劉博，蒲樂瑩，陶科，金洪，侯太平

（四川大學生命科學學院/生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川成都 610064）

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（Medicago sativa）為多年生豆科牧草，具有營養(yǎng)價值高、適應能力強、適口性好等優(yōu)點，被譽為“牧草之王”，是我國種植面積最大的牧草品種（黃煒和文亦芾，2018）。研究表明，紫花苜蓿在水土保持、土壤改良、植物修復以及他感作用等生態(tài)功能方面發(fā)揮著一定作用（吳開賢和羅富成，2008）。然而，根腐病的發(fā)生成為限制紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一（王梓，2020）。紫花苜蓿根腐病是一種危害嚴重的土傳性根部病害，其病原種類復雜，不同地區(qū)存在差異，但多與鐮刀菌（Fusariumspp.）有關，如尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、變紅鐮刀菌（F.incarnatum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti）等（方香玲等，2019；張園園等，2021）。根腐病可在土壤中快速蔓延，使苜蓿根部腐爛直至中空，側根死亡，分枝減少，固氮和養(yǎng)分吸收能力均受到影響，從而導致牧草產(chǎn)量和質量下降，草地利用年限縮短（潘龍其等，2015；支旭欣，2020）。目前苜蓿根腐病在我國西北、華北和東北的主要苜蓿種植區(qū)大面積發(fā)生，對我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成重大影響（田慧，2021），篩選抗病品種是當前防治該病害的最有效途徑，但需要較長的時間才能發(fā)揮效果（楊劍鋒，2021）。生物防治具有安全、綠色、高效的優(yōu)點（Gouli et al.，2021）。青藏高原地理位置和生態(tài)環(huán)境特殊，可能生活著在基因、代謝等方面產(chǎn)生特有生物學機制的微生物。因此，從青藏高原環(huán)境中篩選易培養(yǎng)、效果好、適應性強的拮抗菌為紫花苜蓿根腐病的生物防治提供了新方向，對苜蓿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前對苜蓿根腐病的控制方法主要有化學農藥防治和篩選抗病品種（李國良等，2019；楊劍鋒等，2020；張園園等，2021）。然而，化學農藥防治存在易殘留、病原菌易產(chǎn)生抗藥性等問題，而篩選抗病品種費時費力，因此學者將目光投向了生物防治。針對苜蓿根腐病拮抗菌的研究已有報道。劉莎莎等（2015）從紫花苜蓿根際土壤中篩選出2株對紫花苜蓿根腐病病原菌具有抑制活性的菌株，經(jīng)鑒定分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CYY-6和短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）CYY-42。張丹（2016）從采集自黑龍江省農業(yè)科學院內的苜蓿植株中分離出綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）等6株內生菌，均對苜蓿根腐病病原菌具有良好的抑制效果。胡進玲等（2017）從紫花苜蓿根部分離出2株內生拮抗菌，分別為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）LYZ0069和卡那霉素鏈霉菌（Streptomyces kanamyceticus）LYZ0133，2株拮抗菌對紫花苜蓿根腐病病原菌及葉片病害病原菌均具有良好的抑制效果。曾亮等（2019）從紫花苜蓿根際土壤中分離篩選出2株拮抗菌，鑒定為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和康寧木霉（T.koningii），對峙法測定結果2株拮抗菌對4種鐮刀菌的抑制率在54.9%～75.3%。駱丹等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉（T.viride）對苜蓿根腐病病原菌有較好的抑制效果。劉彥超等（2021）從紫花苜蓿莖部和根部分離出80株內生細菌，采用平板對峙法從中篩選出9株對苜蓿根腐病菌抑制率高于61.00%的細菌，其中1株類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）菌株MS-43對根腐病菌的抑制率達63.96%。Li等（2021）從紫花苜蓿根際土壤中分離篩選出1株蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）細菌菌株I-5，研究發(fā)現(xiàn)菌株I-5的發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌（F.tricinctum）孢子產(chǎn)生、萌發(fā)和菌絲生長均具有抑制作用，抑制率分別達76.67%、78.93%和55.77%。青藏高原平均海拔在4000 m以上，紫外輻射強、日照時間長，特殊的生境孕育著特殊環(huán)境適應性和特殊生物學機制的微生物資源。鄭有坤（2015）對青藏高原采集的土壤進行了放線菌物種多樣性分析，并從中篩選出11株對三七根腐病病原菌具有較強抑制作用的放線菌菌株；賈丹丹（2019）從青藏高原環(huán)境中篩選出46株生防芽胞桿菌，這些菌株在抑菌、促生和抗逆方面具有較高的活性?！颈狙芯壳腥朦c】生物防治對環(huán)境友好，研發(fā)周期相對較短，是苜蓿根腐病防治研究熱點之一。生活在青藏高原的微生物可能在抑菌活性和抗逆性等方面具有特殊的性質，為篩選更多高效、易培養(yǎng)的苜蓿根腐病拮抗菌提供了新方向，但目前針對苜蓿根腐病生防菌的相關研究較少，且大部分研究僅針對單一病原菌?！緮M解決的關鍵問題】以青藏高原的健康紫花苜蓿根際土壤為研究對象，以紫花苜蓿根腐病5種病原菌為靶標，采用稀釋涂布法、平板對峙法和菌絲生長速率法從中分離篩選拮抗菌株，繼而對篩選出的拮抗菌株進行分類鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化，以確定拮抗菌株的分類地位并提高其抑菌效果，旨在為高抑菌菌株的進一步開發(fā)應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品采集地紫花苜蓿根際土壤采集地位于四川省阿壩州紅原縣四川省草原科學研究院試驗地內（北緯32°47′，東經(jīng)102°32′），海拔3500 m。

