趙 樂(lè)，朱畇昊，許 姣，宋夢(mèng)瑤，馮衛(wèi)生，鄭曉珂*

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，鄭州 450046；2 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046)

烯醇化酶(enolase，ENO)是糖酵解途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，能夠催化2-磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate，2-PGA)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖?phosphoenolpyruvate，PEP)的可逆反應(yīng)。烯醇化酶廣泛存在于原核和真核生物中，氨基酸序列保守程度較高，參與生物體內(nèi)的能量代謝，而且是細(xì)胞中含量最豐富的胞質(zhì)蛋白之一[1]。人體內(nèi)有3種烯醇化酶，分別是α、β、γ-ENO，其中α-ENO普遍分布在各個(gè)組織，β-ENO主要存在于肌肉組織，γ-ENO只分布在神經(jīng)組織[2]，其中對(duì)α-ENO研究較為深入，除了具有糖酵解的酶活性以外，α-ENO還與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如癌癥、自身免疫性疾病、缺血和細(xì)菌感染等[3]。在擬南芥中也有3種烯醇化酶AtENO1、AtENO2(LOS2)和AtENO3(AtENOC)，其中AtENO2與人的α-ENO相似性較高，都含有烯醇化酶N端保守結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合區(qū)[4]。

近年來(lái)，在植物中的研究表明，ENO除了作為一種糖酵解的酶，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)非生物脅迫過(guò)程也發(fā)揮重要作用。敲除擬南芥AtENO2基因，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變小和細(xì)胞分化缺陷，使根、芽和維管等組織的發(fā)育出現(xiàn)障礙、花器官形成受到損傷[1, 5]。AtENO2還能夠以轉(zhuǎn)錄因子的形式調(diào)控STZ/ZAT10基因的表達(dá)，參與植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫[6]。植物蛋白質(zhì)組學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)，ENO在多種植物中參與逆境脅迫，如鹽脅迫、干旱和冷脅迫，在受到干旱脅迫時(shí)玉米中ENO活性和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平都明顯上升，蛋白表達(dá)水平也升高[7]，鎘(cadmium，Cd)脅迫處理后，酵母和擬南芥中ENO蛋白的表達(dá)豐度顯著提高[8]。

美洲商陸(PhytolaccaamericanaL.)又名垂序商陸，是商陸科商陸屬多年生草本植物，對(duì)重金屬錳(manganese，Mn)和Cd具有超富集作用[9]，是一種比較理想的可用于植物修復(fù)的超富集植物[10]。前期美洲商陸應(yīng)答Cd脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果研究表明，Cd處理后PaENO蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Western blot的結(jié)果也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)[11-12]，說(shuō)明PaENO可能參與美洲商陸應(yīng)對(duì)Cd脅迫。本研究從美洲商陸葉中克隆了PaENO基因，進(jìn)行了序列分析、原核表達(dá)與純化、表達(dá)模式以及抗Cd分析，為今后研究PaENO基因在美洲商陸應(yīng)對(duì)Cd脅迫過(guò)程中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

美洲商陸種子采自河南省中藥植物園，根據(jù)河南中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥工程實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道方法[12]，種子分別用98%硫酸和70%乙醇進(jìn)行表面消毒各15 min，再用無(wú)菌水漂洗3次，然后將種子放置于1/2 MS培養(yǎng)基上，在人工氣候箱中生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件為光照16 h、23 ℃，黑暗8 h、20 ℃。3周后種子萌發(fā)長(zhǎng)成幼苗，將幼苗轉(zhuǎn)移到含1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長(zhǎng)，每2 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)3周后，美洲商陸幼苗長(zhǎng)出2片子葉和6片真葉，在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加入400 μmol/L CdCl2，進(jìn)行Cd脅迫處理，對(duì)照和處理都有3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，然后分別在Cd處理0、2、12、24 h采集美洲商陸幼苗的根、莖、葉等組織，用于RNA的提取。

