蘇 倡 高瑞芳 陳進(jìn)會(huì) 劉建麗 劉 葒 徐艷春，4，5*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，深圳，518045；3.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，東莞，523070；4.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040；5.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040)

大象是非洲生態(tài)系統(tǒng)中的重要物種，象牙的非法貿(mào)易導(dǎo)致了非洲象種群數(shù)量的急速下降[1-3]，并引發(fā)一系列生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和安全問題[4]。為了保護(hù)非洲象，早在1989年，《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)就把大象及其制品的國(guó)際貿(mào)易進(jìn)行嚴(yán)格控制。2015年7月30日，聯(lián)合國(guó)大會(huì)通過了關(guān)于“打擊野生動(dòng)植物非法交易”的歷史性決議。

識(shí)別非法象牙來源地，確定走私熱點(diǎn)地區(qū)，描繪走私通道是打擊象牙非法交易的重要前提[5]，這些工作都有賴于象牙的地理溯源，即通過對(duì)象牙的分析判斷其來源于哪個(gè)國(guó)家或地區(qū)。海關(guān)是查獲象牙非法貿(mào)易的主要部門，如果能夠?qū)Σ楂@象牙進(jìn)行地理溯源，則可以把走私行為與非洲來源地聯(lián)系起來，描繪國(guó)際走私通道。目前，國(guó)際上通用的象牙溯源方法有分子生物學(xué)方法和穩(wěn)定同位素分析方法。分子生物學(xué)方法是以各個(gè)地理種群的核DNA基因型[4-8]或線粒體DNA(mtDNA)單倍型[9-10]頻率為依據(jù)，通過象牙樣本的基因型計(jì)算屬于各個(gè)地理種群的概率。穩(wěn)定同位素分析方法是對(duì)象牙中的碳、氫、氧、氮、鍶和硫等同位素含量分析，再與來源地的背景數(shù)據(jù)比較，確定象牙的地理來源[11-15]。mtDNA是母系遺傳的，雄性非洲象成年后會(huì)離開它們出生的群體進(jìn)行擴(kuò)散，而雌性則始終留在出生時(shí)的群體中[16-18]，因此，每個(gè)地區(qū)的群體都會(huì)有其特征性的mtDNA多樣性，成為地理來源的信息[9，19-20]。由于在每個(gè)細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于核DNA，所以針對(duì)較低DNA豐度或較差質(zhì)量的象牙樣本時(shí)，通過mtDNA進(jìn)行溯源更具優(yōu)勢(shì)。LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫(www.loxodontalocalizer. org)[10]是一個(gè)開放獲取的非洲象mtDNA地理溯源數(shù)據(jù)庫，其基于線粒體控制區(qū)第一高變區(qū)(HVR1)的 316 bp序列，可以區(qū)分最近分化的譜系[21-23]。該數(shù)據(jù)庫的參考數(shù)據(jù)包括125個(gè)單倍型，涵蓋24個(gè)國(guó)家。這些單倍型中有62%是國(guó)家特有的[9]，可用于推斷象牙的地理來源。LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫的方法和可開放獲取的政策，目前已被大量應(yīng)用于非洲象牙地理來源追溯的工作中[24-26]。

本研究利用mtNDA溯源方法，分析象牙樣本HVR1的序列，利用LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫推斷可能的地理來源，建立國(guó)境口岸截獲象牙的地理信息數(shù)據(jù)庫，分析輸入中國(guó)的象牙遺傳特征，進(jìn)而推斷大象棲息地、獵捕地和走私通道等信息，為打擊國(guó)際象牙走私鏈條提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及其預(yù)處理

試驗(yàn)所用象牙樣本和象牙DNA均由國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心和南京森林警察學(xué)院提供，合計(jì)126份。將象牙塊先在0.3%次氯酸鈉溶液中浸泡殺菌120 s，用無菌脫脂棉擦拭象牙塊，以去除象牙塊的表面污垢、殘留的組織和其他可能由于切割、裝樣等導(dǎo)致的來自其他樣品的粉末或人源DNA污染[27]。隨后用無菌水浸泡沖洗2次，無水乙醇浸泡沖洗1次，放置于超凈工作臺(tái)上使乙醇和水分完全揮發(fā)。使用SPEX 6770液氮研磨儀(SPEX SamplePrep，美國(guó))將象牙塊研磨成粉，采用2 min預(yù)冷3 min研磨的方案，研磨后的象牙粉末置于10 mL頂空瓶中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 象牙樣品的脫鈣

