賀睿智 李澤林 吳健楨 解丹 賈妮婭 孫凡

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

近兩年來，黑龍江省的紅松(Pinuskoraiensis)原始林和人工林中，先后發(fā)現(xiàn)了多種球果種實(shí)害蟲的危害，部分地區(qū)受害嚴(yán)重，造成紅松種子產(chǎn)量和質(zhì)量下降，給苗木繁育及松籽產(chǎn)業(yè)帶來巨大的影響和損失。如林口縣通天一林場(chǎng)，近三年來結(jié)實(shí)人工紅松林球果的受害率近100%，致使部分林分種實(shí)顆粒無收。

害蟲種類鑒定是種群控制工作的基礎(chǔ)，幼蟲鑒定是制定防治方案和蟲害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的關(guān)鍵。與昆蟲成蟲形態(tài)相比，有關(guān)幼蟲形態(tài)特征的研究和記載較少。雖然鱗翅目幼蟲的形態(tài)分類特征較少，但具有一定的穩(wěn)定性，是種類鑒別的重要依據(jù)[1-2]。DNA條形碼是生物分類學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)的一項(xiàng)新技術(shù)，其本質(zhì)是利用一段含有生物信息的DNA片段進(jìn)行物種鑒別。在昆蟲分類領(lǐng)域，主要采用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單元Ⅰ基因(COⅠ)進(jìn)行DNA標(biāo)記。COⅠ基因容易利用通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，同時(shí)在近緣種間基因的差異又足夠大，所以該基因鑒定可以快速標(biāo)記物種的分子特征，對(duì)依據(jù)形態(tài)特征的昆蟲鑒定有輔助和驗(yàn)證作用[3]。

球果害蟲幼蟲生活隱蔽，多種害蟲混合發(fā)生，致使種群鑒定較為困難。關(guān)于紅松球果幼蟲形態(tài)研究的文獻(xiàn)較少，上世紀(jì)80年代白九維[4]進(jìn)行了為害針葉樹的幾種卷蛾幼期研究，包含了部分紅松球果害蟲；2002年，樸美花等[5]描述了3種韓國紅松球果害蟲的幼蟲形態(tài)特性。2020年，盧孟等[6-7]采用毛位圖展示球果害蟲幼蟲的形態(tài)特征，使幼蟲鑒定更為直觀和簡便。本研究于2020年6—9月份在黑龍江省七臺(tái)河市林口縣持續(xù)采集受害球果，收集球果害蟲的幼蟲，發(fā)現(xiàn)不同月份球果內(nèi)害蟲的種類和數(shù)量明顯不同。本研究利用幼蟲形態(tài)特征并結(jié)合線粒體COⅠ對(duì)比進(jìn)行種類鑒定，對(duì)幼蟲形態(tài)特別是毛位特征進(jìn)行了更加詳細(xì)的描述，分析了不同害蟲在紅松球果內(nèi)發(fā)生時(shí)序，旨在為紅松球果害蟲的種群鑒定和精準(zhǔn)防控提供參考。

1 材料與方法

蟲源：2020年6月6日、7月10日、8月10日、9月15日，在黑龍江省七臺(tái)河市林口縣通天一林場(chǎng)40～50年紅松林內(nèi)采集2年生受害球果，每次采集受害球果50個(gè)左右。球果下樹后立即移到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，陰干2～3 d后剝開球果檢出所有球果害蟲，浸泡在體積分?jǐn)?shù)為85%的酒精中保存。

幼蟲形態(tài)鑒定與描述：在體視顯微鏡下觀察幼蟲外部形態(tài)，幼蟲頭部朝向觀察者左側(cè)。首先依據(jù)陸近仁等[1]、Capps[8]編寫的鱗翅目幼蟲檢索表鑒定至科，再與已知松屬植物球果害蟲幼蟲形態(tài)特征進(jìn)行比對(duì)，確定樣本的種類；描述幼蟲形態(tài)并繪制幼蟲毛位圖，繪制方法及毛序的命名借鑒文獻(xiàn)[2]、[6]。