1.2 方 法

1.2.1PaENO基因克隆使用植物總RNA提取試劑盒(天根)提取美洲商陸根、莖、葉的總RNA，經(jīng)檢測(cè)完整后，使用TransScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(全式金)提取得到的美洲商陸根、莖、葉組織的總RNA為模板，Oligo(dT)20為引物，反轉(zhuǎn)錄得到美洲商陸各組織的cDNA。

根據(jù)河南中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥工程實(shí)驗(yàn)室獲得的美洲商陸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRA No. SRP105831)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物PaENO-F(ATGGTTACCATCAAGTGCGTCAAAG)和PaENO-R(TTAGTAGGGCTCAACAGGCTGG)，用PrimerSTAR HSTaq(TaKaRa)擴(kuò)增PaENO基因，PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入rTaq(TaKaRa)，在72 ℃反應(yīng)10 min進(jìn)行平末端加A反應(yīng)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化與目的基因大小一致的條帶，進(jìn)行T-A克隆，將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2PaENO基因的序列分析利用NCBI blastx，將PaENO的基因序列與nr(non-redundant)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)。用DNAMAN 6.0將PaENO蛋白與其他植物的ENO蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，使用ProtParam tool預(yù)測(cè)PaENO蛋白的理化性質(zhì)，用InterPro Scan分析PaENO蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)PaENO蛋白的三維結(jié)構(gòu)，使用TargetP 1.1、SignalP 5.0和TMHMM 2.0等軟件分別預(yù)測(cè)PaENO蛋白的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽和跨膜域，利用MEGA 7軟件 NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3PaENO基因的原核表達(dá)和純化根據(jù)PaENO基因的序列信息，選擇合適的酶切位點(diǎn)，將其連接到原核表達(dá)載體pET-28a上，設(shè)計(jì)1對(duì)原核表達(dá)引物PaENO-Exp-F(CGGAATTCATGGTTACCATCAAGTGCG，劃線(xiàn)序列為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，PaENO-Exp-R(CCGCTCGAGTTAGTA-GGGCTCAACAGGC，劃線(xiàn)序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，以1.2.1中測(cè)序正確的pMD19-T-PaENO質(zhì)粒為模板，用PrimerSTAR HSTaq(TaKaRa)擴(kuò)增PaENO基因的ORF序列，PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。經(jīng)電泳檢測(cè)回收PCR產(chǎn)物，然后用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)原核表達(dá)載體pET-28a和PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，雙酶切完成后回收載體和目的基因，用T4DNA 連接酶在16 ℃過(guò)夜連接載體和目的基因，然后取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定，將鑒定正確的單克隆送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序正確的單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)生物制藥工程實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的誘導(dǎo)純化方法[13]，加入IPTG使其終濃度為0.4 mmol/L，然后在28 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)PaENO蛋白的表達(dá)，用SDS-PAGE 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。用Ni親和層析試劑盒(康為世紀(jì))純化目的蛋白，然后用含不同濃度咪唑(50、100、200、300、400和500 mmol/L)的緩沖液梯度洗脫目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，收集含有單一條帶的蛋白樣品進(jìn)行透析和超濾。

1.2.4PaENO基因表達(dá)模式分析將美洲商陸各組織的cDNA稀釋10倍，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的模板，以美洲商陸的α-TUBLIN基因[12,14]作為內(nèi)參基因(α-TUBLIN-qF：ATTGG-GTAGATTGCCAGGAG和α-TUBLIN-qR：AG-TTTGTGGACTGGTGCTCCAC)，檢測(cè)PaENO基因在美洲商陸根、莖、葉等組織中的表達(dá)，以及在Cd處理0、2、12和24 h葉片中的表達(dá)。PaENO基因的qRT-PCR引物為PaENO-qF(AGAGTCCAAAAGGCCATCGA)和PaENO-qR(CCACAGAAAGGTCAGCGATG)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，在ABI QuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行分析。qRT-PCR的反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，正反向引物各0.8 μL，2×TransStartTop Green qPCR SuperMix (TransGen) 10 μL，加ddH2O至20 μL，反應(yīng)程序設(shè)定為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，用ABI Q5系統(tǒng)自帶軟件，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的分析。

