鄧 惠 李貴平

新生兒黃疸主要表現(xiàn)為目黃、身黃、尿黃，是新生兒常見疾病之一，其發(fā)病主要與濕熱邪蘊有關(guān)，新生兒肺、脾、腎常不足，三焦水道運化水濕不利，濕與熱結(jié)，濕熱熏蒸肝膽，膽汁外溢肌膚，故全身肌膚黃染；且濕困脾胃，脾胃不能運化水濕，加重濕熱內(nèi)困，惡性循環(huán)，加重黃染程度[1]。新生兒黃疸是新生兒住院的首要原因[2]，嚴(yán)重時可引起核黃疸，導(dǎo)致聽力和神經(jīng)系統(tǒng)等不可逆損傷。目前臨床治療主要有藍(lán)光照射、換血療法、藥物治療，但均不良作用明顯，費用較高[3,4]。傳統(tǒng)中醫(yī)常用經(jīng)典名方茵陳蒿湯加減治療，結(jié)合新生兒脾胃虛弱特點，茵梔黃口服液采用黃芩、金銀花代替茵陳蒿湯中大黃成分，降低方劑的瀉下力量，在臨床上使用較廣泛，取得了一定的療效[5,6]，減少新生兒黃疸住院率和住院時間，其具有經(jīng)濟、方便、安全的優(yōu)點，但是因新生兒個體差異，臨床上部分患兒出現(xiàn)腹瀉、吐奶、腹脹等不良反應(yīng)，尤其是溶血性黃疸，有效及安全劑量難以掌握。因此本研究通過對比生理鹽水和不同劑量茵梔黃口服液灌胃溶血性黃疸小鼠后，肝功能各項指標(biāo)、肝組織病理改變，探討茵梔黃口服液的有效劑量及安全性，以期為臨床使用茵梔黃口服液治療新生兒黃疸提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物健康的昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量17～23 g，共40只，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(川)2018—17，于西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)，保持室內(nèi)相對溫度19～21 ℃，相對濕度為50%～70%?；\底放置清潔的動物飼養(yǎng)墊料，使用維持飼料喂養(yǎng)，飼料旁放置一個小鼠專用水瓶(內(nèi)儲自來水)，每日定時添加飼料、更換墊料及飲用水。本實驗所采用飼料、墊料統(tǒng)一由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心采購。實驗嚴(yán)格遵守動物管理規(guī)則和使用原則。

1.2 實驗藥物茵梔黃口服液(北京華潤高科天然藥物有限公司，批號：Z11020607)，乙酰苯肼(APH，上海麥克林生化科技有限公司提供)。

2 方法

2.1 造模依據(jù)文獻(xiàn)制作溶血性黃疸小鼠模型[7，8]，先對40只雌雄各半的小鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按雌雄各半比例，將小鼠隨機分為造模組32只、正常組8只。將APH溶于生理鹽水，按60 mg/(kg·d)的劑量對造模組小鼠進(jìn)行腹腔注射，正常組小鼠腹腔注射20 ml/(kg·d)生理鹽水，連續(xù)注射3 d后，與正常組對比，造模組小鼠煩躁，皮毛失去光澤，耳朵等處皮膚變黃，尿液、大便黃，造模成功。

2.2 分組及給藥注射APH 3 d后，將造模成功的32只昆明小鼠隨機分成4組，每組8只，分別為茵梔黃口服液低、中、高劑量組和模型組。低、中、高劑量組分別灌胃5 ml/(kg·d)、10 ml/(kg·d)、20 ml/(kg·d)茵梔黃口服液(低、中劑量組分別于灌胃藥物中分別加入15 ml/(kg·d)、10 ml/(kg·d)生理鹽水，使3組灌胃總液體量均為20 ml/(kg·d))，模型組、正常組灌胃20 ml/(kg·d)生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃3 d。

2.3 檢測血清肝功能各組昆明小鼠灌胃3 d后，眼球取血1.5 ml，送西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科檢驗，檢測血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)、天門冬氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)。

2.4 肝臟病理切片觀察將取眼球血的小鼠立即處死，摘取肝臟，取肝臟組織于甲醛中固定，再經(jīng)脫水、透明后，浸蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)是否正常。

