李萌，孫金倉(cāng)健，劉敏，文衛(wèi)平,2

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉科 中山大學(xué)耳鼻咽喉科研究所，廣東 廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院 耳鼻咽喉科，廣東 廣州 510655)

耳聾是最常見(jiàn)的感覺(jué)功能障礙性疾病之一，新生兒中的發(fā)病率約1‰～3‰。耳聾病因復(fù)雜，約60%與遺傳因素相關(guān)[1]。遺傳性耳聾是一種高度異質(zhì)性的疾病，根據(jù)是否伴有其他系統(tǒng)疾病可分為綜合征型耳聾(30%)和非綜合征型耳聾(70%)。非綜合征型耳聾更為常見(jiàn)，其中75%～80%表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，多表現(xiàn)為先天性極重度感音神經(jīng)性聾[2]。MYO7A基因位于染色體11q13.5，編碼由2 215個(gè)氨基酸構(gòu)成的非常規(guī)肌球蛋白ⅦA，廣泛表達(dá)在視網(wǎng)膜上皮和內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛束中[3]。MYO7A基因變異所致耳聾表型具有高度的異質(zhì)性，既可導(dǎo)致超過(guò)50%的1型Usher綜合征型耳聾[4]，也可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性耳聾11型(deafness，autosomal dominant 11， DFNA11)[5]和常染色體隱性遺傳性耳聾2型(deafness，autosomal recessive 2， DFNB2)[6]。

MYO7A基因自1996年報(bào)道至今，已被證實(shí)有500多個(gè)突變位點(diǎn)與遺傳性耳聾相關(guān)[7]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序?qū)σ粋€(gè)先天性耳聾家系進(jìn)行基因型與表型分析，發(fā)現(xiàn)該家系的可能致聾突變?yōu)镸YO7A未曾報(bào)道的復(fù)合雜合突變NM_000260.3:c.765C>A(p.F255L)和c.275_278dupACCT(p.I94fs)，兩個(gè)突變位點(diǎn)均為首次報(bào)道的MYO7A新的變異位點(diǎn)，豐富了MYO7A基因的變異譜，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為一個(gè)常染色體隱性遺傳的核心家系，包括2代4人，3名正常人，1例耳聾患者(家系先證者Ⅱ-2)。先證者為1歲11月女童，因發(fā)現(xiàn)對(duì)聲音反應(yīng)差1年余，就診于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科門(mén)診，經(jīng)詳細(xì)聽(tīng)力學(xué)檢查確診為雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，并行耳聾基因檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料采集 本次研究獲得中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，家系成員均簽署知情同意書(shū)，未成年成員由家長(zhǎng)代為簽署。由我科2名副主任以上醫(yī)師對(duì)家系成員進(jìn)行了詳盡的病史采集和全身體格檢查，并填寫(xiě)了耳聾信息調(diào)查表，排除藥物、噪聲及其它因素造成的耳聾，對(duì)先證者父母及姐姐(6歲女童)進(jìn)行了純音聽(tīng)閾和聲導(dǎo)抗測(cè)試，對(duì)先證者進(jìn)行了聲導(dǎo)抗、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission，DPOAE)，聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)，多頻穩(wěn)態(tài)(auditory steady-state response，ASSR)及顳骨高分辨CT以及中內(nèi)耳MRI檢查。采集家系成員外周血5 mL用以提取外周血DNA并進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.2 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析 高通量測(cè)序由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成，對(duì)遺傳性耳聾518個(gè)相關(guān)基因的全部外顯子及剪接區(qū)進(jìn)行靶向捕獲測(cè)序。將家系先證者Ⅱ-2基因組DNA片段化(180-280bp)，制備DNA文庫(kù)，通過(guò)基因芯片對(duì)目標(biāo)基因外顯子及鄰近剪接區(qū)DNA進(jìn)行捕獲和富集，使用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量、高深度測(cè)序(平均測(cè)序深度200×)。

