崔彥閣，許軍星，李 琳，張 萍，孫 路

（河北省衡水市第二人民醫(yī)院，河北 衡水 053000）

引 言

白玉豆是豆科菜豆屬一年或多年生草本植物，其外形圓潤，色澤潔凈如玉，因此得名。其主要產(chǎn)于我國江西、浙江、福建等長江中下游省份，有著悠久的種植歷史[1]。根據(jù)農(nóng)產(chǎn)品檢測機(jī)構(gòu)的測試顯示，白玉豆的營養(yǎng)價(jià)值高，含有α-AI、多種氨基酸、抗性淀粉和微量元素等多種對(duì)人體有益成分，能夠起到排毒養(yǎng)顏、開胃消炎等作用[2]。

α-AI 進(jìn)入人體會(huì)抑制人體胰腺分泌的α- 淀粉酶（α-1,4- 葡聚糖-4- 葡聚糖水解酶）的催化作用，抑制人體吸收的淀粉或糖原轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，能有效治療2 型糖尿病患者餐后的高血糖[3～5]。而且α-AI 被人體攝入后還會(huì)抑制小腸中的胰淀粉酶的催化作用，抑制人體對(duì)食品含有的淀粉的吸收，有利于減少體脂。從多種植物中提取α-AI 并純化的工藝已有所開展，并且已有多種檢測及試驗(yàn)證實(shí)了其對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療功效[6～7]。陳一昆等[8]提取蕓豆中的α-AI 用于SD 大鼠，驗(yàn)證了α-AI降低脂肪減輕體重的功效；Shi 等[9]通過將α-AI 添加到高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖的大鼠的飲食中，肥胖大鼠的體重增長減緩且腸道微生態(tài)得到了改善；Wang等[10]發(fā)現(xiàn)α-AI 僅會(huì)減少體脂降低血糖濃度，并不會(huì)引起顯著的臨床變化和不良反應(yīng)，對(duì)人體安全。為拓寬α- 淀粉酶抑制劑獲取途徑，同時(shí)提高白玉豆的加工附加值，本文對(duì)從白玉豆中獲取α-AI 的條件及產(chǎn)物性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

白玉豆（市售）；豬胰α- 淀粉酶、可溶性淀粉、BCA 蛋白檢測試劑盒（Sigma 公司）；氯化鈉（阿拉丁試劑有限公司）；食用乙醇（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；3,5- 二硝基水楊酸（阿拉丁試劑有限公司）。

冷凍離心機(jī)（Allegra X-30R，beckmancoulter 公司）；真空冷凍干燥機(jī)（FD-1B-55，博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；pH 計(jì)（DELTA320，梅特勒- 托利多儀器）；電子天平（BS 224 S，賽多利斯儀器）；紫外可見分光光度計(jì)（TU-1800，普析通用儀器）；可見分光光度計(jì)（722s，上海精密科學(xué)儀器）；粉碎機(jī)（JZ7114，上海微型電機(jī)廠）；恒溫水浴鍋（DZKW-D-2，天津天泰儀器有限公司）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-200，B CHI）；層析柱（自制）；酶標(biāo)儀（SpectraMaxR 190，美谷分子儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白玉豆中α- AI 抑制劑的提取與純化

將白玉豆在24℃去離子水中清洗后粉碎。稱取200g 粉碎后的白玉豆過60 目篩，溶于1L 的1.5%(wt)的氯化鈉溶液中室溫浸提4h，經(jīng)過濾后混合濾液。將濾液經(jīng)過20min 水浴加熱至70℃，按4000r/min 轉(zhuǎn)速離心0.5h，收集上層的清液。在清液中添加食用乙醇，得到70%食用乙醇的混合液，在4℃下靜置1h，之后以10000r/min 轉(zhuǎn)速離心15min，取出沉淀物，為提取的白玉豆α-AI 的粗品。

