)一步研究藥物之間的關(guān)系以及藥物與疾病之間的關(guān)系[23]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了二仙湯加減中18味中藥成分的潛在蛋白靶點(diǎn)，以及SCI疾病的基因潛在靶點(diǎn)，利用4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的靶標(biāo)構(gòu)建藥物疾病網(wǎng)絡(luò)圖，二仙湯加減的單一藥物成分可能作用于多個(gè)靶點(diǎn)，多種成分可能作用于單個(gè)靶點(diǎn)。具有多個(gè)靶蛋白的活性成分可能比單靶成分具有更好的臨床療效和更少的不良反應(yīng)。通過(guò)GO與KEGG相關(guān)富集分析，生物學(xué)途徑主要有藥物反應(yīng)、凋亡過(guò)程負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞增殖正向調(diào)控、血管生成正調(diào)控等，參與的細(xì)胞組分主要有胞外間隙、神經(jīng)元投射等，分子功能主要包括藥物結(jié)合、蛋白激酶活性、酶結(jié)合等。在cAMP等信號(hào)通路中Ryanodine受體可能參與調(diào)控。

Ryanodine受體(Ryanodine Receptors，RyRs)是肌肉、神經(jīng)組織等多種可興奮組織的一類細(xì)胞內(nèi)鈣通道，RyRs由3種主要亞型(RyR1、2和3)組成，通過(guò)不同的信號(hào)通路參與不同細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器鈣的釋放[23]。既往研究認(rèn)為，RyR2通過(guò)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系2介導(dǎo)的氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)從而線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙及炎癥在SCI中發(fā)揮重要作用[24]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了cAMP信號(hào)通路在SCI治療中的意義。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方法探討二仙湯加減方在SCI治療中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)二仙湯加減方劑中的川芎、當(dāng)歸、丹參、香附、延胡索、淫羊藿、郁金等關(guān)鍵活性成分可能通過(guò)AKT1、MAPK3、NFKBIA、FOS、PIK3CG等關(guān)鍵基因介導(dǎo)cAMP、PI3K/AKT、MAPK、TNF等信號(hào)通路，起到治療SCI的目的。但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，二仙湯加減采用顆粒包裝開(kāi)水沖服的方法，是否丟失了熬藥時(shí)藥物成分之間的交互作用，無(wú)從得知，仍需要進(jìn)一步研究。