1.1.2 供試病原菌紫花苜蓿根腐病病原真菌：木賊鐮刀菌、變紅鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、織球殼枯萎菌（Plectosphaerella cucumerina）和尖孢鐮刀菌，均由中國農業(yè)科學院草原研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。

1.1.4 試劑與儀器主要試劑：革蘭氏染色液、芽胞染色液和細菌生理生化鑒定管，均由青島海博生物技術有限公司提供。主要儀器：DSX-280KB30手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；BS-1E恒溫震蕩培養(yǎng)箱（金城海瀾儀器設備廠）；SWCJ-1FD超凈工作臺（浙江蘇凈凈化設備有限公司）；3K15高速冷凍離心機（美國Sigma生物科技有限公司）；SPH-250恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫花苜蓿根際土壤采集于2021年8月進行土壤樣品采集。在長勢良好的健康紫花苜蓿植株附近，采用五點取樣法和抖土法（唐濤等，2022）采集紫花苜蓿根際土壤。首先去掉0～5 cm的表層土壤，將根際土壤抖落后，用毛刷輕輕將根表面的土壤刷下；將土壤樣品中的殘根等雜物去除后混勻，用四分法留取土樣，裝入無菌塑封袋并放入冰盒中保存，帶回實驗室進行后續(xù)處理。

1.2.2 拮抗菌株的分離與純化利用稀釋涂布法分離紫花苜蓿根際土壤細菌（周德慶和徐德強，2013）。將土壤樣品配制成10-1～10-6濃度的懸液，分別取上述濃度的土壤稀釋液100μL均勻涂布于NA培養(yǎng)基表面，30℃條件下恒溫培養(yǎng)。挑取形態(tài)、大小和顏色有明顯差異的菌落進行純化。采用平板劃線法將菌落純化3～4次（周德慶和徐德強，2013），直至觀察到有單菌落出現(xiàn)，將單菌落轉接至斜面培養(yǎng)基試管中，置于冰箱4℃冷藏備用。

