黃智豪 高玉婷 李政強(qiáng) 佘容 楊曉燕

(大理大學(xué)，云南·大理，671003)

微生物廣泛分布于生物圈，在物質(zhì)循環(huán)與能量流動中扮演著不可或缺的角色[1]；土壤微生物對森林生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)、土壤肥力及土壤穩(wěn)定性起著獨(dú)特而又重要的作用[2], 為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[3]。計劃火燒，是指利用可控的林火，對森林可燃物有計劃、有目的、有步驟地進(jìn)行燒除，以減少森林火災(zāi)的一項(xiàng)常用管理措施[4]。開展計劃火燒，一方面，可以減少林地可燃物，以預(yù)防森林火災(zāi)的發(fā)生，從而達(dá)到保護(hù)野生動植物、森林資源、生態(tài)系統(tǒng)、保持水土等目的[5]；另一方面，可加速可燃物，即枯枝落葉等無機(jī)轉(zhuǎn)化，增加土壤養(yǎng)分，改善植物及微生物的生長營養(yǎng)環(huán)境[6]，從而提高土壤微生物的物種優(yōu)勢度[7]，促進(jìn)森林天然更新。但在實(shí)施計劃火燒過程中，人們對植被、野生動物所受影響的關(guān)注度較高，而土壤微生物受到的影響關(guān)注較少。

火燒會對土壤微生物產(chǎn)生顯著影響，主要表現(xiàn)為直接影響與間接影響。直接影響是當(dāng)林火發(fā)生時使土壤溫度急劇上升，導(dǎo)致土壤微生物直接死亡，生物量下降[8]；間接影響是指火燒改變了植被、土壤理化性質(zhì)[9]，從而改變了土壤微生物的生存環(huán)境，進(jìn)而間接影響土壤微生物，導(dǎo)致其生物活性和群落結(jié)構(gòu)、物種多樣性發(fā)生改變[8]。計劃火燒是人為的控制性火燒，火燒強(qiáng)度小，單次計劃火燒的研究表明，其對土壤微生物的影響不顯著。但是，火災(zāi)對微生物的影響取決于很多因素，如火災(zāi)的嚴(yán)重程度和頻率、土壤和植被類型等[10]。云南省是我國森林資源極其豐富的省份之一，森林覆蓋率達(dá)63%[11]。云南省也是我國森林火災(zāi)的多發(fā)區(qū)與重災(zāi)區(qū)[12]，根據(jù)云南省森林火災(zāi)數(shù)據(jù)顯示，從1990—2017年，共發(fā)生森林火災(zāi)10 912次，過火面積達(dá)2.75×105hm2[13]。在此嚴(yán)峻的形勢下，計劃火燒作為營林手段被廣泛運(yùn)用，且很多地區(qū)每隔2～3 a便會進(jìn)行1次[14-15]。但是對于較高頻率反復(fù)計劃火燒對土壤微生物產(chǎn)生影響的研究較少。

為此，本研究以云南洱源縣平頭山經(jīng)歷了長期反復(fù)計劃火燒的區(qū)域作為研究樣區(qū)，以云南松(Pinusyunnanensis)林土壤為研究對象；2019年5月17日，在選定的反復(fù)計劃火燒區(qū)域、非火燒區(qū)域(為對照)分別采集土樣；應(yīng)用高通量測序方法，分析實(shí)施反復(fù)計劃火燒對云南大理洱源縣云南松林地土壤細(xì)菌群落的影響；旨在為反復(fù)計劃火燒措施的制定提供參考。

1 研究區(qū)域概況

本研究樣方設(shè)置在云南省洱源縣平頭山(25°40′8.59″N，100°9′21.77″E)。該地區(qū)屬北亞熱帶高原季風(fēng)氣候區(qū)，光照充足、干濕季節(jié)分明、四季恒溫；年日照2 061～2 439 h，年均降水732 mm，年均氣溫13.19 ℃；土壤類型，主要為紅壤、黃紅壤、暗棕壤。森林的優(yōu)勢樹種為云南松，樹齡為23 a，林下植被有櫟樹(QuercusL.)、高山栲(Castanopsisdelavayi)、扭黃茅(Heteropogoncontortus)、穗序野古草(A． Chenii Keng)、鉆葉火絨草(Leontopodiumsubulatum(Franch.) Beauv.)等。該區(qū)域在最近20 a間采用計劃火燒進(jìn)行森林大火的預(yù)防，其中有部分區(qū)域每2～3 a進(jìn)行1次計劃火燒，每次火燒均以去除地面草本植物為主要目的，火焰高度在0.4～0.5 m(數(shù)據(jù)來源于對當(dāng)?shù)刈o(hù)林員的走訪調(diào)查結(jié)果)。本研究選擇進(jìn)行反復(fù)計劃火燒的區(qū)域?yàn)檠芯繕拥兀韵噜彽?、在最?0 a未受到計劃火燒和自然火燒干擾的區(qū)域?yàn)閷φ諛拥?。反?fù)計劃火燒區(qū)在采樣時距其最近一次火燒的時間為3 a。兩個樣地均為東北坡的中坡位，海拔為2 000 m，坡度為28°。

