姚 璇 時 晶 王 旭 倪敬年 魏明清 李 婷 田金洲

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一種以記憶力減退、認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，至今尚無理想的治療方法。目前美國食品藥品管理局批準的5種治療AD的藥物，4種是膽堿酯酶抑制劑，第5種是NMDA受體阻滯劑，它們只能短期改善癥狀，但不能延緩疾病進展[1]。AD的新藥仍在不斷研發(fā)過程中，候選藥物多針對單一靶標或單一疾病相關(guān)途徑，至今未取得突破性成果[2]。AD是一種復(fù)雜的疾病，存在多個層次相互作用(基因、蛋白、細胞器、細胞、組織、整個機體、外環(huán)境)，因此藥物-蛋白作用的網(wǎng)絡(luò)模型更優(yōu)于線性的藥物-蛋白模型，是AD藥物研發(fā)的新思路[3-4]。

中醫(yī)認為，AD的發(fā)生與腎虛有密切關(guān)系，腎虧之年，精髓乏源，髓海失養(yǎng)，神機失用，發(fā)為癡呆。同時老年臟腑虛衰，生理或病理產(chǎn)物不能及時排除，蓄積體內(nèi)，生痰生瘀，痰濁蒙殼、瘀阻腦絡(luò)，使腦氣與臟器不相連接，神機失用，便發(fā)癡呆。中藥防治AD取得一定療效，田金洲教授臨床治療AD取得一定療效，其團隊歷時24個月的研究表明，中藥聯(lián)合AD常規(guī)治療患者MMSE評分顯著優(yōu)于AD常規(guī)治療[5]。其中藥方劑的核心藥物組成：人參、淫羊藿、遠志、郁金已申請通過國家專利(專利號：ZL2008100067.33.0)，命名為補腎方。補腎方治療AD的生物學(xué)基礎(chǔ)與分子機制尚待進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是人工智能和大數(shù)據(jù)時代背景下一門新興、交叉、前沿的學(xué)科，已被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域，其系統(tǒng)性及整體性的研究特點，在一定程度上解決了單靶點機制通路的研究方法難以解釋中藥多成分、多靶點協(xié)同作用的問題，使中藥藥物研發(fā)具有可預(yù)測性，為中醫(yī)從經(jīng)驗醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化為循證醫(yī)學(xué)提供新的范例[6-7]。據(jù)此，本研究根據(jù)世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會發(fā)布的Network Pharmacology Evaluation Method Guidance-Draft[8]，探討補腎方治療AD的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 補腎方主要活性化合物的篩選及作用靶點的確定 本研究依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和中藥分子機制生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org)檢索人參、淫羊藿、郁金、遠志的主要活性化合物。本研究設(shè)置口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18對化合物進行篩選。利用數(shù)據(jù)庫查詢主要活性化合物的作用靶點，其中BATMAN-TCM分析平臺靶點獲取設(shè)置條件閾值(Prediction Score Cutoff)>20。隨后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://uniprot.org/)將靶蛋白名轉(zhuǎn)換為標準基因名，得到化合物對應(yīng)關(guān)鍵靶點的基因。

1.2 阿爾茨海默病靶點的收集及潛在靶點預(yù)測 使用GeneCard(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer Diease”為關(guān)鍵詞檢索AD相關(guān)基因，該庫集成了約150個網(wǎng)絡(luò)來源的基因數(shù)據(jù)，每個基因名稱有AD相關(guān)證據(jù)，Score值越高則代表靶點與疾病關(guān)系越密切，根據(jù)經(jīng)驗，若靶點過多，設(shè)置Score>30。使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具,將藥物預(yù)測的靶點與疾病的靶點進行映射，獲得補腎方治療AD的潛在靶點。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)、藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物和疾病相映射得到的48個交集基因在STRING平臺進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2得到PPI網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點越大，顏色越深，表明度值越大，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。