將適量的白玉豆α-AI 粗品用定量的0.025mol/L（pH 值為4.5）HAc-NaAc 緩沖液充分溶解，混合溶液使用CM 纖維素柱層析（2.6cm×40cm），之后用0～1mol/L NaCl 的0.025mol/L（pH 值為4.5）HAc-NaAc 洗脫液以1mL/min 流速梯度洗脫，收集蛋白峰并逐一檢測α-AI 活性，收集蛋白峰與α-AI 抑制活性峰重合的洗脫液，透析濃縮冷凍干燥后進(jìn)一步純化。用SephedexC-75 凝膠柱層析（1.0cm×80cm）以及含0～1mol/L NaCl 的0.025mol/L（pH 值為4.5）HAc-NaAc 溶液以0.5mL/min 的流速進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)突出的蛋白主峰，逐一檢測α-AI 活性。收集蛋白峰與α-AI 抑制活性峰重合的洗脫液，經(jīng)透析濃縮后冷凍干燥，得到α-AI 樣品。

1.2.2 α- AI 的溫度及酸堿穩(wěn)定性研究

為準(zhǔn)確分析溫度及酸堿度對(duì)α-AI 的影響，以試驗(yàn)用的α-AI 溶液配置質(zhì)量濃度約0.6mg/mL 稀溶液，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的α-AI 對(duì)豬胰腺α- 淀粉酶的抑制率在65%～85%。在25，35，45，55，65，75 和85℃與pH 值1～12 (pH 梯度為1) 的條件下進(jìn)行α-AI 的溫度和酸堿穩(wěn)定性研究。

1.2.3 α- AI 的提取單因素試驗(yàn)

在白玉豆中α-AI 的提取與純化方法中，影響α-AI 提取與純化的變量分別為固定豆粉的細(xì)度、料液比和鹽溶時(shí)間，以此進(jìn)行單因素試驗(yàn)分別研究各因素的影響。試驗(yàn)條件設(shè)為：豆粉的細(xì)度60 目，提取時(shí)間10h，溶劑比例1∶10g/mL。單因素的試驗(yàn)條件為豆粉細(xì)度（40，60，80，100 和120 目）、提取時(shí)間（2，4，6，8 和10h）和溶劑比例（1∶5，1∶10，1∶15 和1∶20（g/mL））。判斷指標(biāo)選擇半數(shù)抑制濃度IC50。

淀粉在α- 淀粉酶的催化作用下發(fā)生水解，產(chǎn)生可將3,5- 二硝基水楊酸（DNS）還原的麥芽糖和葡萄糖[11]，因此通過淀粉水解產(chǎn)生的麥芽糖含量來衡量α-AI 對(duì)α- 淀粉酶的抑制效果。吸光度（y）與麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x） 的關(guān)系為[12]y=7.653x-0.5687（R2=0.9973）。

樣品測定：將50μL 淀粉酶溶液（2mg/mL）與添加100μL 稀釋后α-AI 和200μL PBS 緩沖溶液充分混合，恒溫水浴20min（37℃）后加入400μL 可溶性淀粉（5mg/mL），再恒溫水浴10min（37℃），添加250μL 的DNS，沸水浴10min 后空冷至室溫，在520nm 處測量其吸光度。在試驗(yàn)過程中，另外設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)組、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組和試驗(yàn)對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)組中不添加α-AI，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組中不加淀粉酶液和α-AI，試驗(yàn)對(duì)照組中不加淀粉酶液，體積通過PBS 控制到相同水平。α-AI 抑制率P 通過式（1）計(jì)算[13]。

其中A1、A2、A3和A4分別為波長520nm 下標(biāo)準(zhǔn)組、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組、試驗(yàn)組和試驗(yàn)對(duì)照組的吸光度。通過α-AI 濃度和P 的關(guān)系可以得到α-AI 對(duì)豬胰淀粉酶的半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.4 α- AI 的沉淀?xiàng)l件的確定