分子標(biāo)記鑒定：選用線粒體COⅠ基因作為分子標(biāo)記，每種幼蟲選取10只待測(cè)樣本。使用天根DNA提取試劑盒(DP304)，并參照試劑盒中提供的方法從樣本中提取總DNA。使用通用引物對(duì)線粒體COⅠ基因片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，上游引物L(fēng)CO1490，5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，下游引物HCO2198，5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[7]，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系含DNA模板1 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)酶系預(yù)混液(Premix Taq)25 μL，加無菌水補(bǔ)至50 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸7 min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和測(cè)序，測(cè)序引物同擴(kuò)增引物，采用正反雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAstar v7.1軟件包中Seq Man程序進(jìn)行拼接和校正，并去除序列兩端引物部分。使用NCBI及BOLD數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行相似性比對(duì)。

害蟲發(fā)生時(shí)序測(cè)定：統(tǒng)計(jì)不同采樣時(shí)間球果幼蟲總數(shù)及不同種類幼蟲的數(shù)量，計(jì)算不同種類占總蟲數(shù)的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅松球果害蟲幼蟲形態(tài)及分子標(biāo)記鑒定

2.1.1 油松球果小卷蛾(Gravitarmatamargarotana)

依據(jù)鱗翅目幼蟲分科檢索表鑒定至卷蛾科(Tortricidae)小卷蛾亞科(Olethreutinae)；并與白九維[4]、盧孟[6]描述的油松球果小卷蛾幼蟲的形態(tài)特征大體相近。

形態(tài)特征：老熟幼蟲體長15～17 mm，體表肉紅色到紅褐色，頭部及前胸背板深褐色。毛片不明顯，顏色僅略深于體色。由圖1可見：第一胸節(jié)(T1)，氣門盾近方形，著生3根剛毛和1個(gè)明顯的毛孔，3根剛毛位置不在一條直線上，呈鈍角三角形排列。第二胸節(jié)(T2)和第三胸節(jié)(T3)背毛和亞背毛均2根，著生在圓形毛片上，毛片相接或略有分離。第一腹節(jié)(A1)至第七腹節(jié)(A7)亞背毛與亞背微毛在一圓形毛片上，與氣門不相連。第八腹節(jié)(A8)亞背毛與亞背微毛位于同一毛片，位置在氣門前側(cè)下方。第九腹節(jié)(A9)背板兩側(cè)中央有缺口。第十腹節(jié)(A10)，臀板前2根剛毛上下縱向排列，后2根剛毛橫向排列，位置與前側(cè)2根剛毛中的低位者平齊。

分子標(biāo)記鑒定：將測(cè)序樣本測(cè)序結(jié)果在BOLD數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，與庫中G.margarotana的序列相似度為99.84%，驗(yàn)證了形態(tài)鑒定的結(jié)果。

2.1.2 小卷蛾未知種(Cydiasp.)

依據(jù)鱗翅目幼蟲檢索表鑒定至卷蛾科(Tortricidae)小卷蛾亞科(Olethreutinae)；與盧孟[6]記錄的小卷蛾屬未知種(Cydiasp.)特征大體相近。

形態(tài)特征：老熟幼蟲體長7～9 mm，頭部及背板土黃色，體表淺米色。頭部單眼區(qū)與頰后區(qū)有棕色暗斑。毛片不明顯，顏色僅比體色略深。由圖2可見：第一胸節(jié)(T1)，氣門盾月牙形，有3根剛毛，排列不在一條直線上，中間的剛毛最長。第二胸節(jié)(T2)及第三胸節(jié)(T3)，背毛和亞背毛均2根，背毛位于一個(gè)長形毛片，亞背毛位于一個(gè)近葫蘆形毛片。第一腹節(jié)(A1)至第七腹節(jié)(A7)，亞背毛與亞背微毛在一個(gè)橫向毛片且與氣門相連。第八腹節(jié)(A8)，亞背毛和亞背微毛在一個(gè)近圓形毛片，位置在氣門正前方。第十腹節(jié)(A10)，臀板前2根剛毛上下縱向排列，后2根剛毛橫向排列，位置與前側(cè)2根剛毛中的低位者平齊。

分子標(biāo)記鑒定：將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，相似度較高的序列均為小卷蛾屬(Cydia)，序列相似度最高為92.57%(Cydiasp.，KT142096.1)，暫定為小卷蛾屬。

2.1.3 冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)

