王一銘，劉建波，馮 力

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種接觸性腸道傳染病[1]，該病多發(fā)于仔豬，造成急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡，死亡率可達(dá)100%。PEDV 于20世紀(jì)70 年代在英國流行[2]，2010 年中國出現(xiàn)PEDV 的變異株，并大規(guī)模暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前對(duì)該病的防制措施主要是通過給母豬接種疫苗，使其產(chǎn)生母源抗體進(jìn)而達(dá)到免疫仔豬的目的。近幾年的臨床實(shí)踐表明，疫苗的保護(hù)效率達(dá)不到100%，仍有部分免疫過的豬場(chǎng)暴發(fā)疫情，所以急需找到一種能夠有效阻止PEDV 感染的方法[4]。

PEDV 屬于套式病毒目，冠狀病毒科，α 冠狀病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，復(fù)制時(shí)依賴RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）[5]。RdRp 是大多數(shù)RNA 病毒中最保守的酶，在病毒的復(fù)制周期中起著至關(guān)重要的催化作用，因此RdRp 也被認(rèn)為是很好的抗病毒靶點(diǎn)[6]。瑞德西韋（Remdesivir）是一種核苷類似物，也是一種廣譜的抗病毒藥物[7]，它在病毒的基因組復(fù)制時(shí)能抑制RdRp，干擾病毒的復(fù)制[8]。2020 年出現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 型（SARS-CoV-2）也是一種RNA 病毒，Alexander 的研究中評(píng)估了多種藥物的抗SARS-CoV-2 特性，其中瑞德西韋是唯一一種在臨床前和臨床中均顯示較好療效的抗病毒藥物，它縮短了患者的康復(fù)時(shí)間，并能降低死亡率[9]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，瑞德西韋可以用于治療中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒（SARSCoV）、SARS-CoV-2等的感染，且效果較好[10-11]。PEDV與MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2 同屬于冠狀病毒，本研究通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）、熒光定量PCR、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（western blot）以及病毒滴度（TCID50）測(cè)定的方法，檢測(cè)瑞德西韋在體外對(duì)PEDV 復(fù)制的影響，為臨床治療感染PEDV 的仔豬提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料Vero E6 細(xì)胞系、PEDV LNCT2株由本實(shí)驗(yàn)室保存；鼠PEDV S 蛋白單克隆抗體（MAb）1B9[12]、鼠PEDV N 蛋白MAb 2G3、PEDV N 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p3×flag-PEDV N 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；DMEM 培養(yǎng)液和0.25%胰酶購自Gibco 公司；瑞德西韋購自Targetmol公司；DMSO購自Amresco公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自北仁化學(xué)科技（北京）公司；RNA 提取試劑盒購自QIAGEN 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix、熒光定量 試 劑盒TB Green?Premix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）購自寶生物工程（大連）有限公司；AF488 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 抗體、IRDye 680CW 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、IRDye 800CW標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自Invitrogen公司；兔抗GAPDH抗體購自Sigma公司。

1.2 瑞德西韋的細(xì)胞毒性測(cè)定稱取131 mg 瑞德西韋，溶于800 μL DMSO 中，定容至1 mL，配制成217 mmol/L 的溶液。向長滿單層Vero E6 細(xì)胞的96 孔板中分別加入不同濃度（1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）的瑞德西韋溶液，每孔10 μL，37 ℃培養(yǎng)48 h，以不作任何處理的細(xì)胞為空白對(duì)照，DMSO 接種組為陰性對(duì)照，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。通過公式：細(xì)胞存活率=[（實(shí)驗(yàn)孔OD450nm值-空白孔OD450nm值）/（對(duì)照孔OD450nm值-空白孔OD450nm值）]*100%，計(jì)算出瑞德西韋對(duì)Vero E6 細(xì)胞的毒性。

