劉傳和，賀 涵，邵雪花，賴 多，匡石滋，肖維強(qiáng)

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

菠蘿[Ananascomosus(L.) Merr.]又稱鳳梨，屬鳳梨科(Bromeliaceae)鳳梨屬(Ananas)多年生草本作物，是著名的熱帶水果，在中國廣東、廣西和海南等地有較大面積種植。菠蘿果實(shí)中含有豐富的維生素、碳水化合物和有機(jī)酸，葉片具有抗腫瘤、降血糖、調(diào)血脂等功效；菠蘿果實(shí)既可以鮮食又可加工成飲品、果醬和水果罐頭，深受消費(fèi)者喜愛[1-2]。

中國菠蘿品種結(jié)構(gòu)極為單一。20世紀(jì)50年代至今，中國菠蘿主栽品種仍是‘巴厘’和‘無刺卡因’，其中‘巴厘’品種的種植面積占了中國種植面積的80%。通過雜交和芽變選種選育出具有良好鮮食特性和較好抗逆性的新品種是菠蘿的主要育種目標(biāo)之一[3-4]。‘粵甜’是由‘無刺卡因’與‘神灣’為親本通過雜交選育的菠蘿新品種。‘粵甜’在植株外觀形態(tài)方面與‘神灣’較為接近，但‘粵甜’菠蘿果實(shí)比‘神灣’稍大。經(jīng)過多年生產(chǎn)種植表明，‘粵甜’菠蘿的品質(zhì)與抗逆性均明顯優(yōu)于‘神灣’。

有關(guān)菠蘿抗逆性，多從表型進(jìn)行研究。馬帥鵬等[5]根據(jù)寒害等級(jí)對(duì)4個(gè)菠蘿品種‘金菠蘿’(MD-2)、‘黃金菠蘿’、‘巴厘’、‘無刺卡因’進(jìn)行了寒害調(diào)查，比較了不同菠蘿品種的抗寒性差異。Shu等[6]以耐冷品種MD-2和冷敏感品種‘臺(tái)農(nóng)17’為材料，尋找和篩選了耐冷基因同源序列附近的SSR位點(diǎn)，對(duì)所收集的種質(zhì)進(jìn)行耐冷性鑒定分類。近年來隨著轉(zhuǎn)錄組、代謝組等測序技術(shù)的使用，為農(nóng)作物育種與深入研究新品種(系)優(yōu)異性狀形成的機(jī)理提供了方便。轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析已廣泛應(yīng)用于水稻[7]、玉米[8]、辣椒[9]、火龍果[10]等作物不同生長發(fā)育時(shí)期和逆境脅迫下差異表達(dá)基因、差異代謝物的篩選與鑒定等相關(guān)研究，也逐漸成為果樹遺傳育種中相關(guān)分子機(jī)理和代謝途徑研究的重要手段[11]。本研究基于轉(zhuǎn)錄組和代謝組結(jié)果對(duì)‘神灣’和‘粵甜’兩個(gè)具有抗逆性差異的菠蘿品種間差異表達(dá)基因和差異代謝物進(jìn)行了分析，旨在探明‘粵甜’菠蘿抗逆性形成的分子生理基礎(chǔ)，為菠蘿抗逆性相關(guān)分子機(jī)理和抗性育種提供參考，也有利于加快菠蘿抗性育種進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所菠蘿試驗(yàn)示范基地進(jìn)行。供試品種‘神灣’(PZ2)和‘粵甜’(PZ3)，PZ2為對(duì)照。每個(gè)品種種植3個(gè)小區(qū)，隨機(jī)排列。每個(gè)小區(qū)長6 m，寬1 m，株、行距為30 cm×40 cm。2020年4月，在每個(gè)小區(qū)中選擇長勢(shì)一致的菠蘿植株3棵，每棵選取3片中部葉片，摘取葉片中間部位5 cm長作為取樣部位。每個(gè)小區(qū)植株上取的葉片混合為1個(gè)樣品，3個(gè)小區(qū)即為3次重復(fù)。取樣后立即置于液氮中速凍，2 h后在-70 ℃超低溫冰箱中暫存，用于轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析。