水溶液中的白玉豆α-AI 可以使用有機(jī)溶劑作為沉淀劑沉淀分離，常用的有機(jī)溶劑有甲苯、乙醇、異丙醇等。由于α-AI 的主要用途是合成減肥食品與糖尿病藥物，從人體安全角度考慮，選擇乙醇作為沉淀劑。在白玉豆提取液中分別添加占終溶液體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%和90%的食用乙醇，經(jīng)過一定時(shí)間的沉淀反應(yīng)后檢測上層清液中的α-AI 活性，結(jié)果顯示含70%乙醇的混合溶液的上層清液不含α-AI。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMII 纖維素離子交換柱層析結(jié)果

本研究通過進(jìn)行CMII-cellulose 對(duì)白玉豆α-淀粉酶抑制劑的層析預(yù)試驗(yàn)，確定層析過程中的參數(shù)為試驗(yàn)方法中所設(shè)，層析時(shí)每管采集5mL。層析過程的洗脫曲線如圖1 所示。

從圖1 可知，白玉豆α-AI 粗品經(jīng)過CMII-cellulose 離子交換柱層析，得到1 個(gè)蛋白主峰，通過對(duì)每管進(jìn)行α-AI 的抑制活性進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)蛋白主峰同活性尖峰重合，采集α-AI 的抑制活性大于50%的洗脫液，透析濃縮冷凍干燥，得到α-AI初步純化樣品。

圖1 白玉豆α-AI CMII 纖維素離子交換柱層析洗脫曲線（2.6cm×40cm）Fig. 1 The CMII cellulose ion exchange column chromatography elution curve of Baiyu bean α-AI (2.6cm×40cm)

2.2 SephadexG-75 凝膠柱層析結(jié)果

將α-AI 初步純化樣品進(jìn)行SephadexG-75 纖維素離子柱層析，結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白主峰同活性尖峰重合，采集α-AI 的抑制活性大于50%的洗脫液，透析濃縮冷凍干燥，得到α-AI 純化樣品。

圖2 白玉豆α-AI SephadexG-75 凝膠柱層析洗脫曲線（1.6cm×90cm）Fig. 2 The SephadexG-75 gel column chromatography elution curve of Baiyu bean α-AI (1.6cm×90cm)

2.3 α-AI 的溫度及酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

溫度對(duì)α-AI 抑制率的影響如圖3（a）所示。在25～75℃時(shí)，α-AI 對(duì)豬胰腺α- 淀粉酶抑制率均大于82%，且波動(dòng)不大，溫度超過75℃后，對(duì)豬胰腺α- 淀粉酶抑制率急劇下降，證明α-AI 是一種非熱敏性蛋白。因此可以在純化過程中進(jìn)行70℃水浴加熱以去除熱敏性蛋白而不影響α-AI。

圖3（b）顯示α-AI 在不同pH 值環(huán)境下對(duì)豬胰腺α- 淀粉酶抑制率，表征α-AI 在不同pH 值的穩(wěn)定程度。結(jié)果顯示，α-AI 在pH 值3.0～10.0 之間抑制率較高活性較好，可以穩(wěn)定存在，在pH 值6.0～8.0 之間其抑制率最大，在pH 值為2 與pH 值大于10 時(shí)其活性損失較大，但可以表現(xiàn)出一定抑制特性。

圖3 溫度（a）和pH 值（b）對(duì)α-AI 穩(wěn)定性的影響Fig. 3 The effects of temperature (a) and pH (b) on the stability of α-AI

FerlS 等[14]在黑豆中分離出在pH 值為3.0～4.0時(shí)穩(wěn)定的α-AI；Hideki 等[15]通過對(duì)日本TEPRA Bean 進(jìn)行提取，得到在pH 值3.0～7.0 具有較高穩(wěn)定性的α-AI。試驗(yàn)分離得到的α-AI 與文獻(xiàn)報(bào)道相比，對(duì)pH 值的穩(wěn)定區(qū)間更大，使用范圍更廣。