1.3 不同濃度瑞德西韋對(duì)PEDV 復(fù)制影響的檢測(cè)分別將不同濃度（1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L）的瑞德西韋與MOI 0.1 的PEDV 混勻后，加入12 孔板中的Vero E6 細(xì)胞中，以健康細(xì)胞作為空白對(duì)照，只接種PEDV 細(xì)胞作為陽性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，0.2%Triton-100 透膜20 min，5%脫 脂 乳 封 閉1 h。以MAb 1B9（1∶3 000）為 一 抗，AF488 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶500）為二抗，37 ℃避光孵育1 h，DAPI 染色20 min，經(jīng)IFA 檢測(cè)瑞德西韋的抗病毒效果。37 ℃培養(yǎng)24 h 后收獲細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為模板，以PEDV N 質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)熒光定量PCR 檢測(cè)PEDV N 基因的轉(zhuǎn)錄水平（上游引物：TTGGCATTTCTACTACCTC/下游引物：AGACGCCTTTCTGACACC）。37 ℃培養(yǎng)24 h 后收獲細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)印至NC 膜，用5%脫脂乳封閉2 h。分別以MAb 2G3（1∶3 000）和兔抗GAPDH 抗體（1∶5 000）為一抗，IRDye 680CW 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶10 000）和IRDye 800CW 標(biāo)記的山羊抗 兔IgG（1∶10 000）為 二 抗，經(jīng)western blot 檢 測(cè)PEDV N 蛋白的表達(dá)量。收集細(xì)胞上清，測(cè)定上清中的TCID50，檢測(cè)瑞德西韋對(duì)PEDV 復(fù)制的影響。

1.4 瑞德西韋半數(shù)有效濃度（EC50）的測(cè)定分別將不同濃度（1 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L、 12 μmol/L、 14 μmol/L、 16 μmol/L、18 μmol/L、20 μmol/L）的 瑞 德 西 韋 與MOI 0.1 的PEDV 混勻后，接種至12 孔板中長滿單層的Vero E6細(xì)胞中。以健康細(xì)胞作為空白對(duì)照，只接種PEDV 細(xì)胞作為陽性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置8 個(gè)平行孔，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。通過公式：抑制率=[（實(shí)驗(yàn)孔OD450nm值-陽性對(duì)照孔OD450nm值）/（陰性對(duì)照孔OD450nm值-陽性對(duì)照組OD450nm值）]*100%，計(jì)算出瑞德西韋的抑制率，利用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪圖并計(jì)算出瑞德西韋的EC50。

1.5 瑞德西韋在EC50 下對(duì)PEDV 復(fù)制影響的檢測(cè)根據(jù)1.4 中測(cè)定的瑞德西韋的EC50，將11.97 μmol/L的瑞德西韋與MOI 0.1 的PEDV 混勻后，接種至12 孔板中長滿單層的Vero E6 細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)。以健康細(xì)胞作為空白對(duì)照，只接種PEDV 細(xì)胞作為陽性對(duì)照，分別在4 h、12 h、20 h、24 h 固定細(xì)胞，采用1.3 中的方法進(jìn)行IFA 檢測(cè)。收獲細(xì)胞樣品，采用1.3中的方法，經(jīng)熒光定量PCR、western blot 檢測(cè)瑞德西韋在EC50下對(duì)PEDV 復(fù)制的影響。