依據(jù)鱗翅目幼蟲分科檢索表鑒定至螟蛾科(Pyralidae)，與樸美花等[5]、盧孟[6]描述的冷杉梢斑螟幼蟲形態(tài)大體相同。

形態(tài)特征：老熟幼蟲體長18～26 mm，體色變異較大，可分為深色型和淺色型兩種體色，深色型體背棕黑或灰黑色，腹面灰白色，體褶處有斷斷續(xù)續(xù)的深褐色刻點(diǎn)；淺色型體背污黃或淺棕色，背中線深棕色，蟲體兩側(cè)背毛和亞背毛之間各有一條線狀斑紋，腹面淺黃微紅。幼齡幼蟲毛片顏色較深，老齡幼蟲氣門以下毛片顏色變淺。由圖3可見：第一胸節(jié)(T1)，氣門盾馬蹄形，位置在氣門的正前方，寬度略大于氣門直徑，上下排列著生2根剛毛，上側(cè)剛毛較短。第二胸節(jié)(T2)，亞背毛2根，較長者著生在圓形淺色毛片上，外面圍繞著深色骨化環(huán)，較短者著生在骨化環(huán)上。第三胸節(jié)(T3)，亞背毛2根，著生在一個(gè)葫蘆形毛片上。第八腹節(jié)(A8)，亞背毛片淺色，外環(huán)繞一個(gè)深色的骨化環(huán)。第九腹節(jié)(A9)，亞背毛2根，著生在2個(gè)圓形毛片上，彼此分離；側(cè)毛群3根，位于一個(gè)長形毛片上。第十腹節(jié)(A10)，臀板上第二根剛毛位置低于其他3根剛毛。

分子標(biāo)記鑒定：將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，與庫中D.abietella(KX046464)的序列相似度為100%，驗(yàn)證了形態(tài)鑒定的結(jié)果。

2.1.4 赤松梢斑螟(D.sylvestrella)

依據(jù)鱗翅目幼蟲分科檢索表鑒定至螟蛾科(Pyralidae)，與樸美花等[5]、盧孟等[6]描述的赤松梢斑螟幼蟲形態(tài)一致。

形態(tài)特征：老熟幼蟲體長16～25 mm，頭部黑褐色，前胸背板黑色略有光澤，體背灰黑色，腹面灰白色，體表密布黑色刻點(diǎn)，褶皺處居多。各體節(jié)毛片均較大且顏色較深。由圖4可見：第一胸節(jié)(T1)，氣門盾較大，位置偏向氣門下方，包圍氣門周長約四分之一，氣門盾上下排列著生2根剛毛，下側(cè)剛毛較長。第二胸節(jié)(T2)，亞背毛2根，較長者著生在圓形淺色毛片上，外面圍繞著深色骨化環(huán)，較短者著生在骨化環(huán)上。第三胸節(jié)(T3)，亞背毛2根，著生在一個(gè)橢圓形毛片上。第八腹節(jié)(A8)，亞背毛片外環(huán)繞一個(gè)深色的骨化環(huán)。第九腹節(jié)(A9)，亞背毛2根，2個(gè)毛片相接或略有分離；側(cè)毛群3根，位于一個(gè)長形毛片。第十腹節(jié)(A10)，臀板上前2根剛毛上下縱向排列，后2根剛毛橫向排列，位置與前2根剛毛中的高位者平齊。

分子標(biāo)記鑒定：將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，與庫中D.sylvestrella的序列相似度為99.54%(DQ247746.1)，驗(yàn)證了形態(tài)鑒定的結(jié)果。

2.1.5 小花尺蛾(Eupitheciaabietariadebrunneata)

依據(jù)鱗翅目幼蟲檢索表鑒定至尺蛾科(Geometridae)，與樸美花等[5]、盧孟[6]描述的小花尺蛾幼蟲形態(tài)一致。

形態(tài)特征：老熟幼蟲體長20～25 mm，體表淺褐色。頭部及背板紅褐色，頭部單眼區(qū)及頰后區(qū)有暗斑。各體節(jié)毛片明顯，顏色較深。由圖5可見：第一胸節(jié)(T1)，氣門盾橢圓形，遠(yuǎn)離氣門，著生2根上下排列的剛毛，上長下短。除第一胸節(jié)(T1)和第十腹節(jié)(A10)外，其他體節(jié)的毛片均為圓形，上面只著生1根剛毛，且相互分離。第一腹節(jié)(A1)至第五腹節(jié)(A5)，每個(gè)體節(jié)腹毛2根。第八腹節(jié)(A8)腹毛1根。第九腹節(jié)(A9)共有毛片6根，呈縱向直線排列。第十腹節(jié)(A10)，臀板上著生5根剛毛，位置可分為上下兩排，上排2根，下排3根。