1.2 轉(zhuǎn)錄組分析

1.2.1 總RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測序總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序委托百邁客生物科技有限公司完成，3次生物學(xué)重復(fù)。采用天根DP441(RNAprep Pure Plant Kit，Polysaccharides & Polyphenolics-rich)試劑盒進(jìn)行總RNA提取，檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入裂解緩沖液(Fragmentation Buffer)將mRNA隨機(jī)打斷，以mRNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA 聚合酶Ⅰ合成第二條cDNA鏈，并利用AMPure XP beads純化cDNA。將純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，通過PCR富集得到cDNA文庫。文庫構(gòu)建完成后，通過qRT-PCR方法對(duì)文庫有效濃度(文庫有效濃度>2 nmol/L)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行混池，并使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.2.2 差異表達(dá)基因篩選與分析采用DESeq2[12]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。將差異顯著性P值校正后得到的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)與差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)相結(jié)合的方法進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC≥2且FDR<0.01。

1.2.3 部分差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證選擇8個(gè)差異表達(dá)基因和內(nèi)參基因Actin進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)水平。用Excel 2007將qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq測定的FPKM[13]比較作圖。

表1 qRT-PCR分析基因及引物

1.3 代謝物提取與分析

1.3.1 代謝物提取利用研磨儀(MM 400，Retsch)將真空冷凍干燥的樣品研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀，稱取100 mg粉末，溶解于0.6 mL提取液中，4 ℃冰箱過夜，期間渦旋6次以提高提取率。離心(轉(zhuǎn)速10 000 g，10 min)后，吸取上清，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，并保存于進(jìn)樣瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 色譜條件色譜柱為Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A為超純水(加入0.1%的甲酸)，B為乙腈。洗脫梯度為B相比例為5%，9 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10～11.1 min B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min，流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量4 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣(curtain gas，CUR)30 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(collision-activated dissociation，CAD)參數(shù)設(shè)置為高。

1.3.4 差異代謝物篩選與分析基于UPLC-MS/MS檢測平臺(tái)、百邁客公司自建數(shù)據(jù)庫以及多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合對(duì)代謝組進(jìn)行分析。通過主成分分析(principal component analysis，PCA)樣品總體代謝差異和組內(nèi)變異程度。采用R(3.3.2)包ropls對(duì)代謝物進(jìn)行正交偏最小二乘模型識(shí)別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)。將差異倍數(shù)、t檢驗(yàn)的P值和OPLS-DA模型的變量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)值相結(jié)合篩選差異代謝物；篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC>1.50、P<0.05和VIP>1。將篩選得到的差異代謝物與差異表達(dá)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因分析

2.1.1 差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)對(duì)PZ2和PZ3間差異表達(dá)基因分析，將FC≥2且FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到差異表達(dá)基因1 667個(gè)，其中上調(diào)的為770個(gè)，下調(diào)的為897個(gè)，其差異表達(dá)見圖1。

Up. 上調(diào)基因；Down. 下調(diào)基因；Normal. 無差異基因

2.1.2 差異表達(dá)基因篩選在PZ2與PZ3比較中，篩選出20個(gè)與抗逆性相關(guān)差異表達(dá)基因(表2)，包括超氧化物歧化酶SOD1、過氧化物酶POD48等酶基因，抗病蛋白R(shí)PP13、抗病蛋白R(shí)PP8和脫落酸脅迫誘導(dǎo)成熟蛋白ASR3等抗性相關(guān)蛋白基因，以及MYB、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子基因。PZ3中SOD1、POD48、POD31、ALDH2、TR、GSTU17等9個(gè)酶基因的表達(dá)是PZ2的1.09～3.10倍?？共〉鞍識(shí)PP13-like、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1/PTR FAMILY 5.10-like、核糖體蛋白L38-like等蛋白基因在PZ3中的表達(dá)是PZ2的1.08～6.97倍。MYB、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子基因在PZ3中的表達(dá)是PZ2的1.20～1.84倍。

