彭棋，張雪，2，赫文龍，范寶超，王丹丹，劉茂軍，李彬，2*

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095）

0 引言

【研究意義】豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性豬腸道傳染病，其主要特征是仔豬發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉、脫水和高致死率，尤其是1周齡內(nèi)的仔豬死亡率可高達(dá)100%（朱琳等，2018；丁方藝等，2021）。自1971年英格蘭首次報道PED以來，PED在歐洲國家主要以零星散發(fā)的形式出現(xiàn)，并未對養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年底，由PEDV變異株導(dǎo)致的PED在我國南方開始暴發(fā)，席卷了我國大部分養(yǎng)豬場，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（Li et al.，2012；王隆柏等，2020）。2013年5月由PEDV變異株引起的PED在美國暴發(fā)，僅一年之內(nèi)給美國造成約10%的仔豬死亡（Schulz and Tonsor，2015）。目前，PED依然是影響世界養(yǎng)豬業(yè)的主要豬病之一（Wang et al.，2016；Antas and Wozniakowski，2019）。因此，分離鑒定當(dāng)前PEDV的流行株，對PEDV新型疫苗及診斷試劑的研發(fā)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】PEDV是冠狀病毒科（Coronaviridae）α-冠狀病毒屬（Alpha-Coronavirus）的成員之一，其病毒基因組全長約28 kb，具有典型的5′端7-甲基鳥苷三磷酸（m7gtp）帽子結(jié)構(gòu)和3′端poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)。病毒基因組包含7個開放閱讀框，編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab、纖突蛋白（Spike protein）、ORF3、包膜蛋白（Envelope protein）、膜蛋白（Membrane protein）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein）（Kocherhans et al.，2001）。其中，多聚蛋白pp1a和pp1ab可被非結(jié)構(gòu)蛋白nsp5和木瓜樣蛋白酶切割成16個非結(jié)構(gòu)蛋白，而大部分非結(jié)構(gòu)蛋白是病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制復(fù)合體的重要組成成分（Thiel et al.，2003）；纖突蛋白是病毒與宿主細(xì)胞受體相互作用介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞的重要蛋白，且纖突蛋白擁有多個主要的中和表位，對誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體起重要作用（Fu et al.，2017；Li et al.，2017）；ORF3是PEDV復(fù)制非必需的輔助蛋白，是一個非經(jīng)典的離子通道蛋白（Wang et al.，2012；Peng et al.，2020）；包膜蛋白和核衣殼蛋白是病毒粒子中含量較高的結(jié)構(gòu)蛋白，其編碼基因相對較保守，是用于設(shè)計(jì)檢測病毒的重要靶基因/蛋白（Peng et al.，2022）。PEDV是一種在體外難以培養(yǎng)的病毒，體外增殖過程一般需要額外添加胰蛋白酶。胰蛋白酶的作用是對病毒纖突蛋白進(jìn)行切割，幫助病毒入侵細(xì)胞和釋放（Tan et al.，2021）。至今，國內(nèi)外已有成功分離獲得PEDV的相關(guān)研究報道，Pan等（2012）首次在國內(nèi)分離獲得PEDV G2b變異株，Chen等（2014）從死于腹瀉仔豬的腸道中分離獲得PEDV變異株，Li等（2021）分離出1株P(guān)EDV重組變異株并對其致病性進(jìn)行研究。PEDV體外分離培養(yǎng)依然較困難，嚴(yán)重阻礙其致病機(jī)理及疫苗研發(fā)等工作的開展?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PEDV疫苗研發(fā)的前提是獲得對應(yīng)的流行毒株。本課題組近期從我國海南等地暴發(fā)PED的豬場采集到PEDV陽性樣品，通過分離當(dāng)前流行毒株，了解其生物學(xué)特性及其遺傳演化關(guān)系，為研發(fā)PEDV疫苗提供候選疫苗毒株?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分離當(dāng)前的PEDV流行株，測定流行株的全基因組信息，并分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系及變異株各亞型間的抗原性差異位點(diǎn)，以期為PEDV新型疫苗及診斷試劑盒的研發(fā)打下基礎(chǔ)，同時了解當(dāng)前PEDV流行株的遺傳演化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病料樣品為2021年3月采自海南省?？谑幸?guī)模養(yǎng)豬場死于腹瀉的仔豬腸道組織。非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）和小鼠抗PEDV N蛋白單克隆抗體均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所動物腹瀉病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存提供；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG購自安諾倫（北京）生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體和小鼠抗β-actin IgG抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 RNA提取與RT-PCR鑒定