2 研究方法

土壤樣品的采集：樣本采集時間為2019年5月17日。在選定的研究區(qū)域內(nèi)(反復(fù)計劃火燒區(qū)域、非火燒區(qū)域(為對照))分別各設(shè)置10 m×10 m樣方1個，采用5點(diǎn)采樣法(4角及中心)進(jìn)行土壤樣本采集，每個樣區(qū)采集5份樣本，合計10份。樣本采集時，先去除表面枯枝落葉，保留腐殖質(zhì)層，每個采樣點(diǎn)各取土層0～5 cm土壤500 g，裝入塑封袋，密封，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

土壤基因組DNA提取、文庫構(gòu)建、高通量測序方法：使用強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoil?DNA Isolation Kit)提取土壤樣本含有的細(xì)菌基因組DNA；使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)抽提的基因組DNA質(zhì)量，合格后送樣至生工生物工程(上海)有限公司，使用Illumina Miseq平臺進(jìn)行測序，特異性引物選用341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)、805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)，擴(kuò)增細(xì)菌V3～V4基因。

生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)處理方法：對測序結(jié)果進(jìn)行拼接、過濾、去嵌合等，得到優(yōu)化序列，利用Usearch(Version 5.2.236)在97%的相似水平下對優(yōu)化序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)注釋。通過Mothur(Version 1.30.1)進(jìn)行α多樣性分析，采用R語言vegan 程序包(vegan package)進(jìn)行群落整體差異非度量多維尺度(NMDS)分析、差異顯著物種分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗(yàn)樣地土壤樣品細(xì)菌物種組成特征測序

反復(fù)計劃火燒地與非火燒地的10個樣品，經(jīng)Illumina Miseq高通量測序后共獲得973 893條有效序列，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，共獲得857 090條優(yōu)化序列(反復(fù)計劃火燒與非火燒處理分別為434 026條、423 064條)，各樣品文庫覆蓋率均達(dá)到97%以上。稀釋曲線總體趨于平緩(見圖1)，表明測序深度合理，可以較好地反映樣品中細(xì)菌的物種組成特征，更深的測序幾乎不會產(chǎn)生更多新的操作分類單元(OTU)。

3.2 試驗(yàn)樣地土壤細(xì)菌群落α多樣性

由表1可見：反復(fù)計劃火燒地土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Ace指數(shù)、Chao1指數(shù))、群落多樣性指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)(Shannon index))，均顯著低于非火燒地(P<0.05)；反復(fù)計劃火燒地土壤細(xì)菌群落的辛普森多樣性指數(shù)(Simpson index)更高，說明其均一性更好(P<0.05)。

表1 不同區(qū)域土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)

3.3 試驗(yàn)樣地土壤細(xì)菌操作分類單元(OTU)分布

在97%的相似水平下對優(yōu)化序列進(jìn)行操作分類單元注釋，并對所得操作分類單元進(jìn)行統(tǒng)計表明：2個區(qū)域10個樣品共獲得18 071個細(xì)菌操作分類單元，其中共有操作分類單元為7 288個，占操作分類單元總數(shù)的40.33%，說明反復(fù)計劃火燒之后有較大一部分物種是可以恢復(fù)的；反復(fù)計劃火燒地特有操作分類單元為3 839個，占操作分類單元總數(shù)的21.24%，可見反復(fù)計劃火燒激發(fā)了新物種的出現(xiàn)。非火燒地特有操作分類單元為6 944個，占操作分類單元總數(shù)的38.43%，說明反復(fù)計劃火燒改變了原有的物種組成。

3.4 試驗(yàn)樣地土壤細(xì)菌群落中物種分布特征

從門水平看，在反復(fù)計劃火燒地與非火燒地，土壤微生物細(xì)菌群落中共檢測到34個門，優(yōu)勢菌(占門總數(shù)量比例>15%)依次為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)。但優(yōu)勢菌在反復(fù)計劃火燒地與非火燒地土壤中占門總數(shù)量的比例存在差異：第一優(yōu)勢菌門變形菌門所占門總數(shù)量的比例，在反復(fù)計劃火燒地與非火燒地中分別為26.26%、28.48%；第二優(yōu)勢菌門酸桿菌門所占門總數(shù)量比例，在反復(fù)計劃火燒地與非火燒地中分別為18.71%、26.38%；第三優(yōu)勢菌門放線菌門所占門總數(shù)量比例，在反復(fù)計劃火燒地與非火燒地中分別為22.43%、19.28%(見表2)。