1.2.3 拮抗菌株篩選利用平板對峙法篩選拮抗菌株（李樞妍等，2021）。將活化好的病原真菌用直徑6 mm打孔器打成菌餅，置于PDA培養(yǎng)基中央，將菌絲的一面朝下，再將分離純化獲得的細菌以十字交叉法接種在距離菌餅2.5 cm處，28℃條件下培養(yǎng)4～7 d后，用十字交叉法測量菌落直徑后計算抑制率。試驗重復3次。抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100。

1.2.4 拮抗菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性測定發(fā)酵濾液的制備參考Mu等（2020）的方法并略有改動。將活化好的拮抗菌株接種于NB液體培養(yǎng)基中，30℃下180 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液；將3 mL種子液轉接到發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，30℃下180 r/min培養(yǎng)48 h后，4℃下10000 r/min離心20 min，取上清液；用0.22μm過濾器反復過濾后備用。采用菌絲生長速率法測定發(fā)酵濾液的活性（Dong et al.，2021）。將發(fā)酵濾液以20%的含量加入PDA培養(yǎng)基中，制成帶毒培養(yǎng)基，并加入50μL/mL的硫酸鏈霉素；將病原真菌接種在帶毒PDA培養(yǎng)基中央，28℃下培養(yǎng)4～7 d后，測量菌落直徑并計算抑制率。試驗重復3次。抑制率（%）=（對照組直徑-處理組直徑）/（對照組菌落直徑-6 mm）×100。

1.2.5 拮抗菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定平板劃線后，觀察拮抗菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，用細菌微量生化鑒定管對拮抗菌株進行生理生化鑒定（布坎南和吉本斯，1984；東秀珠和蔡妙英，2001）。將拮抗菌株進行革蘭氏染色和芽胞染色后，置于油鏡下觀察。將拮抗菌株接種到NB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h左右，離心，收集菌株，加入2.5%戊二醛固定（孫明明等，2020），將樣品送至成都里來生物科技有限公司進行掃描電鏡觀察。

1.2.6 拮抗菌株16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建使用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（成都擎科生物科技有限公司）提取拮抗菌株的DNA。PCR擴增引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACG ACTT-3′）。PCR反應體系50μL：1×TSE101金牌Mix 45μL，正、反向引物（10μmol/L）各2μL，DNA模板1μL。擴增程序：98℃預變性3 min；98℃10 s，55℃15 s，72℃15 s，進行39個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。將所得序列上傳至NCBI，通過BLAST進行比對。利用MEGA 7.0采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，得到相應的登錄號（Kumar et al.，2016）。

1.2.7 拮抗菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化拮抗菌株發(fā)酵濾液制備及發(fā)酵濾液活性測定同1.2.4。以發(fā)酵濾液抑菌活性為指標，先采用單因素試驗對碳源、氮源及無機鹽進行優(yōu)化，每處理3次重復，初步選出最佳因子。碳源：葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油；氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、酵母浸粉；無機鹽：NaCl、KH2PO4、CaCO3、MgSO4。選取抑菌活性最好的單因素的最佳濃度及上下2個濃度，設計3因素3水平正交試驗，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方（曲遠航等，2022）。

1.2.8 拮抗菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化拮抗菌株的發(fā)酵濾液制備及發(fā)酵濾液活性測定同1.2.4。以發(fā)酵濾液抑菌活性為指標，在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎上優(yōu)化其發(fā)酵條件，每處理3次重復。初始pH：將培養(yǎng)基的pH分別調成5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5；接種量：分別以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量接入菌種；培養(yǎng)溫度：將培養(yǎng)基分別置于20、25、30、35和40℃下培養(yǎng)；裝液量：在250 mL錐形瓶中分別設置60、80、100、120和140 mL的裝液量；培養(yǎng)時間：分別培養(yǎng)12、24、36、48和60 h；搖床轉速：設置120、150、180、210和240 r/min的轉速（張穎等，2021）。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019和SPSS 16.0進行分析，并用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株篩選結果