采用宋德平（2016）設(shè)計(jì)的引物（表1）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。按照RNA提取試劑盒說明提取病料總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系20.0 μL：4.0μL 5×HiScript II qRT SuperMix II，16.0μL RNA。反轉(zhuǎn)錄程序：50℃15 min，85℃5 s。獲得cDNA后立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25.0μL：10×Buffer 2.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，dNTPs 1.0μL，rTaq聚合酶0.25μL，cDNA模板2.5μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行34個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.3 病毒分離

對RT-PCR檢測和測序鑒定呈PEDV陽性的病料進(jìn)行處理，嘗試分離PEDV。剪取仔豬腸道組織約1.0 g，加入2 mL病毒維持液［含5.0μg/mL胰酶（Sigma）和37.5μg/mL胰液素（Sigma）的DMEM］，混勻。使用勻漿器在冰水浴上對仔豬腸道組織進(jìn)行研磨，研磨均勻的樣品4℃下12000 r/min離心10 min，收集上清液，用0.22μm濾器過濾，濾液以病毒維持液進(jìn)行等體積稀釋。長滿單層Vero細(xì)胞的6孔細(xì)胞板用病毒維持液洗2次，每孔加入500.0μL稀釋后的樣品，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，每孔再加入病毒維持液至2 mL。將6孔細(xì)胞板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，直至出現(xiàn)細(xì)胞病變。若3 d后無明顯細(xì)胞病變出現(xiàn)，則將細(xì)胞置于-80℃凍存1次，繼續(xù)盲傳。同時按照1.2的方法檢測PEDV含量是否逐漸增多，若檢測條帶越來越淡，則棄之。

1.4 病毒鑒定

1.4.1 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）將Vero細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長至單層后以病毒維持液洗板2次，然后接種200.0μL病毒液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，每孔再加入病毒維持液至1 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，以PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定15 min。然后每孔加入300.0μL預(yù)冷甲醇透化10 min，PBS洗滌3次。每孔加入300μL的10%脫脂奶粉，37℃孵育1 h后用PBS再洗滌3次。加入1∶500倍稀釋的小鼠抗PEDV N蛋白單克隆抗體，37℃孵育1 h后用PBS洗滌3次；再加入1∶500倍稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37℃避光孵育1 h，棄除二抗，加入300.0μL的0.01% DAPI，37℃避光孵育15 min，PBS洗滌3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.4.2 Western blotting鑒定6孔細(xì)胞板接種Vero細(xì)胞，分別感染CH-HK-2021和AH2012/12（G2b變異株），待細(xì)胞出現(xiàn)病變后收集樣品。100℃煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，置于小鼠抗PEDV N蛋白單克隆抗體或小鼠抗β-actin IgG抗體中4℃搖床孵育8 h，轉(zhuǎn)速不超過80 r/min。孵育完成后，用1×TBST在4℃、100 r/min的條件下清洗2次，每次7 min；直接加入1∶2000倍稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體，4℃搖床孵育2 h，轉(zhuǎn)速不超過80 r/min，再以1×TBST在4℃、100 r/min的條件下清洗2次，每次7 min，然后進(jìn)行顯色。

1.4.3 RT-PCR鑒定及電鏡觀察使用表1中的引物（PEDV-18F和PEDV-18R）對PEDV分離株進(jìn)行RTPCR鑒定。RNA提取后反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增程序同1.2。病毒電鏡觀察參照Fan等（2017）的方法：取20 mL病毒液在4℃下3500 r/min離心30 min，收集上清液，以0.22μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片；去除細(xì)胞碎片的病毒液在4℃下41000 r/min離心2 h，用2%磷鎢酸（pH 7.0）對病毒粒子進(jìn)行負(fù)染，然后進(jìn)行電鏡觀察。

1.5 病毒增殖特性分析

將Vero細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長至單層后以病毒維持液洗滌2次，每孔加入0.1 MOI病毒液，37℃孵育2 h后每孔加入病毒維持液至1 mL。將細(xì)胞板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在病毒感染12、24、36和48 h后收集樣品，通過TCID50測定病毒滴度。根據(jù)病毒滴度繪制病毒體外增殖動態(tài)曲線。

1.6 病毒基因組生物信息學(xué)分析

采用已發(fā)表文獻(xiàn)中的引物（Song et al.，2015；宋德平，2016）對分離株進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，引物序列信息見表1。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同1.2。使用Lasergene中的SeqMan完成序列拼接，然后以MEGA 7.0進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析；并采用Protean中的Jameson-Wolf算法進(jìn)行抗原性分析。

表1 擴(kuò)增PEDV全基因組的引物序列信息Table 1 Primer sequence information of amplification of whole genome of PEDV

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV流行株分離結(jié)果

將3份呈PEDV陽性的仔豬腸道組織樣品處理后接種至長滿Vero細(xì)胞的6孔細(xì)胞板中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盲傳至第6代時，其中1份樣品能導(dǎo)致Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞塌陷，或細(xì)胞融合形成合胞體，最終脫落（圖1），將分離的毒株命名為CH-HK-2021。CH-HK-2021毒株在Vero細(xì)胞上繼續(xù)進(jìn)行傳代，發(fā)現(xiàn)該毒株能在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，并形成典型的細(xì)胞病變，目前已傳至100代。