將200 mg象牙粉末置入2 mL離心管中，向其中加入1.5 mL EDTA溶液(0.5 mol/L，pH 8.0)，對(duì)于質(zhì)量較好的象牙樣本使用改進(jìn)的2 h快速脫鈣法[27-28]：在56 ℃下孵育1 h，轉(zhuǎn)移到37 ℃下繼續(xù)孵育1 h，每小時(shí)更換1次EDTA溶液，12 000 r/min離心3 min，棄上清1 000 μL，再補(bǔ)加1 000 μL EDTA溶液，最后一個(gè)孵育步驟后同樣方法離心，去除上清液1 000 μL，底部剩余液體及沉淀用于后續(xù)DNA提取。對(duì)于質(zhì)量較差的樣本，使用3～10 d的慢速脫鈣法[27]：象牙在4 ℃條件下震蕩孵育過夜，每天更換1次EDTA溶液，最后1次離心后，采用同樣方法保留底部剩余液體及沉淀用于后續(xù)DNA提取。

1.3 象牙總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

向原2 mL離心管中，加入320 μL TNE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，80 μL SDS溶液(10%)，50 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，漩渦震蕩混勻，56 ℃水浴中消化6 h以上直至象牙沉淀完全溶解，最后用動(dòng)物基因組磁珠提取試劑盒(中科雷鳴，北京)提取象牙總DNA。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用Brandt等[29]的引物CR-F1(5′-TGGTCTTGTAAGCCATAAATGAAA-3′)，CR-R1(5′-GCTTTAATGTGCTATGTAAGACTATG-3′)；CR-F2(5′-TCGTGCATCACATTATTTACCC-3′)，CR-R2(5′-TGGT-CCTGAAGAAAGAACCAG-3′)。根據(jù)LoxodontaLocalizer說明書中的建議[10]，DNA質(zhì)量較好的樣本，用CR-F1/CR-R2引物對(duì)擴(kuò)增522 bp的mtDNA控制區(qū)片段；而DNA質(zhì)量較差的樣本則使用2個(gè)單獨(dú)的擴(kuò)增反應(yīng)，CR-F1/CR-R1引物對(duì)擴(kuò)增318 bp的mtDNA控制區(qū)片段，CR-F2/CR-R2引物對(duì)擴(kuò)增306 bp的mtDNA控制區(qū)片段，二者存在102 bp的重疊片段。

PCR反應(yīng)以10.0 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行，包含正反向引物各0.4 μL(10 μmol/L)，2×RapidTaqMaster Mix(諾唯贊，南京) 5.0 μL，ddH2O 2.2 μL，DNA 2.0 μL，混勻后瞬時(shí)離心。擴(kuò)增采用PE-9700型DNA擴(kuò)增儀(GeneAmp，美國(guó))，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離(100 V 穩(wěn)壓，20 min)，將目的條帶明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物回收，采用原引物進(jìn)行雙向Sanger測(cè)序(委托吉林省庫美生物科技有限公司完成)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果使用DNASTAR軟件包中的SeqMan軟件校對(duì)測(cè)序峰圖，并將正反向測(cè)序結(jié)果拼接，得到最終序列。使用MEGA 5.2軟件將控制區(qū)序列剪切為316 bp的片段，利用DnaSP 6.0軟件分析確定單倍型，計(jì)算單倍型數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異。

從GenBank下載653條具有非洲地理位置信息的4 258 bp非洲象線粒體DNA序列 (JQ438119～JQ438771)，包含13個(gè)非洲國(guó)家的22個(gè)地點(diǎn)；下載1條猛犸象線粒體基因組(KX027533)作為外群，在MEGA 5.2軟件中將上述序列剪切為與試驗(yàn)樣本測(cè)序序列相同的大小，與樣本序列分別使用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行分析。在MEGA 5.2軟件中構(gòu)建NJ樹，自舉檢驗(yàn)1 000次。使用PhyloSuite[30]軟件中的MAFFT進(jìn)行所有序列之間的比對(duì)，使用ModelFinder中的AIC(akaike information criterion)選擇最佳的替代模型，HKY+I+G模型被評(píng)估為最優(yōu)模型，使用IQ-TREE構(gòu)建最大似然樹，自舉檢驗(yàn)由5 000次重復(fù)檢驗(yàn)獲得。采用同樣方法將LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫中下載的所有125個(gè)單倍型與修剪為316 bp片段的樣本序列構(gòu)建ML樹和NJ樹。使用iTOL軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的編輯和美化。