1.2.5 大腸桿菌抗Cd分析為了檢測(cè)PaENO對(duì)Cd的抗性，將含有pET-28a和pET28a-PaENO質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，在37 ℃、200 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，然后將其稀釋到OD600為0.1，在LB液體培養(yǎng)基中加入IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)和CdCl2(終濃度為1 mmol/L)，每隔1 h在600 nm處測(cè)定吸光度，檢測(cè)大腸桿菌在Cd脅迫條件下的生長(zhǎng)速率。同時(shí)各取100 μL含有pET-28a和pET28a-PaENO質(zhì)粒的大腸桿菌，均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上(含有0.4 mmol/L IPTG和1 mmol/L CdCl2)，在37 ℃培養(yǎng)48 h，觀(guān)察大腸桿菌在Cd脅迫下的生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PaENO基因克隆

通過(guò)分析本實(shí)驗(yàn)室的美洲商陸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，有一條注釋為ENO的轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度為1 855 bp，包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，根據(jù)ORF序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到一個(gè)長(zhǎng)度約為1 300 bp的PCR產(chǎn)物(圖1)，測(cè)序后獲得美洲商陸PaENO基因的ORF序列信息，大小為1 335 bp，編碼444個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為JN656932.1。

2.2 PaENO蛋白序列分析

ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PaENO蛋白的分子量為48.16 kD，理論等電點(diǎn)是5.39。InterPro保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，PaENO蛋白屬于烯醇化酶家族(IPR036849)，在N端4～139 aa為烯醇化酶N端結(jié)構(gòu)域(IPR020811)，在C端147～440 aa是烯醇化酶C端TIM 桶狀結(jié)構(gòu)域(IPR020810)。TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果表明PaENO可能位于細(xì)胞質(zhì)，SiganlP預(yù)測(cè)PaENO不含信號(hào)肽，TMHMM預(yù)測(cè)顯示PaENO蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。用PredictProtein預(yù)測(cè)PaENO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示PaENO蛋白由35.36% α-螺旋、13.06% β-折疊和51.58%的無(wú)規(guī)則卷曲組成。以人的γ-ENO晶體結(jié)構(gòu)(1TE6)為模板，根據(jù)SWISS-MODEL三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果，PaENO可能具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，以同源二聚體的形式在發(fā)揮功能，Mg2+是其激活劑。

根據(jù)NCBI Blastp的比對(duì)結(jié)果，PaENO與冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum，McENO，AAA21277)、甜菜(Betavulgaris，BvENO，XP_010683886)、菠菜(Spinaciaoleracea，SoENO，XP_021857227)等植物的ENO蛋白氨基酸序列相似性較高，分別為93.47%、92.34%和92.12%，而與擬南芥(Arabidopsisthaliana，AtENO2，NP_181192)、煙草(Nicotianatabacum，NtENO，NP_001312148)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，ScENO，1ONE_A)等物種的ENO蛋白氨基酸序列相似性為88.06%、87.84%和59.56%。將這7條ENO蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)ENO蛋白含有4個(gè)保守金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(39S、250D、300E、327D)以及3個(gè)保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3)(圖2)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明，PaENO與冰葉日中花、甜菜、菠菜等植物的ENO蛋白親緣關(guān)系較近，處于同一進(jìn)化分支上，然后與大豆、擬南芥、海島棉、煙草等植物聚為一大類(lèi)，屬于雙子葉植物，水稻、小麥、玉米等單子葉植物聚為一類(lèi)，與苔蘚、藻類(lèi)、酵母等物種的ENO蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 PaENO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3 PaENO蛋白的原核表達(dá)和純化

使用pET-28a表達(dá)載體，選擇合適的酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ和XhoⅠ)，構(gòu)建pET-28a-PaENO原核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序，確定PaENO基因序列沒(méi)有發(fā)生突變。將構(gòu)建成功的原核表達(dá)載體pET-28a-PaENO轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)PaENO蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在50 kD左右出現(xiàn)目的條帶(圖4，A)，然后用超聲破碎大腸桿菌細(xì)胞，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PaENO在上清和沉淀中都有表達(dá)，而且在上清中PaENO蛋白的表達(dá)量較高(圖4，A)。