將潛在靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)構(gòu)建靶標PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.1軟件(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶點功能富集分析 將核心靶點基因進行功能富集和主要作用通路分析，使用Metascape平臺(https://metascape.org/)，以P<0.01進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，篩選排名靠前的生物過程和通路，并對富集分析結(jié)果進行可視化處理。GO注釋分析是指通過相同的語義描述基因生物學(xué)功能的項目，包含細胞成分(Cell Components，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)和生物過程(Biological Process，BP)3部分。

2 結(jié)果

2.1 補腎方主要活性化合物及其作用靶點 按照篩選條件，得到人參化學(xué)成分22個，淫羊藿化學(xué)成分23個，郁金化學(xué)成分15個，遠志化學(xué)成分31個。刪除重復(fù)、冗雜以及未找到靶點的化合物，最終共獲得45個化合物，利用數(shù)據(jù)庫查詢主要化合物調(diào)控的靶點信息，共篩選出對應(yīng)的作用靶點397個。最后通過Uniprot對靶點和基因信息進行標準化。

2.2 補腎方治療AD的潛在靶點 從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到AD的潛在靶點，根據(jù)經(jīng)驗設(shè)置Score>30的靶點為AD的潛在靶點，共得到282個靶點。運用Venny 2.1在線工具，將補腎方主要活性成分調(diào)控的靶點與AD的疾病靶點取交集，最終得到交集靶點48個。見圖1。

圖1 補腎方-阿爾茨海默病靶點韋恩圖

2.3 補腎方治療AD潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)包含48個節(jié)點和513條邊，其中節(jié)點表示蛋白，度值表示連接到1個節(jié)點的線條數(shù)。靶蛋白平均節(jié)點度值為21.4，超過平均度值的靶點26個。AKT1、IL-6、CASP3、TNF、TP53、VEGFA、MAPK1、PTGS2、IL1B、CCL2、EGF、APP、CXCL8度值顯著高于其余靶點，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著重要的聯(lián)系作用。其中，AKT1的節(jié)點最大，顏色最深，可能是補腎方治療AD最主要的潛在靶點。見圖2。

圖2 補腎方與AD交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)包含30個化合物，48個靶點，1個疾病。紅色節(jié)點代表疾病，藍色代表靶點，橙色代表藥物名稱，淡黃色代表人參的活性成分，淡綠色代表淫羊藿的活性成分，淡紫色代表遠志的活性成分，淡藍色代表人參與淫羊藿共有的活性成分，淡粉色代表郁金與人參共有的活性成分，每條邊表示化合物和靶點之間相互作用的關(guān)系。根據(jù)節(jié)點度值等網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)特征進行核心節(jié)點的篩選。結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、脫水淫羊藿素、人參皂苷等化合物在整個網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可能是補腎方治療AD的核心化合物。見圖3。藥物、成分對應(yīng)標記名稱見表1。

表1 補腎方主要成分

圖3 藥物-化合物-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點通路分析 通過Metescape數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析，得到BP條目1 077條(P<0.05)。其中，神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程(Neurotransmitter metabolic process)、細胞因子介導(dǎo)信號通路(Cytokine-mediated signaling pathway)、對無機物的反應(yīng)(Response to inorganic substance)、對脂多糖的反應(yīng)(Response to lipopolysaccharide)、細胞增殖的負調(diào)節(jié)(Negative regulation of cell proliferation)、小分子代謝過程的調(diào)節(jié)(Regulation of small molecule metabolic process)、管制囊泡介導(dǎo)的運輸細胞遷移的積極調(diào)節(jié)(Regulation of vesicle-mediated transport)、細胞對有機循環(huán)化合物的反應(yīng)(Cellular response to organic cyclic compound)、代謝過程受體(Receptor metabolic process)、細胞對氮化合物的反應(yīng)(Cellular response to nitrogen compound)、細胞對藥物的反應(yīng)(Cellular response to drug)、細胞對氧氣水平的反應(yīng)(Response to oxygen levels)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程(Vascular process in circulatory system)、細胞分化的負調(diào)節(jié)(Negative regulation of cell differentiation)、血管發(fā)育(Blood vessel development)、腺體發(fā)育(Gland development)、化學(xué)突觸傳播的調(diào)節(jié)(Modulation of chemical synaptic transmission)、神經(jīng)元死亡(Neuron death)、細胞黏附調(diào)節(jié)(Regulation of cell adhesion)等BP中，靶點較集中。這提示補腎方活性化合物通過調(diào)控多種生物學(xué)途徑對AD產(chǎn)生影響。將排名前20的GO條目繪制柱狀圖。見圖4。

