張勇，張婷，王志頤，吳明海，季俊峰，陳仁杰， 陳偉

(1.南京醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,江蘇 南京 210031； 2.解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，江蘇 南京 210002； 3.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，江蘇 南京 210003)

變應性鼻炎(allergic rhinitis,AR)和變應性哮喘(allergic asthma,AS)都是臨床常見病，兩種疾病分屬耳鼻咽喉科和呼吸科，兩者發(fā)病機制及病理生理具有極大相似性，且兩種疾病中任何一種的控制對另一種疾病均有正性作用，因此現在很多基礎研究及臨床治療均將兩者視作一個整體，也就有了變應性氣管炎癥(allergic airway inflammation,AAI)的概念[1]。理想的AAI模型是制備動物的單一模型能夠產生我們需要的所有反應。目前國內外建立AAI動物模型的種類繁多，方法各異，劑量懸殊，給研究者帶來不必要的麻煩。小鼠的基因組背景純凈，品系豐富，生物學試劑及抗體完備且性價比高，藥物干預試驗因小鼠重量輕可減少藥物用量從而節(jié)省經費，且可復制出經典的AR、AS模型的氣管慢性炎癥、氣管高反應性、黏液分泌增多等表現[2]。小鼠具有體積小，操作及取材較困難，造模需要多次致敏和激發(fā)等缺點，但目前仍為AR、AS研究最為常用的動物模型[3]，為此我們以小鼠為實驗動物建立AAI模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和致敏試劑

6～8周齡SPF級雌性Balb/c小鼠16只，體重16.4～23.3 g，購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心，并由其代為飼養(yǎng)。在環(huán)境室溫(22±2)℃飼養(yǎng)，同時避免變應原存在，早晚12 h間斷照明。實驗前，動物在標準環(huán)境下飼養(yǎng)1周。實驗過程中，動物自由進水、飲食。卵白蛋白(ovalbumin，OVA，美國 Sigma公司，V級)及氫氧化鋁凝膠[Al(OH)3，美國Sigma公司，13 mg/mL]。

1.2 儀器和材料

超聲霧化吸入器(德國PARI BOY N公司產品)、離心機(德國eppendorf centrifuge 5417R)、秒表、顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、數碼相機、酶標儀(美國BIO-RAD 680型)。

1.3 變應性氣管炎癥動物模型制備

將16只小鼠隨機分為模型組(A組)和空白對照組(B組)，每組各8只。在參考國內外造模方法及前期預實驗基礎上，我們摸索出造模方法如下：A組將40 μg OVA+200 mg Al(OH)3+200 μL PBS溶液，分別于第1、3、5、7、9、11、13天早晨08:00腹腔注射，共7次，其后觀察1周，從第20天起以10 μL OVA(1 mg/mL)滴鼻激發(fā)，每周3次，連續(xù)3周，最后1次滴鼻激發(fā)后24 h以2%OVA 5 mL霧化吸入激發(fā)，連續(xù)5 d。對照組以0.9%生理鹽水代替OVA。整個造模周期為42 d(圖1),建模期間小鼠置于標準環(huán)境下飼養(yǎng)，每天觀察動物的飲食、精神狀況及鼻、肺部癥狀和體征。

1.4 模型的檢測和確認

1.4.1 癥狀學觀察 末次激發(fā)后，用數碼相機記錄10 min，分析其癥狀并疊加法計分，總分大于5分即為造模成功。AR癥狀積分主要觀察小鼠鼻癢、噴嚏、流涕3個方面(表1)[4]。AS積分:出現明顯呼吸急促、咳嗽、腹肌收縮、口唇發(fā)紺等說明肺部哮喘癥狀出現。根據輕重緩急分為4級[5]：1級為無反應；2級為呼吸困難；3級為咳嗽；4級為休克死亡。

圖1 小鼠AAI模型制作流程圖

表1 小鼠鼻部癥狀評分表

1.4.2 體液檢查 各組動物均在最后1次激發(fā)后24 h，腹腔注射過量1%水合氯醛麻醉。將小鼠取頭低腳高位30度，切開氣管，插入靜脈留置針套管并向頭端抵至鼻咽部(圖2)，取1 mL 4 ℃ PBS液行鼻腔灌洗，反復3次，在鼻部下方收集灌洗液。鼻灌洗液收集畢，左心室取血約0.7 mL并靜置于0 ℃環(huán)境(圖3)。取血畢，將小鼠放平，結扎右肺行病理檢查，取1 mL PBS液經氣管向左肺灌洗，灌洗液每次置留3 min，反復3次(圖4)。將血液、鼻、肺灌洗液在4 ℃恒溫離心機2 000 rpm的條件下離心10 min，取上清液置于-70 ℃環(huán)境中待檢。