從采集自青藏高原的紫花苜蓿根際土壤中共分離純化出92株細菌，采用平板對峙法測定92株細菌對5種紫花苜蓿根腐病病原菌的拮抗效果，結果（表1）顯示，92株細菌中有16株細菌對不同病原菌具有抑制作用，其中，菌株L-1、LJ3-1、Z-21、Z-22和Z-23具有較廣譜的抑菌活性。菌株LJ3-1對5種供試病原菌的抑制率均在60.0%以上，其中對燕麥鐮刀菌和織球殼枯萎菌的抑制率分別為72.4%和70.2%，綜合各拮抗菌株的抑菌廣譜性和抑菌能力，選擇菌株LJ3-1作為目標拮抗菌進行后續(xù)試驗。菌株LJ3-1對5種病原真菌的平板對峙結果見圖1。

表1 拮抗菌株對紫花苜蓿根腐病病原菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of antagonistic strains against root rot pathogens of alfalfa

2.2 菌株LJ3-1發(fā)酵濾液抑菌活性測定結果

采用菌絲生長速率法對菌株LJ3-1發(fā)酵濾液的抑菌活性進行測定，結果（表2）顯示，菌株LJ3-1發(fā)酵濾液對引起紫花苜蓿根腐病的5種病原菌表現(xiàn)出不同的抑制活性，其中，發(fā)酵濾液對燕麥鐮刀菌的抑制效果最好，抑制率達77.4%；對織球殼枯萎菌也有較強的抑制效果，抑制率為75.7%；對其他幾種紫花苜蓿根腐病病原菌也均產(chǎn)生相應的抑制效果。因此，后續(xù)進行菌株LJ3-1的抑菌活性測定時以燕麥鐮刀菌作為活性追蹤指示菌。

表2 菌株LJ3-1發(fā)酵濾液對紫花苜蓿根腐病病原菌的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of strain LJ3-1 fermentation filtrate against root rot pathogens of alfalfa

2.3 菌株LJ3-1鑒定結果

2.3.1 菌株LJ3-1的形態(tài)觀察及生理生化鑒定菌株LJ3-1在NA培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)24 h后觀察，菌落呈近圓形，邊緣不規(guī)則，粗糙，有褶皺（圖2-A）。在光學顯微鏡下觀察到革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌，有芽胞存在（圖2-C和圖2-D）。形態(tài)觀察顯示菌株LJ3-1具有明顯的芽胞桿菌特征。掃描電鏡觀察菌體形態(tài)，可觀察到其細胞呈桿狀，有的呈鏈狀排列，細胞長、寬分別為1.0～2.0μm和0.3～0.6μm（圖2-B）。

菌株LJ3-1的生理生化鑒定結果（表3）顯示，該菌能液化明膠，能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，可利用甘露醇和木糖發(fā)酵，不能利用阿拉伯糖發(fā)酵，不能利用丙酸鹽，接觸酶反應呈陽性，V-P反應陽性，能水解淀粉，能在3% NaCl和7% NaCl胰胨水中生長。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001），初步鑒定菌株LJ3-1為枯草芽胞桿菌（B.subtilis）。

表3 菌株LJ3-1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LJ3-1

2.3.2 菌株16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建以菌株LJ3-1的總DNA為模板對16S rDNA序列進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物公司完成測序，發(fā)現(xiàn)菌株LJ3-1的16S rDNA序列長度為1450 bp。將菌株LJ3-1的16S rDNA序列上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得登錄號為OL757697.1。將菌株LJ3-1的16S rDNA序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫進行搜索比對，并下載相似序列，用MEGA 7.0的NJ法構建菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹。從圖3可看出，菌株LJ3-1與枯草芽胞桿菌（B.subtilis）多個菌株相似性達99%以上，故將其鑒定為枯草芽胞桿菌。