3 結(jié)果

3.1 各組昆明小鼠一般情況比較低、中、高劑量組和模型組小鼠造模后，與正常組小鼠比較，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食減少，活動減少，個別小鼠出現(xiàn)俯伏、抽動、易激惹、聚堆，小鼠皮毛失去光澤，耳朵皮膚蒼黃，尿液黃，大便黃，表明造模成功。低、中、高劑量組小鼠灌胃茵梔黃口服液后反應(yīng)、進(jìn)食、活動、皮毛光澤、耳朵皮膚蒼黃、二便黃、俯伏、抽動、易激惹、聚堆情況均有不同程度改善。

3.2 昆明小鼠生化指標(biāo)

3.2.1 昆明小鼠膽紅素指標(biāo)比較與正常組比較，模型組的TBIL、DBIL、IBIL均明顯升高，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。低、中、高劑量組與模型組比較，TBIL均降低，其中低劑量組與模型組比較，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明低劑量茵梔黃口服液對降低TBIL無效；中、高劑量組與模型組比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明中、高劑量的茵梔黃口服液對降低TBIL有效；而中、高劑量組比較，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明中、高劑量的茵梔黃口服液降低TBIL的效果不明顯；低、中、高劑量組的DBIL與模型組比較，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明茵梔黃口服液對降低DBIL無明顯效果。與模型組比較，低、中、高劑量組的IBIL均明顯下降，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明茵梔黃口服液能明顯降低IBIL；其中低、中、高劑量組的DBIL兩兩比較，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明低、中、高3種劑量的茵梔黃口服液對降低IBIL的效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

3.2.2 昆明小鼠肝功能指標(biāo)比較正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的TP、AST、ALT的值，各組之間兩兩比較，均P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明造模前后TP、AST、ALT無明顯變化，且茵梔黃口服液對TP、AST、ALT無明顯影響。與正常組比較，模型組ALP、ALB降低，GLB、A/G均升高，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明造模后ALP、ALB明顯降低，GLB、A/G明顯升高；模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的ALP、ALB、GLB、A/G的值，各組間兩兩比較，均P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明茵梔黃口服液對ALP、ALB、GLB、A/G無明顯影響，說明茵梔黃口服液對肝功能無明顯影響。見表2。

表1 各組小鼠血清中膽紅素濃度比較

3.3 昆明小鼠肝組織病理改變比較圖片A中正常組小鼠肝組織排列緊密整齊，細(xì)胞核完整，且大而圓，無明顯肝細(xì)胞破壞，未見明顯炎癥細(xì)胞。與正常組比較，圖片B中造模組肝組織排列疏松，肝組織結(jié)構(gòu)破壞，有明顯肝細(xì)胞壞死灶，空泡樣變性，炎細(xì)胞浸潤，表明造模后小鼠出現(xiàn)肝組織損傷。與圖片B中模型組比較，圖片C、D、E中的低、中、高劑量組，肝組織結(jié)構(gòu)排列疏松程度均有所減輕，肝細(xì)胞壞死灶減少，空泡樣變性減少，有炎癥細(xì)胞浸潤；圖片C、D中低、中劑量組比較肝臟病理切片差異不明顯；與圖片C、D中低、中劑量組比較，圖片E中高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)排列更疏松，肝組織結(jié)構(gòu)破壞相對較多，空泡樣變性相對增多，表明茵梔黃口服液對肝臟組織病理性改變具有一定改善作用，但劑量過大時，對肝組織病理損傷的改善作用降低。見圖1。

表2 各組小鼠肝功能比較 (只，

注：A正常組；B模型組；C低劑量組；D中劑量組；E高劑量組。圖1 小鼠肝臟病理切片比較

4 討論

新生兒黃疸，又名新生兒高膽紅素血癥，其主要表現(xiàn)為膽紅素過高出現(xiàn)皮膚黃染、小便黃，原因主要包括膽紅素生成過多，血漿白蛋白聯(lián)結(jié)膽紅素的能力不足，肝細(xì)胞處理膽紅素能力差，腸肝循環(huán)致重吸收增加[1]。膽紅素代謝途徑：紅細(xì)胞衰老分解生成脂溶性的間接膽紅素，間接膽紅素與血漿白蛋白結(jié)合后，進(jìn)入肝細(xì)胞中解離后與Y、Z蛋白結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDPGT)催化變?yōu)樗苄缘闹苯幽懠t素經(jīng)腸道、腎臟排出體外[9]。