1.5 Loxodonta Localizer 數(shù)據(jù)庫溯源分析

把前述分析中確定的各個(gè)單倍型，導(dǎo)入LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫中，與各個(gè)地理區(qū)域的參考序列進(jìn)行查詢比對(duì)。在數(shù)據(jù)庫中參看樣本序列的匹配情況，獲得其地理來源的相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用鄰接法和最大似然法對(duì)象牙樣本和不同地理區(qū)域非洲象間親緣關(guān)系進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析樹(圖1)。126條象牙樣本的序列分屬2個(gè)大的支系和7個(gè)mtDNA進(jìn)化枝。F支系(F-clade)為所有非洲森林象(Loxodontacyclotis)和部分非洲草原象(L.africana)所有，共有31條序列，分屬中西部進(jìn)化枝(n=15)、中北部進(jìn)化枝(n=7)、中東部進(jìn)化枝(n=2)和中南部進(jìn)化枝(n=7)；S支系(S-clade)來自大部分草原象，共有95條序列，分屬北部大草原進(jìn)化枝(n=1)、大草原進(jìn)化枝(n=27)和東南大草原進(jìn)化枝(n=67)。由于缺乏更多的多態(tài)性位點(diǎn)，分屬于中西部進(jìn)化枝、大草原進(jìn)化枝和東南大草原進(jìn)化枝中的大部分樣本序列并沒有完全地匹配到各個(gè)國(guó)家和地區(qū)之間。

圖1 基于GenBank數(shù)據(jù)庫中有地理信息的序列與樣本序列構(gòu)建的ML樹Fig.1 The maximum likelihood phylogenetic tree based on sequences with geographic information in the GenBank database and ivory sample sequences in this study 注：外群為猛犸象，NJ樹與其具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不另做展示；進(jìn)化樹中紅點(diǎn)表示后驗(yàn)概率大于95%，自舉值大于75；不同的進(jìn)化枝以不同的外圈顏色表示；mtDNA的F和S支系以黑色字體標(biāo)注；不同的國(guó)家地區(qū)以不同的進(jìn)化枝和文字顏色展示；本研究的126份樣本的樹枝標(biāo)為磚紅色；為方便展示，地理信息完全相同的亞進(jìn)化枝折疊處理 Note：The outgroup is mammoth.The Neighbor-joining tree has a similar topology and is not shown separately.The red dots indicate that the posterior probability is greater than 95% and the bootstrap value is greater than 75.Different clades are represented by different colors of the outer ring.The F and S clades of mtDNA are marked in black font.Different countries or regions are displayed in different branche and text colors.The branches of the 126 samples in this study are brick-red.For the convenience of display，the subclades with the same geographical information were folded

2.2 單倍型分析

從126條象牙樣本mtDNA控制區(qū)HVR1的316 bp的序列中，共定義和匹配了22個(gè)地理單倍型(表1)。在這22個(gè)單倍型中，共包含變異位點(diǎn)34個(gè)，單倍型多樣性為(0.742±0.039)，核苷酸多樣性為0.022，平均核苷酸差異為7.056。同樣，使用鄰接法和最大似然法對(duì)126條序列和LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫中的125個(gè)單倍型合并分析，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。所構(gòu)建進(jìn)化樹的系統(tǒng)發(fā)育分析與之前的單倍型分析結(jié)果完全一致。

圖2 基于Loxodonta Localizer 數(shù)據(jù)庫中125個(gè)單倍型與樣本序列構(gòu)建的ML樹Fig.2 The maximum likelihood phylogenetic tree based on sample sequences and 125 haplotypes in the Loxodonta Localizer database 注：外群為猛犸象，NJ樹與其具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不另作展示；進(jìn)化樹中紅點(diǎn)表示后驗(yàn)概率大于95%，自舉值大于75；不同的進(jìn)化枝以不同的文字顏色和外圈顏色表示；本研究的126份樣本的樹枝標(biāo)為磚紅色 Note：The outgroup is mammoth.The Neighbor-joining tree has a similar topology and is not shown separately.The red dots indicate that the posterior probability is greater than 95% and the bootstrap value is greater than 75.Different clades are represented by different text and outer circle colors.The branches of the 126 samples in this study are brick-red