表2 反復(fù)計劃火燒區(qū)域(RB)、非火燒區(qū)域(UB)土壤細(xì)菌門的群落組成

由表3可見：在門水平上，反復(fù)計劃火燒地與非火燒地中，其數(shù)量占門總數(shù)量比例差異較為顯著的2個物種分別為酸桿菌門、放線菌門，其中，酸桿菌門在反復(fù)計劃火燒地的數(shù)量占門總數(shù)量比例(18.71%)顯著低于非火燒地(26.38%)，降低了1.41倍；而放線菌門在反復(fù)計劃火燒地數(shù)量占門總數(shù)量比例(22.43%)顯著高于非火燒地(19.28%)。反復(fù)火燒區(qū)域出現(xiàn)了非火燒地中未能檢出的物種，其中數(shù)量占門總數(shù)量比例最高的是小基因組菌總門(Microgenomates)。結(jié)果表明：反復(fù)計劃火燒，不同程度地改變了細(xì)菌門類結(jié)構(gòu)組成，不利于變形菌門、酸桿菌門的生長，而有利于放線菌門的生長。

表3 反復(fù)計劃火燒區(qū)域(RB)、非火燒區(qū)域(UB)土壤細(xì)菌門群落組成差異顯著性

從屬水平看，在反復(fù)計劃火燒地與非火燒地，土壤細(xì)菌群落中共檢測到550個屬，排名前10的屬分別為Gp1、Spartobacteria_genera_incertae_sedis、Gp2、Gaiella、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、Gp6、分支桿菌屬(Mycobacterium)、出芽菌屬(Gemmata)、康奈斯氏桿菌屬(Conexibacter)；在反復(fù)計劃火燒地與非火燒地中這10個屬合計共占總屬數(shù)量的比例分別為35.19%、33.89%(見表4)。

表4 反復(fù)計劃火燒區(qū)域(RB)、非火燒區(qū)域(UB)土壤細(xì)菌屬的群落組成

由表5可見：在屬水平上，不同屬在反復(fù)計劃火燒地和非火燒地中的分布也存在差異，其中差異較為顯著的2個物種分別為分支桿菌屬、出芽菌屬。分支桿菌屬，在反復(fù)計劃火燒地的數(shù)量占總屬數(shù)量的比例為3.35%、在非火燒地的數(shù)量占總屬數(shù)量的比例為1.30%。出芽菌屬，在反復(fù)計劃火燒地的數(shù)量占總屬數(shù)量的比例為2.60%、在非火燒地的數(shù)量占總屬數(shù)量的比例為1.42%。而特有物種方面，反復(fù)火燒區(qū)也出現(xiàn)了多個非火燒區(qū)未能檢出的物種，其中數(shù)量占總屬數(shù)量比例最高的是異庫茲涅爾氏菌屬(Allokutzneria)。與門水平相似，反復(fù)計劃火燒，不同程度地改變了細(xì)菌屬水平上的結(jié)構(gòu)組成。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的改變，進(jìn)一步影響著細(xì)菌群落豐富度、多樣性、均一性等，這與細(xì)菌群落α多樣性分析結(jié)果相印證。

表5 反復(fù)計劃火燒區(qū)域(RB)、非火燒區(qū)域(UB)土壤細(xì)菌屬群落組成差異顯著性

3.5 反復(fù)計劃火燒地與非火燒地的土壤細(xì)菌群落差異

非度量多維尺度(NMDS)分析結(jié)果顯示，土壤細(xì)菌群落按照反復(fù)計劃火燒區(qū)域與非火燒區(qū)域分別聚集在一起，說明2個樣品組內(nèi)的樣本間細(xì)菌群落組成相似，即組內(nèi)樣本間數(shù)據(jù)重復(fù)性較好；反復(fù)計劃火燒區(qū)域與非火燒區(qū)域土壤細(xì)菌群落相互分離，說明2組樣本有較顯著的細(xì)菌群落組成差異；且協(xié)強(qiáng)系數(shù)(Stress)<0.05，表明結(jié)果具有較好的代表性。由此可見，反復(fù)計劃火燒后土壤細(xì)菌群落發(fā)生了明顯變化(見圖2)。

