雷 英 蘇 凱 王運(yùn)盛 李金邦 張成林 李 雁 張麗霞 朱云蕓 金修哲 任倩俐 劉金鵬 普天春*

(1.太原動(dòng)物園，太原，030009；2.北京動(dòng)物園，北京，100044；3.北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044)

Seasonal variation

動(dòng)物機(jī)體是許多微生物的永久性宿主，微生物大多在動(dòng)物胃腸道定殖，對(duì)宿主的新陳代謝和健康發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。越來(lái)越多的研究表明，腸道微生物群不僅參與了分解、吸收和轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程，還是宿主抵御腸道病原微生物感染的天然屏障[2-3]，腸道菌群促進(jìn)腸道的免疫應(yīng)答，維持免疫穩(wěn)態(tài)，防止病原體定殖，以此維持腸道健康[4]。腸道微生物種群之間關(guān)系有互利共生、偏利共生、拮抗和競(jìng)爭(zhēng)等，種群結(jié)構(gòu)始終處在一種動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程中，一旦這種平衡關(guān)系被打破就會(huì)引發(fā)疾病[5]。

褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)是我國(guó)特有的珍稀鳥類，隸屬于雞形目(Galliformes)雉科(Phasianidae)馬雞屬(Crossoptilon)，被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物[6]。多年來(lái)，隨著我國(guó)圈養(yǎng)禽類人工免疫和驅(qū)蟲工作的持續(xù)開展，傳染性疾病和寄生蟲疾病已經(jīng)得到有效遏制[7-8]，但由于季節(jié)更替導(dǎo)致的消化道疾病，如腹瀉、消化障礙、壞死性腸炎及潰瘍性腸炎時(shí)有發(fā)生，臨床上治療難度較大，使用抗菌藥物殺滅致病菌也會(huì)破壞消化道內(nèi)正常的菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致消化功能紊亂，免疫力降低[9]。

目前，對(duì)禽類腸道菌群的研究多集中在肉雞、蛋雞和雉科鳥類等[10-11]，在野生動(dòng)物領(lǐng)域中，圈養(yǎng)褐馬雞的腸道菌群研究鮮見報(bào)道。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)圈養(yǎng)褐馬雞腸道菌群進(jìn)行多樣性分析，對(duì)比不同季節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，預(yù)測(cè)潛在致病的高發(fā)時(shí)間段，為提高褐馬雞疾病防控能力和飼養(yǎng)管理水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

同等飼養(yǎng)條件下2.5～3.5歲的圈養(yǎng)褐馬雞30只，雌雄各15只，健康狀態(tài)良好，分別于2021年1月(冬季)、4月(春季)、7月(夏季)和10月(秋季)的1日、15日和30日清晨用滅菌采樣管隨機(jī)采集新鮮糞便，樣品全部采集完畢后分為4組，分別是春季組、夏季組、秋季組和冬季組，液氮中保存。

1.2 DNA提取和PCR反應(yīng)

利用E.Z.N.A.?Stool DNA試劑盒(Omega，USA)提取4組褐馬雞糞便中微生物的總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA定量分析。PCR反應(yīng)靶向擴(kuò)增16S rDNA的V3—V4片段，PCR反應(yīng)體系為Phusion?Hot start flex 2X MasterMix 12.5 μL，模板DNA 50 ng，上下游引物各2.5 μL，超純水加至25.0 μL，經(jīng)過(guò)95 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min完成PCR擴(kuò)增。

1.3 產(chǎn)物純化及文庫(kù)構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化及定量構(gòu)建文庫(kù)。擴(kuò)增子文庫(kù)的大小和數(shù)量分別在Agilent 2100生物分析儀和Illumina的文庫(kù)定量試劑盒上評(píng)估。