1.6 瑞德西韋最佳給藥方式的測(cè)定根據(jù)1.3 中測(cè)定的完全抑制PEDV 復(fù)制的瑞德西韋的濃度，將16 μmol/L 的瑞德西韋與MOI 0.1 的PEDV，以不同的給藥方式，接種至12 孔板中長滿單層Vero E6 細(xì)胞中。A 組：先將瑞德西韋加入細(xì)胞預(yù)處理，1 h 后接種PEDV，反應(yīng)2 h 后洗去病毒-藥物混合物，加入瑞德西韋；B 組：先將瑞德西韋加入細(xì)胞預(yù)處理，1 h后接種PEDV，反應(yīng)2 h 后洗去病毒-藥物混合物，加入不含瑞德西韋的DMEM；C 組：不預(yù)處理，將瑞德西韋與PEDV 混勻后加入細(xì)胞，反應(yīng)2 h 后洗去病毒-藥物混合物，加入瑞德西韋；D 組：不預(yù)處理，將瑞德西韋與PEDV 混勻后加入細(xì)胞，反應(yīng)2 h 后洗去病毒-藥物混合物，加入不含瑞德西韋的DMEM；E 組：不預(yù)處理，將PEDV 接種細(xì)胞，反應(yīng)2 h 后洗去后加入瑞德西韋。以健康細(xì)胞作為空白對(duì)照，只接種PEDV 細(xì)胞作為陽性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h 后后采用1.3 中的方法，經(jīng)IFA、western blot 測(cè)定瑞德西韋的最佳給藥方式。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用GraphPad Prism 9軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、分析差異性并繪圖，數(shù)據(jù)用平均標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，*通過t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（*：P＜0.05表示差異顯著；**：P＜0.01、***：P＜0.001表示差異極顯著）。

2 結(jié) 果

2.1 瑞德西韋細(xì)胞毒性測(cè)定的結(jié)果向Vero E6 細(xì)胞中分別加入不同濃度的瑞德西韋溶液，并加入CCK-8 溶液，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，細(xì)胞的存活率隨瑞德西韋濃度的升高而降低，低濃度的瑞德西韋幾乎不影響細(xì)胞生長，高濃度的瑞德西韋對(duì)細(xì)胞有毒性，導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。加入的瑞德西韋濃度為1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率在100%以上（圖1），表明這些濃度的瑞德西韋無細(xì)胞毒性；當(dāng)瑞德西韋濃度為50 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率降至88%，表明該濃度的瑞德西韋對(duì)細(xì)胞生長有影響，所以應(yīng)選擇不超過50 μmol/L 的瑞德西韋進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 瑞德西韋的細(xì)胞毒性Fig.1 The cytotoxic of Remdesivir

2.2 不同濃度瑞德西韋對(duì)PEDV 復(fù)制影響的檢測(cè)結(jié)果 將PEDV 與不同濃度的瑞德西韋混勻后加入Vero E6 細(xì)胞中，24 h 后檢測(cè)瑞德西韋的抗病毒效果。IFA結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，綠色熒光逐漸減弱（圖2A）；當(dāng)瑞德西韋濃度為16 μmol/L 時(shí)，只能看到極少的綠色熒光；當(dāng)瑞德西韋濃度為32 μmol/L時(shí)，完全看不到綠色熒光。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，隨著瑞德西韋濃度的升高，PEDV N 基因的轉(zhuǎn)錄水平降低（圖2B），當(dāng)瑞德西韋濃度為8 μmol/L及以上時(shí)，N 基因的轉(zhuǎn)錄水平與陽性對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.01）。Western blot及灰度值分析結(jié)果顯示，隨著瑞德西韋濃度的升高，PEDV N 蛋白表達(dá)量降低（圖2C、圖2D），當(dāng)瑞德西韋濃度為16 μmol/L、32 μmol/L時(shí)，與陽性對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.001）。TCID50結(jié)果顯示，取瑞德西韋濃度為16 μmol/L、32 μmol/L時(shí)的上清接種健康細(xì)胞，細(xì)胞未發(fā)生病變，檢測(cè)不到TCID50（圖2E）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑞德西韋對(duì)PEDV 在Vero E6 細(xì)胞中的復(fù)制有抑制作用，瑞德西韋濃度越高，抑制作用越好。當(dāng)瑞德西韋的濃度為8 μmol/L時(shí)，能夠顯著抑制PEDV 的復(fù)制；濃度為16 μmol/L的瑞德西韋，能夠完全抑制PEDV 的復(fù)制。

圖2 不同濃度瑞德西韋對(duì)PEDV復(fù)制影響的IFA（A）、熒光定量PCR（B）、western blot（C）、灰度值分析（D）及TCID50（E）檢測(cè)結(jié)果Fig.2 IFA(A),fluorescence quantitative PCR(B),western blot(C),gray value analysis(D)and TCID50(E)results of the effects of different concentrations of Remdesivir on PEDV replication