2.2 分離毒株鑒定結(jié)果

分別采用IFA和Western blotting對CH-HK-2021毒株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，分離獲得的CH-HK-2021毒株能與小鼠抗PEDV N蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)（圖2-A），且N蛋白主要分布在胞漿中，說明CH-HK-2021毒株即為PEDV。Western blotting檢測結(jié)果也顯示，通過小鼠抗PEDV N蛋白單克隆抗體能在感染CH-HK-2021毒株的Vero細(xì)胞中檢測到N蛋白（圖2-B），進(jìn)一步證實(shí)分離毒株為PEDV。

提取感染CH-HK-2021毒株的Vero細(xì)胞樣品RNA，RT-PCR鑒定結(jié)果顯示，感染CH-HK-2021毒株的Vero細(xì)胞樣品均能擴(kuò)增獲得預(yù)期的目的條帶（圖3-A），證明分離獲得的CH-HK-2021毒株即為PEDV。電鏡觀察結(jié)果顯示，CH-HK-2021毒株的直徑在80～120 nm，且病毒粒子表面帶有刺突樣的形狀（圖3-B），屬于冠狀病毒。

2.3 病毒增殖特性分析結(jié)果

為了解CH-HK-2021毒株在Vero細(xì)胞中的增殖特性，將Vero細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長成單層后，接種0.1 MOI的CH-HK-2021和AH2012/12毒株。分別于病毒感染12、24、36和48 h后收集樣品，通過TCID50測定病毒滴度，并繪制病毒增殖動態(tài)曲線。由圖4可看出，CH-HK-2021毒株與AH2012/12毒株具有相似的增殖動力學(xué)，但病毒滴度較AH2012/12毒株低。CH-HK-2021和AH2012/12毒株在感染Vero細(xì)胞后其病毒滴度逐漸升高，至感染24 h時的滴度達(dá)最高值，分別為105.6TCID50/mL和106.7TCID50/mL；隨后CH-HK-2021和AH2012/12毒株的滴度均呈逐漸降低趨勢。

2.4 分離毒株全基因組序列擴(kuò)增及其遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

將CH-HK-2021毒株基因組分成33段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 kb。如圖5所示，成功擴(kuò)增獲得CH-HK-2021毒株全基因組，利用SeqMan對測序信息進(jìn)行組裝，即獲得CH-HK-2021毒株全基因組序列信息，基因組全長除去poly（A）尾后為28034 bp。CH-HK-2021毒株與PEDV參考株在全基因組水平上的核苷酸序列相似性為96.0%～98.9%，其中，與JS-HZ2012（KC210147）毒株的相似性最高（98.9%），與SM98（GU937797）毒株的相似性最低（96.0%）。在S基因水平上，CH-HK-2021毒株與CH/JX/01（KX058031）毒株的核苷酸序列相似性最高（99.0%），而與經(jīng)典毒株AVCT12（LC053455）的核苷酸序列相似性僅為93.1%。

全基因組遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，CH-HK-2021毒株屬于G2a變異株，與美國及我國部分重組毒株的親緣關(guān)系較近，但與經(jīng)典毒株AVCT12（LC053455）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6-A）?；赟基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，CH-HK-2021毒株位于G2a亞群，與CH/JX/01（KX058031）毒株的親緣關(guān)系最近，但與經(jīng)典毒株CV777（AF353511）等的遺傳進(jìn)化關(guān)系相對較遠(yuǎn)，同時G2a亞群的大多毒株為我國2010年后的流行毒株（圖6-B）?？梢?，分離獲得的CH-HK-2021毒株屬于G2a變異株，為我國當(dāng)前的流行毒株。

2.5 G2a毒株與G2b變異株的S基因比對分析結(jié)果

進(jìn)一步選取GenBank已公布的部分G2a毒株與G2b變異株代表的S基因進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，G2a毒株與G2b變異株在S基因上存在42個核苷酸差異位點(diǎn)，其中，S1亞基包含10個核苷酸差異位點(diǎn)，S2亞基包含32個核苷酸差異位點(diǎn)。在氨基酸水平上，發(fā)現(xiàn)G2a毒株和G2b變異株在S蛋白上存在11個氨基酸差異位點(diǎn)，其中，S1亞基包含3個氨基酸差異位點(diǎn)，S2亞基包含8個氨基酸差異位點(diǎn)（表2）。同時對G2a毒株和G2b變異株的S蛋白進(jìn)行抗原性比較分析，結(jié)果顯示，二者的S蛋白抗原性差異位點(diǎn)有6處，其中S2亞基包含4處抗原性差異位點(diǎn)（圖7）。