2.4 菌株LJ3-1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 菌株LJ3-1發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)基組分結果如圖4所示，當碳源為2%葡萄糖（圖4-A）、氮源為2%酵母浸粉（圖4-B）、無機鹽為0.5% NaCl時（圖4-C）菌株LJ3-1的抑菌活性最強。

根據(jù)單因素試驗篩選出的最佳碳源、氮源、無機鹽及其最佳濃度，設計3因素3水平正交試驗，結果（表4）顯示，RC＞RA＞RB，說明無機鹽組分對菌株LJ3-1發(fā)酵濾液抑菌活性影響最大，其余依次為葡萄糖和酵母浸粉，其最佳組合為A3B1C2，即菌株LJ3-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為3%葡萄糖、1%酵母浸粉、0.5% NaCl。

表4 菌株LJ3-1發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗結果Table 4 Orthogonal experiment results of fermentation medium for strain LJ3-1

2.4.2 菌株LJ3-1的發(fā)酵條件優(yōu)化由圖5可看出，當發(fā)酵濾液的初始pH為5.0～6.5時，菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趨勢，在pH 6.5時抑菌活性最強，其后隨著pH增大抑菌活性減弱，因此，發(fā)酵濾液的初始pH應控制在6.5～7.0（圖5-A）；當接種量為3%時，菌株LJ3-1的抑菌活性最強，因此，選擇3%的接種量進行種子液的接種（圖5-B）；當發(fā)酵溫度為35℃時菌株LJ3-1的抑菌活性最強，因此，選擇35℃作為發(fā)酵溫度（圖5-C）；在250 mL錐形瓶中，裝液量為80 mL時菌株LJ3-1的抑菌活性最強，因此，在250 mL錐形瓶中裝液量為80 mL最佳（圖5-D）；當發(fā)酵時間在12～36 h時菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趨勢，36 h時達最大值，隨后開始下降，因此，選擇發(fā)酵時間為36 h（圖5-E）；當搖床轉速為120～180 r/min時菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趨勢，當轉速為180 r/min時抑菌活性最強，隨后開始下降，因此，選擇搖床轉速為180 r/min（圖5-F）。

為比較基礎發(fā)酵培養(yǎng)基與優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基的抑菌活性，以燕麥鐮刀菌為指示菌，采用生長速率法測定2種發(fā)酵液的抑制率，結果（圖6）顯示，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下菌株LJ3-1對燕麥鐮刀菌的抑制率達89.3%，相較于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的抑制率（76.5%）顯著增加12.8%（絕對值）（P＜0.05，下同），說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基更有利于活性物質的產(chǎn)生。

3 討論

近年來，隨著紫花苜蓿種植面積的擴大，根腐病危害也隨之上升，由于農牧業(yè)自身的生產(chǎn)特點、環(huán)境保護和食品安全等方面的要求，化學農藥的使用受到制約（Zhao et al.，2021），人們迫切需要安全、綠色、環(huán)保、經(jīng)濟的生物防治資源，如生防菌。芽胞桿菌是被廣泛應用在植物病害防治上的生防菌，并已被開發(fā)成多種生物菌劑應用于農業(yè)生產(chǎn)（Hyakumachi et al.，2013；O’Brien，2017）?？莶菅堪麠U菌是被研究和開發(fā)最廣的生防芽胞桿菌，有研究表明，枯草芽胞桿菌對灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和香蕉枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cubense）均有良好的抑制作用（Touréet al.，2004；Furuya et al.，2011；鄭臻，2016）。芽胞桿菌在牧草病害上的應用也有報道，張丹（2016）分離篩選出2株紫花苜蓿內生菌Y1和Y5，經(jīng)鑒定均為枯草芽胞桿菌，2株菌株對尖孢鐮刀菌的平板對峙抑制率分別為54.05%和52.70%；梁艷瓊等（2020）篩選出1株解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens），該菌株對柱花草炭疽病具有良好的抑制效果。本研究從青藏高原的紫花苜蓿根際土壤中分離出92株細菌，通過平板對峙法篩選出1株對紫花苜蓿根腐病多種病原菌具有抑制作用的細菌LJ3-1，平板對峙結果顯示，菌株LJ3-1對5種供試紫花苜蓿根腐病病原菌的抑制率均在60.0%以上，對燕麥鐮刀菌和織球殼枯萎菌的抑制率分別為72.4%和70.2%；通過菌絲生長速率法驗證了其發(fā)酵濾液的抑菌活性，結果顯示，發(fā)酵濾液對燕麥鐮刀菌的抑制效果最好，抑制率達77.4%，對織球殼枯萎菌也有較強的抑制效果，抑制率為75.7%；通過形態(tài)學和分子生物學等方法綜合鑒定，確定其為枯草芽胞桿菌。