2.3 瑞德西韋EC50測(cè)定的結(jié)果將PEDV 與不同濃度的瑞德西韋混勻后加入Vero E6 細(xì)胞中，48 h 測(cè)定瑞德西韋的EC50，結(jié)果顯示，瑞德西韋的EC50為11.97 μmol/L（圖3）。

圖3 瑞德西韋EC50的測(cè)定結(jié)果Fig.3 The EC50 of Remdesivir

2.4 瑞德西韋在EC50下對(duì)PEDV 復(fù)制影響的檢測(cè)結(jié)果將PEDV 與瑞德西韋混勻后加入Vero E6 細(xì)胞中，在不同時(shí)間點(diǎn)固定后檢測(cè)瑞德西韋在EC50下對(duì)PEDV復(fù)制的影響。IFA結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組在12 h時(shí)能看見較為明顯的綠色熒光，20 h、24 h 時(shí)熒光強(qiáng)度極強(qiáng)；而加入瑞德西韋的實(shí)驗(yàn)組在12 h、20 h、24 h 均僅能看到較少的綠色熒光（圖4A）。熒光定量PCR 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在12 h、20 h、24 h 時(shí)N 基因的轉(zhuǎn)錄水平均處于較低水平，與陽性對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.001，圖4B）。Western blot 結(jié)果及灰度值分析顯示，在12 h、20 h、24 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組N 蛋白的表達(dá)量均處于較低水平，與陽性對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.01，圖4C、圖4D）。以上結(jié)果表明，瑞德西韋能夠抑制PEDV 的復(fù)制，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均有顯著的抑制效果。

圖4 瑞德西韋在EC50下對(duì)PEDV復(fù)制影響的IFA（A）、熒光定量PCR（B）、western blot（C）及灰度值分析（D）檢測(cè)結(jié)果Fig.4 IFA(A),fluorescence quantitative PCR(B),western blot(C)and gray value analysis(D)results of the effects of Remdesivir on PEDV replication at the dose of an EC50

2.5 瑞德西韋最佳給藥方式的測(cè)定結(jié)果將瑞德西韋與PEDV以不同的給藥方式接種Vero E6細(xì)胞，檢測(cè)瑞德西韋的最佳給藥方式。IFA結(jié)果顯示，A組、C組、E組僅出現(xiàn)微弱的綠色熒光，B組、D組出現(xiàn)很強(qiáng)的綠色熒光（圖5A）。Western blot 結(jié)果與灰度值分析結(jié)果顯示，A 組、C 組、E 組PEDV N 蛋白的表達(dá)量與陽性對(duì)照組相比明顯降低，差異極顯著（P＜0.001）。而B 組、D組N蛋白的表達(dá)量仍處于較高水平，與陽性對(duì)照組相比未見明顯差異（圖5B、圖5C）。TCID50結(jié)果顯示，A組、C 組、E 組的上清接種細(xì)胞后不能使細(xì)胞產(chǎn)生病變（圖5D）。以上結(jié)果表明，A 組（接種PEDV 前給藥，且持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束）、C 組（接種PEDV 同時(shí)給藥，且持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束）、E 組（接種PEDV 后給藥，且持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束）的給藥方式均能夠有效抑制PEDV 復(fù)制，而B 組（在接種PEDV 前及接種時(shí)給藥，之后洗去）、D 組（僅在接種PEDV 時(shí)給藥，之后洗去）的給藥方式對(duì)PEDV 的復(fù)制幾乎無影響。以上結(jié)果顯示，A、C、E 組的給藥方式對(duì)PEDV 的抑制效果較好。表明瑞德西韋作為接種病毒前的預(yù)防性給藥，未能見顯著的抗病毒效果；而作為治療性給藥，對(duì)病毒的復(fù)制有明顯的抑制作用。

圖5 瑞德西韋最佳給藥方式的IFA（A）、western blot（B）、灰度值分析（C）及TCID50（D）檢測(cè)結(jié)果Fig.5 IFA(A),western blot(B),gray value analysis(C)and TCID50(D)results of the best administration way of Remdesivir