使用Ni親和層析試劑盒純化PaENO蛋白，用含不同濃度咪唑的緩沖液梯度洗脫目的蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明低濃度咪唑(50、100、200 mmol/L)洗脫樣品中，PaENO蛋白含量較少，PaENO蛋白主要集中在高濃度咪唑(300、400、500 mmol/L)洗脫樣品中，其中以400 mmol/L咪唑洗脫效果最好(圖4，B)。收集高濃度咪唑(300、400、500 mmol/L)洗脫樣品，進(jìn)行透析和超濾，最終獲得純化的PaENO蛋白(圖4，C)。

M. Marker；A.原核表達(dá)及可溶性分析：1. 未誘導(dǎo)的E. coli(含pET-28a-PaENO)；2. IPTG誘導(dǎo)的E. coli(含pET-28a-PaENO)；3. 上清；4. 沉淀。B. 咪唑梯度洗脫： 1. IPTG誘導(dǎo)的E. coli(含pET-28a-PaENO)；2. 流穿峰；3-8. 50、100、200、300、400和500 mmol/L咪唑洗脫。C. SDS-PAGE純化分析：1. 未誘導(dǎo)的E. coli(含pET-28a-PaENO)；2. IPTG誘導(dǎo)的E. coli(含pET-28a-PaENO)；3純化的PaENO蛋白

2.4 PaENO基因表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，PaENO基因在美洲商陸的根、莖、葉中都有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，為根的2.5倍，其次是根，莖中表達(dá)量最低，僅為根中1/5。用400 μmol/L Cd處理后，在不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、12和24 h)檢測(cè)PaENO基因在美洲商陸葉片中表達(dá)量的變化，結(jié)果(圖5)表明，Cd脅迫后2 h，PaENO基因表達(dá)量迅速升高，達(dá)到0 h的9.54倍，到12、24 h，PaENO的表達(dá)量降低，為0 h的3.12和2.89倍，說(shuō)明Cd處理后PaENO基因的表達(dá)量迅速升高，參與美洲商陸應(yīng)對(duì)Cd脅迫。

A.組織表達(dá)分析；B. Cd處理后葉中表達(dá)變化。不同小寫(xiě)字母表示在不同組織(A)或Cd處理后不同時(shí)間點(diǎn)(B)PaENO基因表達(dá)差異顯著(P<0.05)

2.5 大腸桿菌抗Cd分析

為了進(jìn)一步研究表達(dá)PaENO蛋白的大腸桿菌對(duì)鎘的抗性，將表達(dá)空載體(pET-28a)和PaENO(pET-28a-PaENO)的大腸桿菌分別均勻涂布在含1 mmol/L CdCl2的LB平板生長(zhǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)表達(dá)PaENO的大腸桿菌比轉(zhuǎn)空載體的大腸桿菌要明顯抗鎘(圖6，A)。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，表達(dá)PaENO蛋白的大腸桿菌在LB平板上有(2 163±45)個(gè)單菌落，而轉(zhuǎn)空載體的大腸桿菌只有(10±2)個(gè)單菌落。在含1 mmol/L CdCl2的LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)也表明，表達(dá)PaENO蛋白的大腸桿菌比轉(zhuǎn)空載體的大腸桿菌要明顯抗鎘。表達(dá)空載體的大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中(含1 mmol/L CdCl2)從3 h到22 h，其吸光度OD600一直維持在0.6左右，基本沒(méi)有生長(zhǎng)，而表達(dá)PaENO的大腸桿菌在含1 mmol/L CdCl2的LB液體培養(yǎng)基中卻能夠一直生長(zhǎng)，其OD600從0 h的0.1一直上升到22 h的1.7(圖6，B)。