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估，將符合標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組(GRCh37/hg19)上，檢測(cè)樣本的變異信息，并對(duì)變異數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和注釋。通過(guò)基因組分析工具包(genome analysis toolkit,GATK)來(lái)檢測(cè)分析單核苷酸變異(single-nucleotide variants，SNV)和InDel變異，使用CNVnator v0.2.2軟件分析發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNVs)，利用ANNOVAR軟件對(duì)變異信息進(jìn)行注釋，包含dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、1 000 g數(shù)據(jù)庫(kù)、國(guó)家心肺和血液研究所外顯子組測(cè)序計(jì)劃(NHLBI-ESP project，esp6500si_all數(shù)據(jù)庫(kù))、外顯子組聚集聯(lián)盟(Exome aggregation consortium,ExAC)和其他已有的數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息(clinvar，HGMD等)，注釋內(nèi)容涵蓋變異的位置信息，類型，保守性預(yù)測(cè)等。過(guò)濾已報(bào)道的單核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism，SNP)，同義變異(文獻(xiàn)報(bào)道的致病變異除外)，以及正常人數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率>0.01的變異(GJB2和SLC26A4除外)。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 使用UCSC在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://genome.ucsc.edu/) 查詢變異位點(diǎn)附近的參考序列并以此為DNA模板，使用Primer3在線引物設(shè)計(jì)軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增包含變異位點(diǎn)的DNA片段，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的豐度和特異性，將符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，驗(yàn)證變異位點(diǎn)，并在家系內(nèi)進(jìn)行基因型與表型分析。

2 結(jié)果

2.1 家系遺傳特征及臨床表型分析

該家系為一個(gè)兩代常染色體隱性遺傳核心小家系(圖1)，未訴家族耳聾病史，包含1例耳聾患兒(Ⅱ-2)，1名具有正常聽(tīng)力表型的子代(Ⅱ-1)和雙親(Ⅰ-1、Ⅰ-2)。Ⅱ-2出生時(shí)聽(tīng)力篩查結(jié)果不詳，家長(zhǎng)未訴眼科相關(guān)異常，體格檢查及生長(zhǎng)發(fā)育未見(jiàn)明顯異常，無(wú)特殊用藥史、外傷及噪音暴露史，視力、視野及眼底檢查不能配合。聲導(dǎo)抗示雙耳A型曲線，DPOAE雙耳各頻率未引出，ABR及ASSR示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾。乳突HRCT及中內(nèi)耳MRI未見(jiàn)明顯異常。Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ-1體格檢查及眼科檢查(視力、視野、眼底)均未見(jiàn)明顯異常，聲導(dǎo)抗均為A型曲線，純音聽(tīng)閾測(cè)試聽(tīng)力正常。

圖1 家系圖 黑色箭頭標(biāo)注成員為家系先證者；*標(biāo)注成員進(jìn)行高通量測(cè)序

2.2 基因變異檢測(cè)

高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者M(jìn)YO7A基因存在NM_000260.3:c.765C>A(p.F255L)和c.275_278dupACCT(p.I94fs)2個(gè)候選致病變異。經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證示c.765C>A突變遺傳自父親，c.275_278dupACCT遺傳自母親，先證者姐姐為c.765C>A雜合攜帶，在家系中耳聾表型與MYO7A基因型共分離(圖1、2)。