4 討論與結(jié)論

4.1 反復(fù)計劃火燒對土壤細(xì)菌群落的影響

本研究表明，反復(fù)計劃火燒地與非火燒地的微生物群落存在顯著差異，且計劃火燒降低了土壤微生物群落的物種豐富度、物種多樣性。土壤細(xì)菌群落發(fā)生顯著變化，其原因主要是因?yàn)榉磸?fù)計劃火燒時的高溫以及產(chǎn)生的灰燼改變了土壤理化性質(zhì)(土壤水分、pH、通氣性、溫度等)，加速了有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮；而無機(jī)氮的添加和土壤理化性質(zhì)的改變，會造成土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的變化[16-17]。另一方面，反復(fù)的計劃火燒既會減少林下枯落物的載量，也能改變森林植物的組成，進(jìn)而改變林下枯落物的種類，最終導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境的改變，并引起棲息其中的細(xì)菌群落的改變[18]。而細(xì)菌群落的多樣性降低，則是因?yàn)橐韵略颍阂皇欠磸?fù)計劃火燒降低了土壤的有機(jī)碳、養(yǎng)分等，缺乏相應(yīng)的養(yǎng)分或碳源會導(dǎo)致細(xì)菌多樣性的降低[19]；二是火燒會破壞土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，使得土壤板結(jié)，且火燒的次數(shù)越頻繁土壤板結(jié)越嚴(yán)重[20]，土壤板結(jié)會導(dǎo)致土壤微生物多樣性降低[21]。而物種豐富度、多樣性的降低，說明土壤微生物群落的穩(wěn)定性下降，這會間接影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[22]。

4.2 反復(fù)計劃火燒對不同細(xì)菌影響的程度不同

在反復(fù)計劃火燒之后，酸桿菌門相對豐度比非火燒地下降了1.41倍，說明反復(fù)計劃火燒不利于酸桿菌門細(xì)菌生長繁殖；原因是，酸桿菌門嗜酸，火燒使土壤pH增加[23]，導(dǎo)致其生活環(huán)境改變，不利于該門細(xì)菌生存[24]。酸桿菌門是土壤微生物家族重要的一員，其中的有些類群可以降解纖維素，對植物殘體的降解起著重要的作用[25]。在厭氧的條件下，酸桿菌以Fe離子作為受體還原鐵，參與鐵循環(huán)[26]，具有光合作用的能力[27]。由此可見，酸桿菌門細(xì)菌在森林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，在生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與構(gòu)建、物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用[28]。反復(fù)計劃火燒顯著降低其數(shù)量，會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。另外，在屬水平上，反復(fù)計劃火燒之后，分支桿菌屬、出芽菌屬2個優(yōu)勢屬的相對豐度，比非火燒地均有所增加，說明反復(fù)計劃火燒改變了土壤細(xì)菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)分布，提高了某些細(xì)菌在屬水平的群落豐富度；但二者的生態(tài)學(xué)功能尚未明確，需開展進(jìn)一步的研究。綜合看，反復(fù)計劃火燒會改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但變化明顯的物種中有部分雖然已知其功能，是否會因其數(shù)量的變化導(dǎo)致整個生態(tài)系統(tǒng)的破壞尚未可知，畢竟對于物種多樣性豐富的土壤微生物群落，個別物種的變化可以借助其他類群反映其相同的功能；另一方面，變化明顯的物種中還有大量尚未明確其功能的物種，無法確定其數(shù)量的變化對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。因此，在森林管理中，還應(yīng)加強(qiáng)對其基礎(chǔ)部分——土壤微生物群落的功能研究。

4.3 反復(fù)計劃火燒后土壤細(xì)菌群落中出現(xiàn)多個特有種

本研究表明，雖然反復(fù)計劃火燒降低了土壤細(xì)菌群落的多樣性，但也出現(xiàn)了多個特有種，如小基因組菌總門、異庫茲涅爾氏菌屬等。原因是，反復(fù)的計劃火燒改變了土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生物環(huán)境，常規(guī)生境中優(yōu)勢物種因受到火的直接影響其生物量顯著降低[29]，為其他因數(shù)量稀少而未能被發(fā)現(xiàn)的物種提供了生存空間[30]，其生物量增加，從而能被檢測出；同時，也有研究表明，某些稀有物種受到火的直接刺激作用會大量繁殖[31-32]，因而增加了其被檢出的概率。對其他生物群落的研究中也有類似的現(xiàn)象，如大型真菌Coprinellusangulatus、Lyophyllumatratum只在火燒后的土壤中被檢出[33]；頻繁低強(qiáng)度的火燒會使森林出現(xiàn)了原來生境中不存在的新螞蟻物種[34]。但是，細(xì)菌的整體多樣性在反復(fù)計劃火燒后是降低的，而多樣性的降低通常被認(rèn)為是不利于生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的。由此，本研究認(rèn)為，這些僅在反復(fù)火燒的土壤中才出現(xiàn)的特有物種，對于恢復(fù)與維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能存在重要作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)受到反復(fù)火干擾后恢復(fù)和維持其生態(tài)功能的關(guān)鍵物種。因此，關(guān)于反復(fù)計劃火燒對森林土壤細(xì)菌群落動態(tài)及其功能影響的研究還需要加強(qiáng)。