分子標(biāo)記鑒定：將測(cè)序結(jié)果在BOLD數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，與庫中E.abietariadebrunneata的序列相似度為99.69%，驗(yàn)證了形態(tài)鑒定的結(jié)果。

2.2 林口紅松球果害蟲發(fā)生時(shí)序

由表1可見：油松球果小卷蛾是最先入侵的害蟲，6月初已經(jīng)入侵紅松球果，這個(gè)時(shí)候還沒有見到其它害蟲的蹤跡。7月中旬球果中共發(fā)現(xiàn)4種幼蟲，此時(shí)油松球果小卷蛾因大部分幼蟲化蛹，數(shù)量極少(2.20%)；冷杉梢斑螟的個(gè)體最多，占總數(shù)的76.92%；小卷蛾未知種和赤松梢斑螟，各占總數(shù)的13.19%、7.69%。8月份、9月份，球果內(nèi)有3種幼蟲，其中2種梢斑螟的相對(duì)比例變化不大，并在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)(91.80%～94.81%)，小花尺蛾的數(shù)量較少(5.19%～9.20%)。

表1 不同采樣時(shí)間球果內(nèi)害蟲種類及其占害蟲總數(shù)比例

3 結(jié)論與討論

同種類的幼蟲個(gè)體間體色、體態(tài)變異較大，但毛序特征具有穩(wěn)定性，以幼蟲的毛序作為形態(tài)特征保證了種類鑒定的準(zhǔn)確性。毛位圖使鑒別特征更加直觀，大幅度提高了鑒定效率。特別是林業(yè)生產(chǎn)單位，只需要實(shí)體顯微鏡就可以依據(jù)毛序特征進(jìn)行幼蟲種類鑒定，方便可行。

分子標(biāo)記物種鑒定，不但對(duì)傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定有輔助和驗(yàn)證作用，還可以判斷種群之間的譜系關(guān)系及是否存在復(fù)合種。無論幼蟲形態(tài)鑒定，還是分子標(biāo)記鑒定，都需要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)儲(chǔ)備。本研究中，6月份受害球果中的卷蛾科幼蟲鑒定油松球果小卷蛾，7月份受害球果又出現(xiàn)了另一種卷蛾科幼蟲，現(xiàn)有的資料無法利用形態(tài)對(duì)其進(jìn)行種類鑒定，COⅠ技術(shù)也只能暫定為小卷蛾屬，有待于利用成蟲特征進(jìn)一步確定其種類。

從不同害蟲在球果內(nèi)發(fā)生時(shí)序看出，林口縣小卷蛾類是紅松球果的先鋒種類。在6-7月份，球果體積增長期即入侵球果蛀道取食，雖然這2種害蟲幼蟲歷期較短，但對(duì)球果的生長發(fā)育影響較大。2種梢斑螟在卷蛾之后入侵，并且數(shù)量大、發(fā)育期長，對(duì)球果種實(shí)的營養(yǎng)積累影響較大。小花尺蛾入侵球果較晚，在林口縣發(fā)生的數(shù)量較少，危害相對(duì)較輕。

掌握幼蟲發(fā)生的時(shí)序規(guī)律也有助于幼蟲的鑒定。在林口縣，油松球果小卷蛾6月初已經(jīng)入侵紅松球果，7月份會(huì)出現(xiàn)2種卷蛾和2種梢斑螟，其中卷蛾體色淺、毛片不明顯，而梢斑螟體色深、毛片明顯，故根據(jù)體色即能區(qū)分這2個(gè)類群。因7月初油松球果小卷蛾基本處于老熟幼蟲階段，體色為肉紅色，體長明顯高于另外1種卷蛾，由此可以區(qū)分2種卷蛾。8月份小花尺蛾開始危害，其幼蟲只有2對(duì)腹足，憑借此特征可以快速地與梢斑螟區(qū)分開。但2種梢斑螟發(fā)生時(shí)間相同，體色變異大，需要依據(jù)毛序特征進(jìn)行幼蟲種類鑒定。

本研究表明，冷杉梢斑螟體色，大體可分為深色型和淺色型2類，其中深色型與赤松梢斑螟體色相近，并與后者一樣，在體表有斷斷續(xù)續(xù)的深色刻點(diǎn)。在我國這2種梢斑螟普遍混合發(fā)生[9]，并且發(fā)生歷期重合，是否存在復(fù)合種有待進(jìn)一步研究確定。