1.4 高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

全部樣本測(cè)序完成后，將得到原始數(shù)據(jù)利用Overlap技術(shù)將雙端數(shù)據(jù)拼接，進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的干凈數(shù)據(jù)(clean data)；再通過(guò)“去重復(fù)”等步驟，獲得單堿基精度的代表序列；使用ASVs(擴(kuò)增子序列變異)的概念構(gòu)建類OTU表，獲得最終的特征表及特征序列(Feature)；最后在聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司(LC-Bio)的生物分析平臺(tái)進(jìn)行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過(guò)高質(zhì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，12份褐馬雞糞便共得到有效序列837 492條，序列長(zhǎng)度為400～500 bp，特征序列為8 884個(gè)，褐馬雞糞便樣品中冬季組的特征序列數(shù)量最高，夏季組最低；重疊部分最高的是408個(gè)特征序列，最低為13個(gè)特征序列。4個(gè)組重疊部分為76個(gè)特征序列(圖1)。

圖1 不同季節(jié)褐馬雞糞便樣品中特征序列數(shù)量分布Fig.1 Distribution of feature quantity in fecal samples of Crossoptilon mantchuricum at four seasons

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性主要通過(guò)Chao1、Observed species、Goods coverage、Shannon和Simpson 5個(gè)指數(shù)反映豐富度和均勻性。本研究中，冬季組的Chao1指數(shù)最高，為1 577.5～1 770.0，豐富度最高；夏季組的Chao1指數(shù)為419.8～513.0，豐富度最低。Observed species稀釋曲線顯示，被檢出的特征序列數(shù)量由高到低依次是冬季組、秋季組、春季組、夏季組(圖2)；Shannon index稀釋曲線顯示，物種多樣性排列由高到低依次是冬季組、春季組、秋季組、夏季組(圖3)。Goods coverage是指微生物覆蓋率，數(shù)值越高，則樣本中新物種沒(méi)有被測(cè)出的概率越低，本研究中各樣本的Goods coverage指數(shù)均為1，印證了本次測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠。

圖2 Observed species稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of observed species

圖3 香農(nóng)指數(shù)稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of Shannon index

2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性是指不同組別之間的物種差異性。Beta多樣性與Alpha多樣性一起構(gòu)成了總體多樣性或一定環(huán)境群落的生物異質(zhì)性。通過(guò)主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)觀察樣品組別之間的差異，結(jié)果中不同顏色代表不同分組，樣品距離越近，說(shuō)明樣品之間的微生物組成結(jié)構(gòu)越相似，反之則差異較大。冬季組與春季組、秋季組較為接近，夏季組與其他3組均距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明微生物菌群種類差異較大(圖4)。

圖4 PCoA分析Fig.4 Schematic diagram of PCoA analysis

非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)聚類分析也可以充分地佐證上述結(jié)果。圖5中不同顏色分支代表不同的分組，聚類樹展現(xiàn)了樣本間的相似度，樣本間的分枝長(zhǎng)度越短，兩樣本越相似，反之則差異較大。

圖5 UPGMA層次聚類分析Fig.5 UPGMA hierarchical cluster analysis

2.4 物種分析

特征序列是物種分類的原始文件，為了更加準(zhǔn)確地分析物種組成，使用SILVA及NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)做物種分類及后續(xù)分析。根據(jù)特征序列注釋結(jié)果和各樣品特征表，獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表，并針對(duì)不同水平物種豐度表對(duì)4組樣品的腸道菌群進(jìn)行物種組成及組間差異的分析，本研究重點(diǎn)關(guān)注門和屬水平上的變化。

2.4.1 門和屬水平上的物種分析

根據(jù)物種豐度表和物種注釋表，默認(rèn)選取門和屬水平上豐度最高的30個(gè)物種分類，將各組的物種相對(duì)豐度堆疊柱狀圖形式展示(圖6，圖7)。

圖6 褐馬雞各組腸道菌群在門水平上的物種相對(duì)豐度Fig.6 Relative species abundance of intestinal flora in each group of Crossoptilon mantchuricum at the phylum level

圖7 褐馬雞各組腸道菌群在屬水平上的物種相對(duì)豐度Fig.7 Relative species abundance of intestinal microflora in each group of Crossoptilon mantchuricum at the genus level