2.3 MYO7A基因變異致病性分析

c.275_278dupACCT為移碼突變，在HGMD、esp6500si_all、1 000g數(shù)據(jù)庫(kù)、gnomAD_all、ExAC_all、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中均未見(jiàn)收錄(PM2)，導(dǎo)致翻譯蛋白氨基酸序列自94位開(kāi)始移碼并提前終止(圖3、4)，該變異預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生截短而失去正常功能(PM4)，依據(jù)ACMG變異分類指南[8-9]，該變異為致病性變異(PM2+PM4)。

c.765C>A為錯(cuò)義突變，僅在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄(rs782702948)，為超稀有變異(PM2)；多個(gè)變異有害性預(yù)測(cè)軟件[SIFT、PolyPhen2、Provean、LRT and CADD (the combined annotation dependent depletion)]預(yù)測(cè)均為有害或致病性(PP3)(圖4)；該變異位于明確缺少良性變異的功能結(jié)構(gòu)域中，位于變異熱點(diǎn)區(qū)域(PM1)(圖3)；經(jīng)分析該家系成員的基因檢測(cè)結(jié)果與臨床表型符合基因型-表型共分離PP1-S(PS)，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)變異分類指南綜合分析，c.765C>A可判為可能致病性變異[PM1+PM2+ PP1-S(PS)+PP3]。

3 討論

MYO7A具有高度的遺傳異質(zhì)性和基因多效性。MYO7A基因突變既可導(dǎo)致非綜合征型耳聾(DFNA11和DFNB2)，也可引起同時(shí)伴有內(nèi)耳和視網(wǎng)膜病變的綜合征型耳聾(Usher綜合征1型)。DFNA11的主要臨床表現(xiàn)為遲發(fā)性、漸進(jìn)性語(yǔ)后聾；DFNB2常表現(xiàn)為重度或極重度的語(yǔ)前或語(yǔ)后聾；Usher綜合征1型為常染色體隱性遺傳，主要臨床表現(xiàn)為先天性重度或極重度感音神經(jīng)性聾，早發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性，還常合并前庭功能異常[7]。本次研究的核心家系，雙親和姐姐表型正常，無(wú)聽(tīng)力和視覺(jué)障礙，無(wú)頭暈、耳鳴主訴，先證者為1歲11個(gè)月女童，雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，言語(yǔ)發(fā)育差，視力、視野及眼底等眼科檢查因患兒年幼不能配合而尚不明確，該家系為常染色體隱性遺傳方式，尚不能排除Usher綜合征型耳聾。

MYO7A基因位于染色體11q13.5(圖3)，于1995年由Wei等首次報(bào)道，包含49個(gè)外顯子，編碼2 215個(gè)氨基酸組成的蛋白MyosinⅦA，屬于肌球蛋白家族成員，MyosinⅦA為馬達(dá)蛋白，具有ATP酶活性，能夠利用水解ATP產(chǎn)生的能量與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，并沿著肌動(dòng)蛋白絲運(yùn)動(dòng)[10]。MyosinⅦA蛋白結(jié)構(gòu)包含3個(gè)重要區(qū)域(圖3)：①氨基末端的馬達(dá)區(qū)域，主要功能是水解ATP并產(chǎn)生動(dòng)能，與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，是肌球蛋白的核心功能區(qū)域；②頸部的調(diào)節(jié)區(qū)，與肌球蛋白輕鏈結(jié)合形成異亮氨酸-谷氨酰胺基序；③尾端的羧基末端，主要作用為調(diào)節(jié)MYO7A運(yùn)動(dòng)，包括SH3結(jié)構(gòu)域、2個(gè)FERM結(jié)構(gòu)域和2個(gè)MyTH4結(jié)構(gòu)域[11]。MyosinⅦA蛋白在內(nèi)耳和視網(wǎng)膜均表達(dá)，內(nèi)耳中主要分布在毛細(xì)胞靜纖毛、細(xì)胞體和表皮板，對(duì)維持毛細(xì)胞機(jī)械電轉(zhuǎn)換通道的緊張度必不可少，還影響毛細(xì)胞靜纖毛的形態(tài)和功能[12]，因此，蛋白功能的改變將導(dǎo)致不同程度的聽(tīng)覺(jué)及前庭功能障礙[13]。目前已報(bào)道500余個(gè)MYO7A致聾