APH破壞紅細(xì)胞，造成小鼠血虛，血虛不能榮養(yǎng)肌膚皮毛[10]，故皮毛失去光澤；血虛不能化神，故反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食減少、活動減少；氣隨血脫，陽氣不足，不能溫煦全身，故個別小鼠出現(xiàn)俯伏、聚堆等異常行為?！督饏T要略》中記載“黃家所得，從濕得之”說明黃疸與濕邪密切相關(guān)[11]，濕熱熏蒸肝膽，膽汁外溢肌膚而耳朵皮膚黃染，下注膀胱而小便黃，行大腸而大便黃。茵梔黃口服液由茵陳、梔子、黃芩、金銀花組成，茵陳、梔子、黃芩均具有清利濕熱作用，其中茵陳利膽退黃，乃治黃疸要藥，佐以金銀花清熱解毒。本實驗中，低、中、高劑量組與模型組小鼠比較，耳朵皮膚蒼黃、小便黃均有不同程度消退，抽動、易激惹情況亦均有改善，茵梔黃口服液從濕邪病因入手，并清熱以標(biāo)本兼治，改善溶血性黃疸小鼠癥狀。

APH主要通過破壞紅細(xì)胞，使膽紅素生成過多，導(dǎo)致溶血性黃疸[10]。本實驗中，造模組小鼠與正常組比較，TBIL、DBIL、IBIL均升高，ALP、ALB均降低，可能是因紅細(xì)胞破壞過多導(dǎo)致貧血，貧血可誘發(fā)ALP降低。溶血致TBIL生成過多，其中主要以IBIL升高為主，造成小鼠耳朵皮膚蒼黃。IBIL與ALB結(jié)合，消耗導(dǎo)致ALB降低，生成大量DBIL，經(jīng)由小便、大便排出，導(dǎo)致小便、大便黃染。膽紅素過高，透過血腦屏障，影響神經(jīng)系統(tǒng)，小鼠出現(xiàn)抽動、易激惹等異常。本實驗?zāi)Ｐ徒M肝臟病理切片提示肝組織損傷，炎癥浸潤，而當(dāng)機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，可使免疫球蛋白升高，GLB、A/G升高可能與其有關(guān)，造模后小鼠可能出現(xiàn)肝炎。中、高劑量組TBIL降低可能與茵梔黃口服液中茵陳、梔子、黃芩、金銀花均具有保肝利膽作用相關(guān)[12-15]；而低劑量茵梔黃口服液不能降低TBIL，說明低劑量組的劑量低于茵梔黃口服液的有效劑量，中、高劑量組的劑量在有效范圍內(nèi)，而中、高劑量組間TBIL差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明茵梔黃口服液的退黃作用強弱可能與劑量無明顯關(guān)系，但具體有效劑量范圍還需進(jìn)一步研究證明。茵陳能通過增加UDPCT活性，增強肝臟處理膽紅素能力[16]，低、中、高劑量茵梔黃口服液均能降低IBIL可能與其有關(guān)。DBIL主要通過二便排出體外，而茵梔黃口服液為茵陳蒿湯減去大黃，增加黃芩、金銀花變化所得方劑，大黃對大腸、小腸運動均具有增強作用[17]，故而茵梔黃口服液排泄二便能力相對減弱，本實驗低、中、高劑量組DBIL與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與其相關(guān)。TP、ALP、AST、ALT、ALB、GLB、A/G均為衡量肝功能損傷的指標(biāo)，其中ALB能與IBIL結(jié)合形成DBIL排出體外，降低膽紅素，而本實驗低、中、高劑量組TP、ALP、AST、ALT、ALB、GLB、A/G與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明茵梔黃口服液可能對肝功能無明顯影響，且其退黃作用可能與白蛋白無關(guān)，茵梔黃口服液具體退黃機制有待進(jìn)一步研究。低、中、高劑量組的肝臟病理切片與模型組比較，肝組織疏松、壞死灶、空泡樣變性、炎癥細(xì)胞浸潤均有不同程度減輕，茵梔黃口服液能減輕肝臟病理損害，其可能與茵梔黃口服液中茵陳、梔子能減少肝臟MDA生成以減輕肝細(xì)胞損害及黃芩能抑制自由基對肝細(xì)胞的毒性有關(guān)[18-20]；中劑量與低劑量比較改善差異不明顯，低、中劑量比高劑量肝組織損傷改善更明顯，說明高劑量茵梔黃口服液可能對肝組織病理損傷的改善作用降低，也可能高劑量茵梔黃口服液對肝組織具有一定損害作用，具體作用機制有待學(xué)者進(jìn)一步研究。

本實驗由于客觀因素限制，實驗設(shè)計有待進(jìn)一步完善，實驗條件、技術(shù)、樣本量等因素具有一定局限性，有待學(xué)者進(jìn)一步深入研究。