圖4 補腎方主要成分潛在靶點GO-BP分析

KEGG通路富集分析篩選出128條信號通路(P<0.01)，選取P值較小的16條通路(圖5)。這些基因數(shù)目在IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、結(jié)核病(Tuberculosis)、腫瘤(Pathways in cancer)、流體剪切應(yīng)力與動脈硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、血清素能突觸(Serotonergic synapse)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、核因子κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)(Intestinal immune network for IgA production)等通路上富集較多。將排名前16的KEGG條目繪制柱狀圖。見圖5。

圖5 補腎方主要成分潛在靶點KEGG分析

3 討論

補腎方由淫羊藿、人參、遠志、郁金4味中藥組成，將補腎、益氣、化痰、活血治法中各具代表性的中藥組成本方，具有標本兼治，扶正祛邪的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，補腎方能改善AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶行為，減輕AD病理學(xué)改變、膽堿酯酶、糖原核酶激酶3β表達水平，提高蛋白磷酸酶2A表達水平，改善突觸結(jié)構(gòu)，增加腦內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運、調(diào)控胰島素信號通路[9-14]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建補腎方的“藥物-化合物-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，得到29個活性化合物，48個潛在靶點，188條潛在通路，進一步挖掘補腎方的潛在作用靶點，與實驗研究相互補充驗證。

本研究篩選出幾個重要成分，在活性化合物中，槲皮素綜合評分遠高于其他化合物，存在于淫羊藿中。槲皮素是一種黃酮類化合物，在神經(jīng)退行性疾病中具有神經(jīng)保護作用。槲皮素對AD的神經(jīng)保護作用包括拮抗β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的毒性作用，一項體外研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素抑制Aβ纖維聚集并破壞成熟的纖維[15]；使用槲皮素預(yù)處理過的原代海馬神經(jīng)元，Aβ1-42的神經(jīng)毒性作用更小[16]。槲皮素可能通過PI3K/AKT/GSK3β通路抑制Tau過度磷酸化，減輕神經(jīng)病理[17]。槲皮素具有抗神經(jīng)炎癥的作用，能下調(diào)衰老小鼠海馬組織炎癥介質(zhì)表達水平，改善小鼠空間學(xué)習(xí)能力[18]。此外既往研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素能保護神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和興奮性毒性的損害,改善膽堿能功能并在AD中起神經(jīng)保護劑等作用[19-20]。山柰酚存在于人參和淫羊藿中，作為另一種黃酮類化合物，其能降低AD模型果蠅氧化應(yīng)激水平和乙酰膽堿酯酶活性，可能對AD治療有一定作用[21]。木犀草素是一種植物雌激素，研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素對Aβ25-35損傷PC12細胞具有保護作用[22]。

將補腎方主要活性成分調(diào)控的靶點與AD的治療靶點取交集，得到48個關(guān)鍵靶點，其中AKT1度值最大，可能是補腎方治療AD最主要的潛在靶點。AKT1基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1，在蛋白質(zhì)合成通路、細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。AKT1中的rs2498786啟動子多態(tài)性與患有2型糖尿病及不患有2型糖尿病的中國漢族人群AD發(fā)病風(fēng)險有關(guān)[23]。AKT1參與特定區(qū)域(AT100表位)的tau磷酸化[24]。AKT通過介導(dǎo)的信號通路AKT/GSK3β在AD發(fā)病中發(fā)揮作用[25]。既往研究發(fā)現(xiàn)補腎方中的成分可能通過作用于AKT1，調(diào)節(jié)其下游蛋白糖原合酶激酶3(Glycogen Synthase Kinase-3，GSK-3)，從而抑制Aβ沉積及神經(jīng)纖維纏節(jié)的形成，從疾病通路的上游進行干預(yù)，保護神經(jīng)元免于凋亡[26-27]。