圖2 MYO7A c.275_278dupACCT (a)和c.765C>A (b)在家系成員中的Sanger測(cè)序圖

圖3 MYO7A基因結(jié)構(gòu)及p.I94和p.F255兩個(gè)突變?cè)贛yosinⅦA蛋白結(jié)構(gòu)示意圖中的位置

圖4 多個(gè)物種間MYO7A基因突變位點(diǎn)氨基酸序列保守性分析

本研究通過(guò)對(duì)先證者行高通量測(cè)序，靶向518個(gè)耳聾相關(guān)基因的全部外顯子及剪接區(qū)發(fā)現(xiàn)先證者的MYO7A基因存在NM_000260.3:c.765C>A(p.F255L)和c.275_278dupACCT(p.I94fs)兩個(gè)突變位點(diǎn)。通過(guò)Sanger測(cè)序在家系中進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)先證者為c.765C>A和c.275_278dupACCT復(fù)合雜合突變，突變分別來(lái)自父親和母親，姐姐攜帶c.765C>A突變，變異在家系中與表型共分離(圖1、2)。c.275_278dupACCT為移碼突變，未在人群及相關(guān)臨床病例中報(bào)道過(guò)，導(dǎo)致編碼氨基酸序列自94位開(kāi)始移碼并提前終止，預(yù)計(jì)會(huì)使MyosinⅦA蛋白出現(xiàn)截短而失去正常功能，依據(jù)ACMG變異分類指南，該變異為致病性變異(PM2+PM4)。c.765C>A為錯(cuò)義突變，也未在人群及相關(guān)臨床病例中報(bào)道過(guò)，變異位于蛋白的馬達(dá)區(qū)域(圖3)，序列在多個(gè)物種中高度保守(圖4)，為該基因的變異熱點(diǎn)區(qū)域，多個(gè)變異有害性預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)變異會(huì)影響蛋白功能，并在家系中與表型共分離，根據(jù)ACMG變異分類指南綜合分析，c.765C>A可判為可能致病性變異(PM1+PM2+ PP1-S(PS)+PP3)。綜合以上高通量測(cè)序、變異致病性分析以及基因型-表型驗(yàn)證，c.765C>A和c.275_278dupACCT可能是MYO7A基因的新致病位點(diǎn)，目前在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未報(bào)道。本次研究豐富了我國(guó)遺傳性耳聾的基因變異譜，為遺傳性耳聾的診斷、產(chǎn)前咨詢提供了新的參考。

該患兒為極重度感音神經(jīng)性聾，言語(yǔ)發(fā)育差，乳突HRCT及中內(nèi)耳MRI未見(jiàn)明顯異常，在我院已行右側(cè)人工耳蝸植入術(shù)，術(shù)中監(jiān)測(cè)示右耳神經(jīng)反應(yīng)遙測(cè)技術(shù)反應(yīng)好，術(shù)后患兒正常開(kāi)機(jī)，并按計(jì)劃進(jìn)行聽(tīng)力及言語(yǔ)康復(fù)中。因此，建議對(duì)此型基因變異患兒盡早行人工聽(tīng)覺(jué)干預(yù)，以促進(jìn)聽(tīng)力及言語(yǔ)康復(fù)?，F(xiàn)患兒年幼無(wú)法配合眼底及視野檢查，眼部情況尚不明確，不能排除Usher綜合征，建議對(duì)該患兒的視力、視野及眼底情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并及時(shí)干預(yù)保護(hù)患兒視力。遺傳性耳聾致病基因檢測(cè)和診斷技術(shù)的發(fā)展，不僅能夠從基因型的角度預(yù)測(cè)臨床表型，指導(dǎo)臨床診治；而且能夠?qū)z傳性耳聾家庭提供遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及出生干預(yù)，有效避免再次生育耳聾患兒，對(duì)遺傳性耳聾的三級(jí)預(yù)防具有重要指導(dǎo)意義。