表2 關(guān)鍵差異表達(dá)基因的篩選

2.1.3 部分差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證圖2所示為部分差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，8個(gè)差異表達(dá)基因(LOC109726005、LOC109705050、LOC109703989、LOC109720393、LOC109704375、LOC109720819、LOC109721892、LOC109705329)在PZ2與PZ3中的差異表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測序中差異基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)基本一致。

圖2 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

2.2 差異代謝物分析

2.2.1 差異代謝物火山圖分析以FC>1.50、P<0.05和VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在PZ2和PZ3樣本間共篩選到208個(gè)差異代謝物，其中，與PZ2相比，PZ3中有98個(gè)上調(diào)，110個(gè)下調(diào)(圖3)。

Up. 上調(diào)代謝物；Down.下調(diào)代謝物；Unchanged. 無變化代謝物

2.2.2 差異代謝物的篩選在PZ2和PZ3比較組間共篩選到22種與抗逆性顯著相關(guān)的差異代謝物，包括16種黃酮類物質(zhì)，3種氨基酸及其衍生物，2種脂類和1種木脂素(表3)。

表3 關(guān)鍵差異代謝物的篩選

與PZ2相比，16種黃酮類代謝物在PZ3中的含量上調(diào)了6.22～18.43倍。3種氨基酸及其衍生物L(fēng)-脯氨酸、順式-4-羥基-D-脯氨酸、甲基槲皮素谷氨酸在PZ3中的含量分別較PZ2提高了1.30倍、1.10倍和16.54倍。木質(zhì)素代謝物松脂醇-乙酰葡萄糖在PZ3中的含量較PZ2上調(diào)了10.52倍，脂質(zhì)類代謝物4-氧代-9Z,11Z,13E,15E-十八碳四烯酸、溶血磷脂酰膽堿分別較PZ2上調(diào)了1.40倍和1.57倍。

2.3 差異表達(dá)基因和差異代謝物關(guān)聯(lián)分析

通過對(duì)PZ2和PZ3差異表達(dá)基因和差異代謝物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，共有4條共同富集的通路(表4)，分別為類黃酮生物合成，苯丙素生物合成，莨宕烷、哌啶和吡啶丙酸鹽生物合成，半胱氨酸與蛋氨酸代謝。代謝組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析表明，類黃酮生物合成途徑中的差異表達(dá)基因與差異代謝產(chǎn)物圣草酚、表沒食子兒茶素的合成密切相關(guān)。苯丙素生物合成途徑中過氧化物酶基因、乙醛脫氫酶基因、莽草酸-O-鄰羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶基因、4-香豆酸-輔酶A連接酶基因與與差異代謝產(chǎn)物亞精胺和苯丙氨酸的合成密切相關(guān)。關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，過氧化物酶基因上調(diào)，亞精胺含量升高，呈正相關(guān)；半胱氨酸與蛋氨酸代謝途徑中的差異表達(dá)基因1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶與差異代謝產(chǎn)物L(fēng)-蛋氨酸、L-類胱氨酸和5′-脫氧-5′-(甲硫基)腺苷的合成密切相關(guān)，基因上調(diào)，差異代謝產(chǎn)物含量升高，呈正相關(guān)。

表4 差異表達(dá)基因和差異代謝物關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

轉(zhuǎn)錄組分析表明，與PZ2相比較，在抗逆性較強(qiáng)品種PZ3中篩選到1 667個(gè)差異表達(dá)基因，其中770個(gè)表達(dá)上調(diào)，897個(gè)表達(dá)下調(diào)，表明抗逆性不同的菠蘿品種在轉(zhuǎn)錄水平存在明顯差異。