1.4.3 OVA特異性IgE的檢測 采用小鼠OVA specific IgE ELISA 試劑盒(Catalog No.E-EL-M0869c,Elabscience)測定,其檢測OVA sIgE的靈敏度為0.94 ng/mL,檢測濃度下限為1.56 ng/mL,上限為100 ng /mL。實驗嚴格按照產品說明書操作程序進行。

1.4.4 組織病理學檢查 將小鼠鼻及鼻竇組織整體及右肺取下用4%中性甲醛固定24 h，鼻組織置于中性EDTA脫鈣約35～45 d，然后用梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。3 μm連續(xù)切片(軸平面)，行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)及阿辛蘭-過碘酸-希夫(alcian blue-periodic acid-Schiff,AB-PAS)染色。每只實驗小鼠光學顯微鏡下觀察(每張切片隨機觀察5個視野,取平均值)行組織病理學分析，記錄單位視野下嗜酸性粒細胞(eosinphil,EOS)數目及1 000 μm長黏膜的杯狀細胞數。另外，根據在光鏡下觀察到的病理征象，記錄黏膜纖毛缺失程度，將上皮細胞狀態(tài)分4級：0級為纖毛上皮無損傷，纖毛完整；1級為纖毛缺失，無上皮細胞剝脫；2級為上皮細胞剝脫但未至基底膜；3級為上皮細胞全部剝脫，基底膜暴露。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況及肉眼觀察

本實驗過程中小鼠基本能夠耐受本實驗方案所給予的OVA劑量。第1次激發(fā)后，部分小鼠即出現抓鼻、流涕、噴嚏等癥狀，隨著激發(fā)次數的增加，出現呼吸急促、全身瘙癢等癥狀，激發(fā)停止后，癥狀逐漸緩解。整個實驗過程未出現死亡現象。采集標本時鼻、肺組織標本肉眼觀察兩組間無差異。

2.2 癥狀學觀察

鼻、肺部癥狀按照評分標準，A組8只小鼠在激發(fā)后10 min內鼻部癥狀積分全部都滿足AR標準，均值為(7.88±0.84)分，與對照組(1.01±0.76)分比較，差異具有統計學意義(t=17.27，P<0.01)。肺部癥狀方面：A組8只全部出現明顯呼吸急促、咳嗽、腹肌收縮癥狀，有2只出現口唇發(fā)紺，癥狀更為明顯，與對照組比較有統計學差異(P<0.01)。見表2。

表2 兩組小鼠在OVA末次激發(fā)后的肺部癥狀表現 (只)

圖2 鼻灌洗液采集示意圖 圖3 左心室取血示意圖 圖4 左肺灌洗示意圖

2.3 體液檢查

A組鼻、肺灌洗液及血清中OVA sIgE的濃度分別為(55.24±7.12) ng/mL、(36.73±4.88)ng/mL、(81.19±5.27)ng/mL，B組分別為(4.61±1.97)ng/mL、(1.73±0.77)ng/mL、(4.14±2.17)ng/mL，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 兩組小鼠體液OVA sIgE濃度比較