GO功能富集分析得到生物過程GO條目1 077個(P<0.01)，KEGG通路富集分析篩選得到128條信號通路(P<0.01)。GO富集分析涉及神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程、細胞因子介導(dǎo)信號通路、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、化學(xué)突觸傳播的調(diào)節(jié)、神經(jīng)元死亡等生物過程。

KEGG通路富集分析顯示，潛在靶點主要參與的流體剪切應(yīng)力與動脈硬化通路、胰島素抵抗通路等，與現(xiàn)有的AD發(fā)病機制報道相吻合。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可從外周穿越血腦屏障，介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間傳遞，調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞代謝，以及大腦中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[28]。因此，作用于胰島素抵抗通路是防治AD的新策略。研究表明，鼻內(nèi)胰島素給藥可改善2型糖尿病患者、肥胖患者或健康人群的記憶力及其他認知功能。補腎方中的成分可能作用于胰島素抵抗通路防治AD[29-31]。

動脈粥樣硬化是一種慢性綜合征，會影響血管(包括腦血管)結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而導(dǎo)致腦血管功能障礙[32]。研究發(fā)現(xiàn)，在Aβ沉積、tau過度磷酸化、神經(jīng)元損傷這些AD經(jīng)典的病理特征出現(xiàn)之前，AD早期就出現(xiàn)神經(jīng)血管功能障礙[33]。由于神經(jīng)血管功能紊亂，腦血流對神經(jīng)活動調(diào)節(jié)受損，從而導(dǎo)致神經(jīng)活動與所需要的氧氣和葡萄糖供應(yīng)不相匹配，因此腦功能受損，臨床表現(xiàn)為認知功能下降。補腎方可能通過流體剪切應(yīng)力與動脈硬化通路調(diào)節(jié)腦血流量，保護腦血管，從而對疾病的早期進行干預(yù)。

另外，其他通路也發(fā)揮著重要作用，例如HIF-1信號通路參與調(diào)解AD病情中的氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙[34]。血清素能突觸通路參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒、睡眠等多個生理過程，與AD密切相關(guān)[35]。

以上分析了補腎方治療AD有效成分及作用靶點、信號通路?？梢钥闯?，補腎方治療AD形成多靶點、多通路、多途徑協(xié)同作用網(wǎng)絡(luò)，并且可以推測槲皮素、山柰酚、木犀草素、脫水淫羊藿素、人參皂苷是其中重要的有效成分。AKT1、IL-6、CASP3、TNF、TP53是其比較重要的作用靶點。相關(guān)干預(yù)AD通路的機制主要包括：下調(diào)神經(jīng)炎癥反應(yīng)、防止蛋白質(zhì)錯誤折疊、改善血管神經(jīng)功能障礙、影響神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)節(jié)細胞代謝及線粒體功能等，并可以在疾病的早期、信號通路的上游進行干預(yù)。但由于目前對槲皮素、山柰酚、木犀草素的研究相對較多，因此本研究在線工具數(shù)據(jù)分析的結(jié)果可能出現(xiàn)一些偏倚，導(dǎo)致一些更重要的成分或者信號通路或許未能顯示[36]。由于中藥方劑不是化學(xué)成分的簡單疊加，藥效受中藥成分含量的影響，且中醫(yī)講究辨證論治，目前疾病靶點數(shù)據(jù)庫是針對西醫(yī)疾病名稱，而不是中醫(yī)病證，因此本研究具有一定局限性[37]。

綜上所述，本研究從系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的角度探究補腎方治療阿爾茨海默病的機制，為進一步實驗研究奠定基礎(chǔ)，但需要今后進一步研究與驗證。