2.3 溯源定位結(jié)果

經(jīng)LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫溯源分析，有21個(gè)單倍型共109份樣本可進(jìn)行有效的地理溯源，共涉及13個(gè)國(guó)家，包含42個(gè)國(guó)家公園或保護(hù)區(qū)(表2，圖3)。單倍型LL062分布極廣(圖4)，從北非的厄立特里亞，到東非中部的烏干達(dá)、肯尼亞和坦桑尼亞，再到中南部的納米比亞、博茨瓦納、贊比亞、津巴布韋和莫桑比克，直至南非的最南端，因此所提供的有效地理溯源信息不足，屬于這一單倍型的17份樣品均無法確定確切的地理來源。這一點(diǎn)在LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫的說明中也有提示。

續(xù)表2

圖3 匹配的地理單倍型在非洲的地理分布(地圖來源Loxodonta Localizer數(shù)據(jù)庫)Fig.3 The geographic distribution map of African elephant mtDNA geographical haplotypes matched by the samples of this study (map source：Loxodonta Localizer database) 注：不同顏色的圓點(diǎn)表示不同的地理單倍型，餅圖表示一個(gè)地區(qū)存在多個(gè)單倍型 Note：Different geographical haplotypes are displayed with dots of different colors，and when there are multiple haplotypes in a region，it is represented by a pie chart

圖4 地理單倍型LL062在非洲的地理分布(地圖來源Loxodonta Localizer 數(shù)據(jù)庫)Fig.4 Geographical distribution map of the geographic haplotype LL062 in Africa (map source：Loxodonta Localizer database)

圖3顯示，126份象牙樣本主要來源于3個(gè)熱點(diǎn)地區(qū)，第1個(gè)地區(qū)為中非剛果盆地的Tridom (Tri-National Dja-Odzala-Minkébé) 跨境生態(tài)保護(hù)區(qū)及其周邊地區(qū)，包括加蓬、剛果(布)、喀麥隆、中非共和國(guó)和剛果(金)等國(guó)，該地區(qū)也是非洲森林象的主要分布區(qū)[31]；第2個(gè)地區(qū)是東非的肯尼亞、坦桑尼亞和烏干達(dá)等國(guó)；第3個(gè)地區(qū)是非洲南部的Kavango-Zambezi (KAZA)跨境保護(hù)區(qū)，包括納米比亞、津巴布韋、博茨瓦納和莫桑比克。此外，也有少量樣品被溯源到其他國(guó)家和地區(qū)，如厄立特里亞和南非等。但樣品數(shù)量較少，未能反映來源地是否有集中連片的態(tài)勢(shì)。

3 討論

3.1 提高地理溯源的精度和準(zhǔn)確性

本研究首次對(duì)我國(guó)國(guó)境口岸截獲的部分象牙進(jìn)行地理溯源。因?yàn)橄笱罉颖镜馁|(zhì)量變化較大，采用核基因微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量不夠高[4-5，32-33]，故此，最終采用mtDNA控制區(qū)的序列溯源。

雖然LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫的信息檢索中有62%的單倍型是特定國(guó)家或地區(qū)獨(dú)有的[9-10]，如本研究中的LL042和LL116等，但有很多單倍型在多個(gè)國(guó)家或地區(qū)廣泛分布，如LL062單倍型。分布越廣泛的單倍型溯源有效性越低，追溯的地理來源信息越不可靠。mtDNA單倍型的多樣性與所檢測(cè)的序列長(zhǎng)度有關(guān)，越長(zhǎng)的序列可能包含的多態(tài)性位點(diǎn)越多，定義的單倍型也越多。本研究中采用了316 bp的控制區(qū)序列溯源，125個(gè)單倍型在該區(qū)域內(nèi)有42個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。但是在LoxodontaLocalizer 數(shù)據(jù)庫中的653條4 258 bp的序列中有多達(dá)424個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)[9]，如果把檢測(cè)的范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，采用多區(qū)域聯(lián)合溯源，可能會(huì)提高溯源的精準(zhǔn)度。

另一方面，還可以通過采用多種方法聯(lián)合溯源的策略來獲得更多的地理來源信息，提高溯源精準(zhǔn)度，mtDNA與核DNA標(biāo)記的進(jìn)化模式不同，可以從兩個(gè)側(cè)面提供譜系地理學(xué)的信息[34-36]；穩(wěn)定同位素提供了各地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)元素構(gòu)成的信息[11-15]。因此，如果3種方法聯(lián)合使用將會(huì)極大地提高地理溯源的精準(zhǔn)性[9，15]。