在門水平上，圈養(yǎng)褐馬雞的優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(Firmicutes，52.11%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，18.20%)、變形菌門(Proteobacteria，17.91%)和放線菌門(Actinobacteria，7.32%)，其中，厚壁菌門在春季組豐度最高(64.25%)，冬季組最低(40.39%)；擬桿菌門在冬季組最高(36.72%)，夏季組最低(5.63%)；變形菌門在夏季組最高(34.81%)，春季組最低(3.61%)；放線菌門在春季組最高(15.39%)，夏季組最低(1.42%)。

在屬水平上，Rikenellaceae_RC9_gut_group為優(yōu)勢(shì)菌屬(5.56%)，其次是鏈球菌屬(Streptococcus，5.47%)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio，4.74%)。鏈球菌屬在夏季組豐度最高(21.84%)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組，提示夏季消化系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)可能極大增加；脫硫弧菌屬在秋季組最低(8.77%)。值得關(guān)注的是，賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)在夏季組最高(3.84%)，而在春季組和冬季組最低(<0.01%)；作為益生菌的類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)亦是如此，在夏季組占3.19%，其他組小于0.74%。

2.4.2 季節(jié)變化規(guī)律

圈養(yǎng)褐馬雞腸道菌群在門水平上的變化規(guī)律以春、夏、秋、冬四季依次排序，厚壁菌門呈遞減趨勢(shì)，春季組豐度最高(64.25%)，冬季組最低(40.39%)；擬桿菌門在春季組和夏季組較低，秋季組和冬季組呈遞增趨勢(shì)，冬季組豐度接近40%；變形菌門在夏季組豐度最高，差異顯著(P<0.05)；放線菌門整體豐度較低，春季組相對(duì)較高(15.39%)，其他各組均低于7%(圖8)。

圖8 褐馬雞腸道門水平優(yōu)勢(shì)菌群的季節(jié)變化規(guī)律Fig.8 Seasonal variation of dominant intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum at the phylum level

在屬水平上，Rikenellaceae_RC9_gut_group最為優(yōu)勢(shì)，春季組至夏季組呈遞減趨勢(shì)，秋、冬組逐漸升高，冬季組達(dá)到峰值，差異顯著(P<0.05)；鏈球菌屬在夏季呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，其他各組均低于0.05%；脫硫弧菌屬由春季組過(guò)渡至夏季組呈下降趨勢(shì)，隨后至秋季組豐度最高，最后到冬季組略微下降(圖9)。

圖9 褐馬雞腸道屬水平優(yōu)勢(shì)菌群的季節(jié)變化規(guī)律Fig.9 Seasonal variation of dominant intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum at the genus level

2.4.3 物種種群之間的關(guān)系

在微生態(tài)研究中，通過(guò)不同物種在各樣品中的豐度及變化關(guān)系，計(jì)算物種之間的相關(guān)性，通過(guò)一定條件的篩選，找到不同微生物類群間的相互關(guān)系(正相關(guān)或負(fù)相關(guān))。SparCC分析是通過(guò)計(jì)算屬水平豐度top30的微生物豐度，獲得兩兩優(yōu)勢(shì)菌群之間的相關(guān)性以及顯著性P值，繪制出相關(guān)性熱圖[12]。從圖10中可以看出，Rikenellaceae_RC9_gut_group與糞桿菌屬(Faecalibacterium)、脫硫弧菌屬和擬桿菌屬(Bacteroides)呈正相關(guān)性，而同鏈球菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬呈負(fù)相關(guān)性；鏈球菌屬和脫硫弧菌屬、糞桿菌屬呈負(fù)相關(guān)性，同賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬則呈正相關(guān)性，這也從另一個(gè)角度印證了鏈球菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬在夏季組的相對(duì)豐度高于其他3組的檢測(cè)結(jié)果。

圖10 褐馬雞腸道菌群SparCC熱圖Fig.10 SparCC network heatmap of intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum

2.4.4 潛在致病性預(yù)測(cè)