2.4 α-AI 提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

豆粉的細(xì)度對(duì)α-AI 半數(shù)抑制濃度的影響如圖4（a）所示。結(jié)果表明，隨著豆粉細(xì)度增加，IC50呈現(xiàn)V 字型變化，先減小后增大，在細(xì)度60 目時(shí)IC50達(dá)到最小值，α-AI 活性最高。這種現(xiàn)象的原因可能在于隨著細(xì)度增加，提取過程中豆粉的表面積不斷增大，接觸的氯離子增多，α-AI 鹽溶效果增強(qiáng)，表現(xiàn)出IC50下降；這種效果在細(xì)度較小時(shí)細(xì)度的增加導(dǎo)致的表面積增大比較顯著，其存在峰值，超過峰值時(shí)，豆粉的細(xì)度如果再增加反而會(huì)使IC50增加，這是由于豆粉細(xì)度的增加伴隨著大量的豆粉粉碎，在這個(gè)過程中α-AI 會(huì)大量損失，同時(shí)在提取過程中，豆粉之間的團(tuán)聚幾率也隨著豆粉的細(xì)度增加而上升，導(dǎo)致提取液與豆粉的有效接觸面積降低，減少了提取的α-AI 含量，因此豆粉細(xì)度過大才會(huì)出現(xiàn)α-AI 的活性降低，IC50增加。

料液比對(duì)α-AI 的半數(shù)抑制濃度的影響如圖4（b）所示。IC50的數(shù)值隨料液比的下降呈先減小后增大趨勢，在料液比為1∶10(g/mL)時(shí)達(dá)到最小值，此時(shí)α-AI 活性最高。原因可能在于提取溶劑不僅會(huì)提取α-AI 也會(huì)提取其他蛋白質(zhì)，當(dāng)提取溶劑達(dá)到一定比例時(shí)α-AI 的提取量達(dá)到峰值，此時(shí)提取溶劑增加,α-AI 提取量不變,其他蛋白質(zhì)的提取增加，造成α-AI 在總蛋白含量中的比例減少，使得IC50提高。提取溶劑含量過高反而對(duì)后期濃縮不利，因此料液比1∶10(g/mL)為提取α-AI 的最佳料液比。

提取時(shí)間對(duì)淀粉酶抑制劑的活性影響如圖4（c）所示。α-AI 對(duì)淀粉酶的IC50值隨著提取時(shí)間的推移先減小后略有上升，提取時(shí)間8h 時(shí)達(dá)到最低值，原因可能是提取時(shí)間增加有利于α-AI 的析出，但鹽溶時(shí)間過長也會(huì)導(dǎo)致部分結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的雜質(zhì)蛋白同樣析出，使α-AI 的含量比例下降，造成抑制活性下降，IC50值出現(xiàn)上升趨勢。因此提取時(shí)間選擇8h 為宜。

圖4 豆粉的細(xì)度（a）、料液比（b）和提取時(shí)間（c）對(duì)α-AI 活性影響Fig. 4 The effects of bean powder fineness (a), material-liquid ratio(b) and extraction time (c) on the activity of α-AI

3 結(jié) 論

試驗(yàn)從白玉豆中提取α-AI 并進(jìn)行純化，評(píng)價(jià)其溫度和酸堿穩(wěn)定性，結(jié)果表明，α-AI 為耐熱性蛋白，在溫度75℃以上時(shí)，該樣品的抑制活性才急劇下降，在pH 值3～10 范圍內(nèi)能夠穩(wěn)定發(fā)揮作用。通過單因素試驗(yàn)得到從白玉豆提取α-AI 最佳提取工藝：豆粉細(xì)度60 目、料液比1∶10(g/mL)、鹽溶時(shí)間8h。白玉豆提取的α-AI 可通過CMII 纖維素離子交換柱層析與SephadexG-75 凝膠柱層析純化。