生防菌株會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物從而抑制病原菌的生長，通過發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化可提高其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量（Zhong et al.，2014）。劉揚科等（2021）對枯草芽胞桿菌YT168-6的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表明，該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：可溶性淀粉30.2 g/L、蛋白胨23.6 g/L、玉米漿18.2 g/L、K2HPO45 g/L、MgSO410 g/L，優(yōu)化后的發(fā)酵條件使其抗菌肽sublancin產(chǎn)量提高2.09倍。因此，發(fā)酵條件優(yōu)化對生防菌的開發(fā)和應用具有重要作用。本研究以發(fā)酵濾液抑菌活性為指標，通過單因素試驗和正交試驗對枯草芽胞桿菌菌株LJ3-1進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，結果表明，最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：3%葡萄糖、1%酵母浸粉和0.5% NaCl。本研究結果與劉揚科等（2021）的研究存在一定差異，原因可能是不同菌株對發(fā)酵培養(yǎng)基的喜好不完全相同，菌株LJ3-1產(chǎn)生的抑菌物質可能不是抗菌肽sublancin。本研究僅在搖床條件下對發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，今后尚需在發(fā)酵罐中進一步驗證，在實際生產(chǎn)應用中對發(fā)酵培養(yǎng)基組分的成本控制也需進一步探究。

本研究在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基基礎上進行了菌株LJ3-1的發(fā)酵條件優(yōu)化，結果顯示，最適pH為6.5～7.0，說明該菌株更適宜在偏酸的環(huán)境中生長代謝。本研究的土壤采集地位于紅原縣，張雪蓮（2015）在對紅原人工草地的土壤理化性質研究中發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)大部分土壤偏酸性；馬麗（2021）在對紅原高寒草地土壤的理化性質研究中也得到相同結論。推測菌株LJ3-1更適宜在偏酸的環(huán)境中生長代謝可能與其生存的土壤環(huán)境有關。菌株LJ3-1在發(fā)酵溫度35℃時生長良好、最佳接種量為3%、搖床轉速以180 r/min為宜、最佳裝液量為80 mL、發(fā)酵時間在36 h時抑制率最高，隨后開始下降，抑制率下降的原因可能是菌株生長進入后期，而發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分消耗殆盡，導致活性物質產(chǎn)量下降。基于優(yōu)化的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件下，菌株LJ3-1發(fā)酵濾液的抑菌活性達89.3%，顯著高于優(yōu)化前的培養(yǎng)基。本研究從青藏高原紫花苜蓿根際土壤中篩選出的菌株LJ3-1具有較好的生防菌開發(fā)潛力，關于菌株LJ3-1的抑菌機理等相關問題是下一步研究的方向。

4 結論

以青藏高原采集的紫花苜蓿根際土壤為研究對象，用平板對峙法和菌絲生長速率法篩選出1株對紫花苜蓿根腐病5種病原菌均具有抑制效果的拮抗菌株LJ3-1；對篩選出的菌株LJ3-1進行發(fā)酵條件優(yōu)化，提高了其抑菌活性。菌株LJ3-1具有較強的抑菌效果，可作為研制苜蓿根腐病生物防治菌劑的候選菌株資源。