通過(guò)BugBase對(duì)4組褐馬雞腸道菌群進(jìn)行潛在致病性預(yù)測(cè)，再對(duì)應(yīng)之前分析得出的菌群差異，可以有效地從源頭對(duì)疾病預(yù)防及治療[13]。圖11顯示：夏季組的潛在致病性顯著高于其他組(P<0.05)，從夏季組豐度較高的種群中篩選出相關(guān)致病菌，為臨床預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。對(duì)比上述結(jié)果，推測(cè)鏈球菌屬是導(dǎo)致夏季組潛在致病性明顯增高的因素之一。

圖11 褐馬雞潛在致病性預(yù)測(cè)Fig.11 Prediction of potential pathogenicity of Crossoptilon mantchuricum

3 討論

在動(dòng)物個(gè)體健康狀態(tài)良好的條件下，腸道菌群的變化是個(gè)穩(wěn)定且緩慢的過(guò)程，對(duì)同等飼養(yǎng)條件下3歲左右的圈養(yǎng)褐馬雞，分別于2021年1月(冬季)、4月(春季)、7月(夏季)和10月(秋季)的1日、15日和30日隨機(jī)采集新鮮糞便，試驗(yàn)全程未使用任何藥物或益生菌干預(yù)，目的在于將時(shí)間間隔拉開，以便發(fā)現(xiàn)并研究不同季節(jié)的腸道微生物差異，同時(shí)在每個(gè)組內(nèi)連續(xù)采樣3次，將組內(nèi)的差異性降低，使結(jié)果更加客觀、科學(xué)和有效。

沈佳斌等[11]研究雉科鳥類腸道菌群組成后發(fā)現(xiàn)，在門水平上，含量最高的是變形菌門(54.66%)，其次是厚壁菌門(24.02%)和擬桿菌門(12.07%)，本研究結(jié)果顯示：圈養(yǎng)褐馬雞的腸道菌群中厚壁菌門(52.11%)最為優(yōu)勢(shì)，其次是擬桿菌門(18.20%)、變形菌門(17.91%)。擬桿菌門對(duì)纖維素以外的其他物質(zhì)的降解效果顯著[14]，而厚壁菌門的重要作用是分解纖維素類物質(zhì)[15]。本研究厚壁菌門的豐度最高，這與圈養(yǎng)褐馬雞的飼養(yǎng)環(huán)境較為固定，以及飼料結(jié)構(gòu)中包含大量植物纖維素有關(guān)。在屬水平上，4組中最為優(yōu)勢(shì)菌均為Rikenellaceae_RC9_gut_group、鏈球菌屬和脫硫弧菌屬。

通過(guò)Alpha多樣性分析和潛在致病性預(yù)測(cè)，夏季組的腸道菌群豐富度最低，但潛在致病性最高，這點(diǎn)通過(guò)SparCC分析結(jié)果可以說(shuō)明，鏈球菌屬在夏季組豐度最高，但是鏈球菌屬和Rikenellaceae_RC9_gut_group、脫硫弧菌屬、Ruminococcaceae_UCG-005、糞桿菌屬、擬桿菌屬等幾種相對(duì)豐度較高的菌種呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，從微生物與環(huán)境的關(guān)系來(lái)講，鏈球菌屬與這些菌屬屬于偏害共生關(guān)系，其代謝產(chǎn)物改變了腸道中的環(huán)境條件，從而抑制其他微生物的生長(zhǎng)繁殖。但同時(shí)，在夏季組，同屬于益生菌的賴氨酸芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬含量最高，與鏈球菌屬呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明機(jī)體始終處于一種自我調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)條件致病菌處于優(yōu)勢(shì)時(shí)，劣勢(shì)菌種會(huì)啟動(dòng)“競(jìng)爭(zhēng)”機(jī)制，以“努力”維持機(jī)體健康的內(nèi)環(huán)境。微環(huán)境改變?cè)矫黠@，競(jìng)爭(zhēng)越激烈[16]，這樣才能維持機(jī)體能量轉(zhuǎn)化和新陳代謝的正常需求。