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)是細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵酶，在提高植株對(duì)逆境的適應(yīng)性中發(fā)揮著積極作用，具有抗氧化活性，延緩衰老[14]。本研究中，與PZ2相比較，PZ3中SOD1和POD48等基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，抗逆性強(qiáng)品種通過產(chǎn)生活性氧消除相關(guān)酶與還原物質(zhì)來消除非生物逆境脅迫，以減輕外界脅迫對(duì)植株的損傷。類似地，乙醛脫氫酶、托品酮還原酶、4-香豆酸-輔酶A連接酶、ACO、GSTF1、GSTU17等酶基因在PZ3中的表達(dá)也明顯高于PZ2，有利于增強(qiáng)PZ3對(duì)逆境脅迫的抗性[15-19]。而一些蛋白基因如抗病蛋白R(shí)PP13-like、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核糖體蛋白、脫落酸脅迫誘導(dǎo)成熟蛋白、熱激蛋白以及熱激轉(zhuǎn)錄因子等基因也在PZ3中的表達(dá)高于PZ2，能提高PZ3對(duì)逆境的適應(yīng)性與抵抗力[20-24]。WRKY和MYB轉(zhuǎn)錄因子基因在調(diào)控植物生長發(fā)育及響應(yīng)低溫、干旱等逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用[25-29]，是響應(yīng)非生物脅迫過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因[26-28]。本研究中抗逆性較強(qiáng)的品種中WRKY26和MYB的表達(dá)量高于抗逆性差的品種。

代謝組分析表明，在PZ2和PZ3比較組中篩選到208個(gè)差異代謝物， PZ2和PZ3差異代謝物在氨基酸類和黃酮類代謝過程中較為活躍。轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析也表明類黃酮生物合成、苯丙素生物合成、莨宕烷、哌啶和吡啶丙酸鹽生物合成、半胱氨酸與蛋氨酸代謝4條通路中的差異表達(dá)基因與差異代謝物呈明顯正相關(guān)，說明PZ2和PZ3兩個(gè)不同品種菠蘿抗逆性的差異與氨基酸類、黃酮類物質(zhì)的合成以及代謝有關(guān)[29]。

黃酮類、氨基酸衍生物類以及木脂素類代謝物是植物抗逆性的重要影響物質(zhì)[30-31]。本研究中，抗逆性較強(qiáng)的菠蘿品種中黃酮類、氨基酸衍生物類及木脂素、脂質(zhì)等代謝物的含量高于抗逆性較差的品種，菠蘿的抗逆性與以上代謝物質(zhì)的積累有關(guān)。4-氧代-9Z,11Z,13E,15E-十八碳四烯酸和溶血磷脂酰膽堿分別屬于脂肪?；惡透视土字愇镔|(zhì)，是細(xì)胞膜的重要組成成分，在抵御植物低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[32]，這兩種代謝物在PZ3中含量高于PZ2，能提高PZ3的抗逆性。黃酮類物質(zhì)作為一類抗氧化劑，在植物應(yīng)對(duì)低溫等逆境時(shí)能有效清除細(xì)胞中的活性氧，提高植株免疫力[29,33]。本研究中，篩選到的16種黃酮類差異代謝物在抗逆性較強(qiáng)的品種中的含量均顯著高于抗逆性較差品種，說明抗氧化相關(guān)化合物的積累有利于提高菠蘿的抗逆性[34]?？扇苄蕴呛透彼岬仁浅Ｒ姷臐B透保護(hù)物質(zhì)，其含量的積累有助于維持低溫、鹽和干旱等逆境脅迫下細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，降低滲透壓力的損害[35-36]。本研究中，松脂醇-乙酰葡萄糖及脯氨酸類代謝物在PZ3中的含量高于PZ2，均有利于提高PZ3對(duì)逆境的適應(yīng)性與抗逆性。