2.4 組織病理學檢查

A組鼻和肺上皮層黏膜纖毛損傷(1級和2級)百分比明顯高于B組(表4、5，P<0.01)。但鼻、肺部損傷三級所占比例兩組間并沒有顯著性差異(P>0.05)。

鼻、肺黏膜EOS浸潤程度及1 000 μm長杯狀細胞計數詳見表6，A組鼻、肺EOS及杯狀細胞計數均較B組有顯著差異(P<0.01)。鼻部整體冠狀切面見圖5，可見到靠近鼻底部的犁鼻器、鼻中隔軟骨、嗅裂、上下鼻甲(小鼠只有上下鼻甲，而不存在中鼻甲及最上鼻甲[6])。A組可見鼻腔，黏膜部分破裂、纖毛結構紊亂，黏膜下組織間質水腫，小血管擴張，血管內及黏膜下組織間隙大量EOS浸潤，且大多集中在鼻中隔的下1/2、鼻腔側壁及鼻底部；嗅區(qū)及鼻底部犁鼻器見大量復層鱗狀上皮附著，但均未見EOS浸潤；黏膜下基底層未見明顯增厚。A組肺組織部分實變，黏膜纖毛部分中斷、破壞，可見血管旁及較大氣道黏膜下EOS浸潤，且較鼻部略嚴重(P<0.05)。B組鼻、肺黏膜纖毛完整，未見炎細胞浸潤，黏膜下層僅偶見少量EOS及其他炎癥細胞。A組鼻、肺黏膜均見杯狀細胞擴大、大量增生，而B組未見相似改變。見圖6～9。A組鼻、肺EOS數目呈顯著正相關(r=0.775,P<0.01)，見圖10；A組鼻、肺黏膜杯狀細胞數也呈正相關(r=0.723,P<0.05)，見圖11。B組鼻、肺部EOS及杯狀細胞均無明顯相關性(P>0.05)。

表4 兩組小鼠鼻黏膜上皮細胞損傷情況比較

表5 兩組小鼠肺黏膜上皮細胞損傷情況比較

表6 兩組小鼠鼻、肺嗜酸性粒細胞及杯狀細胞計數比較 (個，

圖5 小鼠鼻冠狀切面圖 5a：HE ×40； 5b：PAS×40 圖6 鼻腔黏膜病理改變 (HE ×400) 6a：A組； 6b：B組 圖7 肺黏膜病理改變 (HE ×400) 7a：A組； 7b：B組 圖8 鼻腔黏膜病理改變 (PAS ×400) 8a：A組； 8b：B組 圖9 肺黏膜病理改變 (PAS ×400) 9a：A組； 9b：B組

圖10 A組鼻肺部EOS呈正相關 (r=0.775,P<0.01)

圖11 A組鼻肺部杯狀細胞呈正相關 (r=0.723,P<0.05)

3 討論

AR、AS造模途徑多種多樣，AR模型經典的有變應原腹腔注射基礎致敏，滴鼻激發(fā)出鼻部癥狀[7]；AS經典的造模方法為變應原腹腔注射或皮下注射作基礎致敏，霧化吸入激發(fā)出相應的癥狀[8]。本文綜合兩種造模方法，并結合AAI的概念，選擇腹腔注射基礎致敏，滴鼻、霧化吸入激發(fā)的造模方法。

國內外很多文獻報道：設想從變應原及致敏方法兩個角度均模仿人類臨床上可能的發(fā)病機制：如Nabe等[9]利用人類常見的變應原日本花粉作為基礎致敏及激發(fā)物質，通過單純經鼻給藥建立AR模型，但該模型的制作時間長達33周。另外花粉種類繁多，不便于研究者之間的交流；而單純滴鼻致敏、激發(fā)可以引起肺內輕微的EOS浸潤和氣道高反應性，不過這一進程的演變比腹腔注射致敏的方法要慢很多[10]。此外，經鼻給藥絕大部分變應原仍停留于上氣道，如花粉等大分子物質僅0.001%到達下氣道，霧化吸入OVA僅12.2%分布于鼻外其他器官[11]，如肺部5.6%，胃2.8%，滴鼻分布于下氣道的則更少，因此本文選擇OVA作腹腔注射作基礎致敏較為合適，滴鼻、霧化吸入續(xù)貫激發(fā)，保證鼻、肺均能獲得變應原的激發(fā)，從本實驗的結果分析看，該模型可以制造出臨床所需的癥狀，同時免疫學、病理分析均證實了上下氣道的改變?，F分別從癥狀、免疫及病理學3個角度對該模型行進一步論述。

理想的AAI模型需要具備4個條件：速發(fā)相、遲發(fā)相、AHR及炎細胞浸潤[8]。速發(fā)相在激發(fā)后立即發(fā)生，并持續(xù)到2 h左右，3～10 h是遲發(fā)相，遲發(fā)相與AHR是伴隨關系。本實驗模型組激發(fā)前癥狀跟對照組肉眼觀察無明顯區(qū)別，而激發(fā)后很快出現典型的癥狀，如噴嚏、抓鼻、流涕、呼吸急促、咳嗽等，而對照組激發(fā)后無明顯改變，說明基礎致敏已經引起了氣道的慢性炎癥，激發(fā)后能夠快速出現典型癥狀說明該實驗方案能夠實現小鼠從氣道高反應性、氣道梗阻到癥狀期的轉變。