A. LB固體平板； B. LB液體培養(yǎng)基

3 討 論

根據(jù)環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部聯(lián)合發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》，全國(guó)土壤鎘污染狀況不容樂(lè)觀(guān)，已成為一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[15]。鎘水溶性高，且極易被植物吸收進(jìn)入食物鏈，危害人類(lèi)健康[16-17]。植物修復(fù)是利用超富集植物恢復(fù)重金屬污染土壤生產(chǎn)力的有效方法之一[18-19]。中國(guó)野生植物資源豐富，生長(zhǎng)在天然污染環(huán)境中的超富集植物數(shù)量也很多，目前有正式報(bào)道的鎘超富集植物有天藍(lán)遏藍(lán)菜[20]、東南景天[21]、美洲商陸[9]、龍葵[22]、寶山堇菜、長(zhǎng)柔毛委陵菜、伴礦景天和皖景天等，在修復(fù)鎘污染土壤方面各有特色。在重金屬污染區(qū)生長(zhǎng)的美洲商陸能夠在葉片中積累高達(dá)402 mg/kg的鎘[23]，且植物體內(nèi)的鎘含量與土壤中鎘濃度呈正相關(guān)。與其他鎘超富集植物相比，美洲商陸不僅能夠積累大量的鎘，而且還具有生物量大(野外最高可達(dá)3 m)和生長(zhǎng)時(shí)間短(3個(gè)月，一年可收兩季)等優(yōu)點(diǎn)，這些顯著的優(yōu)點(diǎn)使美洲商陸不僅是修復(fù)鎘污染土壤的潛力物種，而且是研究植物鎘超富集分子機(jī)制的有價(jià)值材料。

前期研究第一次發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑的PaENO與美洲商陸鎘脅迫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)，鎘脅迫后美洲商陸PaENO的蛋白表達(dá)水平提高了3.14倍，western blot結(jié)果也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，而糖酵解途徑的其他酶蛋白表達(dá)水平則顯著受到抑制[11]。后續(xù)研究美洲商陸應(yīng)對(duì)鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，一共獲得了5 054個(gè)差異表達(dá)基因，表明細(xì)胞壁的固定化、螯合作用、液泡區(qū)隔化以及硫醇化合物含量的升高，可能是美洲商陸耐受鎘脅迫的重要機(jī)制，而且在鎘處理后，PaENO基因的表達(dá)水平顯著升高[12]。本研究克隆了美洲商陸的PaENO基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并使用原核系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)和純化了PaENO蛋白，為后續(xù)研究PaENO酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及通過(guò)氨基酸點(diǎn)突變研究PaENO關(guān)鍵催化位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)； qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫后2 h內(nèi)PaENO基因的表達(dá)量迅速升高為0 h的9.54倍，隨著鎘處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量降低，但仍高于0 h，這與轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化趨勢(shì)一致；通過(guò)鎘抗性實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)了表達(dá)PaENO蛋白能夠顯著提高大腸桿菌對(duì)鎘的抗性。

擬南芥AtENO2(LOS2)除了作為一種糖酵解的酶，在擬南芥應(yīng)對(duì)冷脅迫中還能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能。LOS2蛋白同時(shí)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，能夠和擬南芥STZ/ZAT10基因的啟動(dòng)子結(jié)合，LOS2基因突變破壞了冷響應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致擬南芥對(duì)冷脅迫的敏感性[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥能夠從LOS2基因的第二個(gè)起始密碼子ATG(對(duì)應(yīng)第93位甲硫氨酸)選擇性翻譯為轉(zhuǎn)錄因子AtMBP-1，AtMBP-1能夠抑制STZ/ZAT10基因的表達(dá)，參與ABA信號(hào)通路的響應(yīng)[24]。這些結(jié)果表明AtMBP-1蛋白是LOS2蛋白的轉(zhuǎn)錄因子形式，作為一種負(fù)調(diào)控因子，參與擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)逆境脅迫。

結(jié)合前期的研究基礎(chǔ)以及本研究結(jié)果，鎘處理后美洲商陸PaENO的蛋白和基因表達(dá)水平都顯著升高，以及表達(dá)PaENO蛋白能夠顯著提高大腸桿菌對(duì)鎘的抗性，說(shuō)明PaENO這一在正常條件下負(fù)責(zé)糖代謝的酶，可能以轉(zhuǎn)錄因子(PaMBP-1)的形式在美洲商陸應(yīng)對(duì)鎘脅迫過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，但這種功能具體是通過(guò)何種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，具體調(diào)控下游哪些信號(hào)通路的相關(guān)基因，還有待進(jìn)一步研究闡明。