3 討 論

PEDV 是引起仔豬腹瀉、消瘦、脫水、死亡的重要病原之一，嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，已經(jīng)開發(fā)出針對(duì)PEDV 的弱毒疫苗、滅活疫苗，但由于PEDV S 基因變異株的流行及其他豬腹瀉病毒的混合感染，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗保護(hù)效率降低，疫情防控也日益復(fù)雜。盡管目前已經(jīng)有研究報(bào)道，PEDV 中和性抗體能夠有效阻斷PEDV 感染細(xì)胞，但相關(guān)抗病毒產(chǎn)品仍在研發(fā)階段[13]，能夠治療PEDV 感染的化學(xué)性藥物也尚未開發(fā)。因此，研發(fā)新型的PEDV 疫苗刻不容緩，同時(shí)尋找其他治療PEDV 感染的有效方法也十分必要。

本研究選取了在新冠疫情中被多次報(bào)道可以用于治療SARS-CoV-2，且有較好效果的核苷類藥物—瑞德西韋，來探究其能否影響與SARS-CoV-2 同屬于冠狀病毒的PEDV 的復(fù)制。在PEDV 的易感細(xì)胞Vero E6 中進(jìn)行的細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度的瑞德西韋幾乎無細(xì)胞毒性，不會(huì)影響細(xì)胞的生長，說明瑞德西韋可以用于抑制PEDV 復(fù)制影響的研究。將不同濃度的瑞德西韋與PEDV 混勻后接種細(xì)胞，結(jié)果顯示瑞德西韋對(duì)PEDV 的復(fù)制有抑制作用，導(dǎo)致PEDV N 基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)量均降低，能阻止完整病毒粒子的包裝，使細(xì)胞不再產(chǎn)生新的活病毒。且抑制作用隨著瑞德西韋濃度的增高而增強(qiáng)。當(dāng)瑞德西韋的濃度為16 μmol/L 時(shí)，可以完全抑制PEDV的復(fù)制，此時(shí)上清中無成熟的病毒粒子，不具備再次感染細(xì)胞的能力，說明瑞德西韋能夠有效地抑制PEDV 的復(fù)制。通過GraphPad Prism 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪圖，計(jì)算出瑞德西韋的EC50為11.97 μmol/L。選取11.97 μmol/L的瑞德西韋檢測(cè)其對(duì)PEDV復(fù)制的抑制效果，結(jié)果顯示PEDV 從12 h 開始大量復(fù)制，在12 h、20 h、24 h 分別收樣檢測(cè)，結(jié)果表明，瑞德西韋在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能抑制PEDV 的感染，說明瑞德西韋能夠持續(xù)抑制PEDV 的感染。選取16 μmol/L 的瑞德西韋檢測(cè)其抑制PEDV 的最佳給藥方式，結(jié)果顯示在接種PEDV 前及接種時(shí)給藥，之后洗去、僅在接種PEDV 時(shí)給藥，之后洗去的兩種給藥方式均不能抑制PEDV 的感染。A 組（接種PEDV 前給藥，且持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束）、C 組（接種PEDV 同時(shí)給藥，且持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束）、E 組（接種PEDV 后給藥，且持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束）的給藥方式能有效抑制PEDV 復(fù)制。結(jié)果表明，瑞德西韋作為接種病毒前的預(yù)防性給藥，未能見顯著的抗病毒效果；而作為接種病毒后的治療性給藥，則對(duì)病毒復(fù)制有明顯的抑制效果?？紤]到應(yīng)用于動(dòng)物臨床試驗(yàn)的指導(dǎo)價(jià)值，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，最佳的給藥方式為E 組（接種PEDV 后給藥，且持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束）。

綜上所述，本研究證明了瑞德西韋能在體外抑制PEDV 的復(fù)制，具有治療PEDV 感染的潛力，為臨床治療PEDV 感染提供參考，后續(xù)將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探究。