AAI級聯反應最常見的起始步驟是變應原通過sIgE分子與肥大細胞、嗜堿性粒細胞相連，刺激其釋放相關介質如組胺、白三烯和血小板激活因子(PAF)等[12]。速發(fā)相的癥狀主要取決于靶器官的結構如鼻部鼻癢、流涕及鼻塞，肺部的支氣管收縮及喘鳴。遲發(fā)相通過聚集在氣道黏膜表面的EOS、巨噬細胞釋放炎癥前細胞因子，包括Th2型細胞因子GM-CSF、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13等，引起組織局部B細胞釋放IgE，其中IL-5等因子又是強烈的EOS趨化因子，對EOS的增殖、分化、遷移、激活及生存有重要的作用，而IL-4、IL-13可使呼吸道無分泌能力的上皮細胞轉變?yōu)榫哂叙ひ悍置诠δ艿谋瓲罴毎鸞13]，這樣便形成了炎癥的級聯反應和惡性循環(huán)，目前實驗階段已有抗IL-5單克隆抗體(TRFK5)，其抑制黏膜EOS浸潤的能力高達86%[14]。本實驗鼻、肺、血中OVA sIgE的濃度均較對照組明顯升高。AR與AS患者的癥狀通常與循環(huán)血液中IgE的水平呈正相關[15]，且血液中總IgE水平的升高對于非變應性個體同樣是一個危險因素[16]。本造模方法能夠產生OVA sIgE，且鼻、肺灌洗液及血清中的濃度均較對照組明顯升高，說明該模型便于進一步研究，可用OVA sIgE作為炎癥指標，監(jiān)測炎癥狀態(tài)，觀測干預的效果。

黏膜上皮破壞已經被證實是AHR的主要原因[17]。EOS趨化至IgE介導的黏膜炎癥部位并活化是變應性炎癥的顯著特點，其浸潤程度與炎癥的嚴重程度呈正相關[8]。本實驗顯示該模型鼻、肺部EOS浸潤同樣嚴重，說明該造模方法能夠引起上、下氣道的病理改變，其中鼻部改變更明顯一些，這進一步強化了鼻在AAI中的重要性。另外，上下氣道黏膜EOS浸潤程度具有顯著相關性，究其原因可能存在如下聯系:①全身因素[18]：變應原激發(fā)后促使肥大細胞及嗜堿性粒細胞脫顆粒釋放炎癥介質，直接作用于鼻、肺黏膜引起相應癥狀(速發(fā)相)；促使EOS裂解或脫顆粒引起氣道慢性炎癥(遲發(fā)相)；②組織結構因素：上下氣道在黏膜結構、形態(tài)、分布、組織間的連接、黏膜下淋巴結構等方面具有很大的相似性；③解剖因素：上氣道是接受變應原刺激的第一部位，變應原能沿氣管及氣管樹分布；④神經因素[19]：上下氣道的神經聯系，如鼻-肺反射，通過釋放相關神經肽影響下氣道。黏液增多是AAI的另一重要特點。氣道的黏液主要來自黏膜上皮層內的杯狀細胞和黏膜下的黏液腺體，在維持呼吸道的正常生理功能方面發(fā)揮重要作用。黏膜上皮杯狀細胞，多分布于鼻甲，肺部則主要分布于較大支氣管。杯狀細胞增生或化生可以看作是長期的氣道炎癥反應所致的黏膜形態(tài)學的改變，也可以看作是組織重塑的一個顯著變化[20]。Glück 等[21]報道AR患者鼻黏膜刮片中，花粉季杯狀細胞明顯增加。同樣哮喘患者支氣管上皮細胞行定量研究發(fā)現，哮喘組杯狀細胞的數量是正常組的2.5倍，其所含的黏液量是正常組的3倍。本實驗顯示鼻、肺黏膜上皮杯狀細胞的數量約為對照組的6～10倍，證實該模型可引起鼻、肺黏膜上皮杯狀細胞明顯的增生、肥大或化生。

該造模方法無論從癥狀學觀察、免疫學檢測，還是病理學檢查的角度，均符合AAI模型的要求，盡管這些實驗性協議并不能在人體模仿，但是能夠同時產生上、下氣道局部及全身炎癥和免疫反應，為進一步研究AAI奠定了堅實的基礎。進一步完善該模型，通過改變吸入變應原的種類、致敏或激發(fā)時間、小氣道阻力檢測等方面，使其更接近人類AAI疾病，是我們今后努力的方向。