表2 PEDV G2a毒株與G2b變異株S基因核苷酸及其氨基酸差異位點(diǎn)的比對分析結(jié)果Table 2 Comparative analysis of nucleotide and amino acid differential sites between PEDV G2a and G2b variant strains in S gene

3 討論

當(dāng)前，PED依然是影響我國養(yǎng)豬業(yè)的主要病害之一（焦點(diǎn)等，2018b；常新見等，2020），而疫苗接種是防控PED的重要手段。PEDV流行株分離是研發(fā)疫苗的重要環(huán)節(jié)，但PEDV的體外分離培養(yǎng)極其困難，究其原因主要是：（1）體外細(xì)胞培養(yǎng)體系與仔豬腸道內(nèi)環(huán)境不同，毒株本身不能適應(yīng)體外的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境；（2）豬腸道內(nèi)含有大量毒素，細(xì)胞培養(yǎng)過程中大量的毒素極易導(dǎo)致細(xì)胞死亡或狀態(tài)變差，進(jìn)而導(dǎo)致病毒體外分離失?。⊿hibata et al.，2000）；（3）一般情況下病毒體外培養(yǎng)需額外添加胰酶，在胰酶作用下某些細(xì)胞無法很好地貼壁或細(xì)胞狀態(tài)變差，而導(dǎo)致病毒分離失敗。Pan等（2012）從33份PEDV陽性樣品中分離獲得1株P(guān)EDV，且該毒株在Vero細(xì)胞上盲傳7代才開始出現(xiàn)細(xì)胞病變。本研究從3份新鮮的仔豬腸道組織樣品中成功分離獲得1株P(guān)EDV G2a變異株，該毒株在Vero細(xì)胞上盲傳至第6代才開始出現(xiàn)細(xì)胞病變。但Hofmann和Wyler（1988）曾報道在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)第1代PEDV即可觀察到細(xì)胞病變的出現(xiàn)；Kusanagi等（1992）研究證實(shí)PEDV分離株傳代至第2代即出現(xiàn)細(xì)胞病變，后續(xù)的傳代過程中細(xì)胞病變更加明顯?？梢姡?xì)胞病變差異可能與毒株對細(xì)胞的易感性不同有關(guān)。

遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，當(dāng)前的PEDV主要分成經(jīng)典毒株（G1）和變異株（G2），同時G2群毒株可進(jìn)一步分成G2a亞群和G2b亞群。這與國內(nèi)大部分研究結(jié)果相似，說明目前國內(nèi)的PEDV是以變異株為主（焦點(diǎn)等，2018a；Tian et al.，2021）。本研究分離獲得的PEDV流行株屬于G2a亞群的變異株，與國內(nèi)CH/JX/01毒株的親緣關(guān)系最接近。2010年底國內(nèi)暴發(fā)PED，甚至已接種疫苗的規(guī)模豬場也未能幸免（Sun et al.，2012）。為此，國內(nèi)許多科研機(jī)構(gòu)及相關(guān)學(xué)者針對變異株導(dǎo)致的PED疫情迅速開展PEDV疫苗研發(fā)工作，但目前疫苗免疫效果并不理想。究其原因主要是PEDV變異株各亞群間的交叉保護(hù)效果有限，而無法獲得理想的免疫保護(hù)效果。S蛋白是PEDV最大的結(jié)構(gòu)蛋白，在誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體和病毒入侵方面發(fā)揮著重要作用。本項(xiàng)研究對PEDV G2a毒株和G2b變異株間的S蛋白氨基酸差異位點(diǎn)及抗原性差異進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要的差異位點(diǎn)位于S2亞基上，與Zhao等（2018）、Kang等（2021）的研究結(jié)論相似，即S2亞基含有PEDV重要的中和表位。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PEDV S蛋白S2亞基含有的抗原性差異位點(diǎn)較S1亞基多，當(dāng)前G2b變異株疫苗免疫效果不理想可能與S2亞基變異導(dǎo)致抗原性差異有關(guān)。本課題組前期研究分離獲得G2b變異株AH2012/12，并構(gòu)建了對應(yīng)的感染性克?。≒eng et al.，2022）。因此，以G2b變異株AH2012/12為骨架，將CH-HK-2021毒株的S2亞基置換AH2012/12毒株的S2亞基，可構(gòu)建獲得同時抗G2a和G2b變異株的候選疫苗毒株。

4 結(jié)論

分離獲得的CH-HK-2021毒株屬于PEDV G2a變異株，為我國當(dāng)前的流行毒株，與PEDV經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。G2a毒株和G2b變異株在S2亞基上存在多處抗原性差異位點(diǎn)，故推測S2亞基是導(dǎo)致G2a毒株與G2b變異株抗原性差異的主要原因。