但在實(shí)踐中材料的消耗量也是一個(gè)重要的考量因素。象牙中的DNA都是孤獨(dú)片段化的，且含量較少。需要較多的材料才能獲得足夠用的DNA。如果mtDNA分析采用傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物Sanger測(cè)序，不得不把每個(gè)區(qū)段分別擴(kuò)增，而每個(gè)區(qū)段能支持的擴(kuò)增長(zhǎng)度都在400 bp以下[37]，故此所考察的區(qū)域越長(zhǎng)，擴(kuò)增的次數(shù)越多，DNA的耗費(fèi)量也隨之越大。微衛(wèi)星的分析雖然采用復(fù)合擴(kuò)增，但不同位點(diǎn)的擴(kuò)增程序差異較大，無法完全復(fù)合到一個(gè)反應(yīng)中，DNA的消耗量也很大[4-5，32-33]。今后如果采用二代測(cè)序技術(shù)，可以把不同區(qū)段的擴(kuò)增復(fù)合到一個(gè)體系中，從而節(jié)省大量的DNA。

3.2 國(guó)境口岸截獲象牙的地理來源

本研究成功獲得了109份國(guó)境口岸截獲象牙樣本的地理來源，推測(cè)了3個(gè)熱點(diǎn)地區(qū)：地區(qū)一是中非剛果盆地的Tridom生態(tài)保護(hù)區(qū)及其周邊地區(qū)；地區(qū)二主要是東非的肯尼亞、坦桑尼亞和烏干達(dá)等國(guó)；地區(qū)三是非洲南部的KAZA跨境保護(hù)區(qū)，這與Wasser等[5，33，38]的研究結(jié)果基本一致。Wasser等[5，33，38]對(duì)2006年以來緝獲的大宗非洲象牙溯源結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，該時(shí)期的非洲象牙主要來源于兩大熱點(diǎn)地區(qū)和一個(gè)新興熱點(diǎn)地區(qū)，其中坦桑尼亞東南部和毗鄰的莫桑比克北部及其周邊地區(qū)為一塊熱點(diǎn)地區(qū)；非洲森林象牙的偷盜獵主要來源于Tridom跨境生態(tài)保護(hù)區(qū)域[5，38]；KAZA跨境保護(hù)區(qū)是近幾年發(fā)現(xiàn)的又一塊新興的象牙盜獵熱點(diǎn)地區(qū)[33，39-40]。

根據(jù)Wasser等[33]的研究，非洲象牙盜獵的3個(gè)主要國(guó)際跨國(guó)犯罪組織分別在肯尼亞的蒙巴薩、烏干達(dá)的坎帕拉和多哥的洛美。本研究推測(cè)的熱點(diǎn)地區(qū)——Tridom跨境生態(tài)保護(hù)區(qū)，盜獵象牙主要是從多哥的洛美向外出口走私；地區(qū)二肯尼亞、坦桑尼亞和烏干達(dá)等國(guó)，偷盜獵象牙主要從肯尼亞的蒙巴薩或?yàn)醺蛇_(dá)的恩德培向外出口走私；地區(qū)三KAZA跨境保護(hù)區(qū)是近年新出現(xiàn)的偷盜獵熱點(diǎn)地區(qū)，該地區(qū)象牙大多是在剛果民主共和國(guó)的金沙薩裝入集裝箱開始走私運(yùn)輸。同時(shí)，非洲跨國(guó)犯罪組織間存在廣泛地聯(lián)系，走私出境港口也隨著執(zhí)法打擊的深入不斷變化，如在東非走私的集裝箱運(yùn)輸港口近年從坦桑尼亞轉(zhuǎn)移到肯尼亞再轉(zhuǎn)移到烏干達(dá)，通過卡車或鐵路運(yùn)輸至蒙巴薩。而西非的走私網(wǎng)絡(luò)也從多哥突然轉(zhuǎn)移到尼日利亞，成為西非走私出口業(yè)務(wù)的主要樞紐[33]。

跨國(guó)犯罪組織利用世界貿(mào)易的快速增長(zhǎng)及全球化發(fā)展，在每年全球運(yùn)輸?shù)?0億個(gè)集裝箱中隱藏其違禁品，他們將來自非洲各地偷盜獵的大量象牙合并且集裝箱化，出口國(guó)家通常不是偷獵大象所在國(guó)，而是其他的非洲國(guó)家[8，33]。因此，通過識(shí)別緝獲象牙的地區(qū)，結(jié)合跨國(guó)犯罪組織象牙走私的販運(yùn)網(wǎng)絡(luò)，可以增加走私象牙的緝獲率，有利于未來在走私象牙離開非洲之前阻止其貿(mào)易。

致謝：感謝南京森林警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供DNA樣本。