王 慧，崔瑩瑩，唐祎依，呂明月，黨光輝，崔子寅，曹 俊，宋寧寧，劉思國*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/動物細菌病創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069；2. 濰坊醫(yī)學院生命科學與技術學院，山東 濰坊 261053）

結核?。═uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種嚴重危害人類健康的重要傳染病，根據(jù)2020 年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計結果顯示，2019 年全球新發(fā)TB 患者約1 000萬人，其中我國新發(fā)TB 患者排名全球第二位[1]，而與艾滋病的雙重感染及耐藥結核菌的出現(xiàn)也是造成人類TB 死亡的重要原因。MTB 能夠在宿主體內(nèi)進入休眠狀態(tài)，并通過轉錄調控蛋白實現(xiàn)對活性氧（ROS）、金屬離子以及藥物殺滅等不利因素的適應，從而維持自身穩(wěn)定和生存，因此MTB 的轉錄調控蛋白具有成為藥物靶標的潛在可能。

Rv0827c（KmtR）屬于ArsR/SmtB 家族轉錄因子中的一員，具有保守的DNA 識別基序，即螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix）結構，通常形成同源二聚體結合到自身基因啟動子區(qū)域[2]。在缺乏金屬離子的情況下，ArsR/SmtB 家族轉錄抑制因子與編碼蛋白質基因的啟動子結合，而這些蛋白質參與過量金屬離子的流出或者螯合反應[3]。如果環(huán)境中重金屬離子達到有毒濃度閾值時則能夠釋放操縱子，使生物體能夠在有毒環(huán)境中生存。然而，目前受調控蛋白Rv0827c調控的靶基因及其影響調控作用的輔助因子尚不清楚。Rv3616c（EspA）是ESX-1 分泌系統(tǒng)成員之一，EspA 的缺失導致細菌細胞壁的完整性受到破壞[4]，進而影響MTB 的毒力[5]。但是，EspA 的表達受到哪些轉錄調控蛋白的調控尚不清楚。

Rv0827c 轉錄調控蛋白是否能夠與預測的23 種啟動子結合，以及rv3616c是否為轉錄調控蛋白Rv0827c 新的調控靶點？金屬離子等小分子是否會影響Rv0827c與rv3616c的結合？本研究對這幾個問題深入研究，為了解Rv0827c的轉錄調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體、實驗動物及主要試劑MTB H37Ra 株基因組和pET-22b 載體由本實驗室保存；E. coliDH5α 和E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊（Vazyme）生物科技有限公司；新西蘭大白兔購自坤達養(yǎng)殖場；7H9 和LB 液體培養(yǎng)基/固體培養(yǎng)基均購自美國BD 公司；PrimeSTAR Premix 購自大連TaKaRa 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自OMEGA 公司；親和層析樹脂購自美國GE 公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒、Protein A/G Magnetic Beads、M-280 山羊抗兔IgG 免疫磁珠以及EMSA（Electrophoretic Mobility-Shift Assay）試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；i-Pure DNA 提取試劑盒購自Diagenode 公司；SA 芯片以及10×HBS-EP 緩沖液購自美國思拓凡公司；放線菌素-D 購自Alphabio 公司；弗氏不完全佐劑和甲基綠均購自Sigma-ALDRICH 公司；小鼠抗His 單克隆抗體（MAb）購自天根生化科技（北京）有限公司；山羊抗鼠IDDye 熒光素IgG 購自LI-COR 公司。

1.2 重組Rv0827c 蛋白（rRv0827c）的表達與純化參照GenBank 中MTB H37Ra 標準株中23 種基因序列，以其上游350 bp 左右作為啟動子片段，利用Primer 6.0 軟件設計引物（表1），引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。以MTB H37Ra 基因組為模板，采用特異性引物（表1）通過PCR 擴增rv0827c基因，經(jīng)BamH I與NdeI雙酶切后克隆至pET-22b載體，構建重組質粒pET-22b-rv0827c并經(jīng)酶切與測序鑒定。重組質粒轉化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞后在37 ℃180 r/min 條件下培養(yǎng)至OD600nm=0.8，加入終濃度1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導表達4 h，8 000 r/min 離心收集菌體。超聲破碎后離心，收集沉淀，經(jīng)0.5%SKL變性以及復性后，利用Ni-NTA 親和樹脂純化。重組蛋白經(jīng)200 mmol/L、500 mmol/L 咪唑洗脫液洗脫并濃縮除鹽，經(jīng)BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。以小鼠抗His MAb（1∶5 000）為一抗，山羊抗鼠IDDye 熒光素IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定正確后，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR引物序列Table 1 The primers sequence of PCR

1.3 rRv0827c 多克隆抗體的制備與純化 選取2 只體重約2.0 kg 的新西蘭大白兔，先取少量耳靜脈血作為陰性對照，隨后將純化的rRv0827c 與弗式不完全佐劑按照1∶1 的體積比乳化，將其背部多點皮下注射免疫兔子，400 μg/只，每隔12 d 免疫1 次，免疫3 次后經(jīng)頸動脈采血，分離血清并保存于-80 ℃。將獲得的免疫血清結合于protein G 親和層析柱介質，利用Elution buffer 依次洗脫，得到rRv0827c 多克隆抗體，采用ELISA 方法檢測多克隆抗體的效價[6]，以免疫前血清作為陰性對照，用于后續(xù)試驗。

1.4 rRv0827c 與啟動子DNA 體外結合的凝膠遷移（EMSA）試驗 根據(jù)細菌單雜交數(shù)據(jù)的預測，rRv0827c具有廣泛的調控作用，能夠與多個基因的啟動子結合。以MTB H37Ra 株基因組為模板，采用特異性引物（表1），通過PCR 分別擴增23 個基因的啟動子，按照EMSA 方法，配制20 μL EMSA 反應體系：2 μL 30 ng/μL 啟動子DNA；3 μL 10.04 μmol/L rRv0827c；4 μL 5×binding buffer，ddH2O 補足，以未加蛋白的體系作為對照，將rRv0827c 與上述23 個基因啟動子37 ℃孵育30 min，后經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分析，驗證體外條件下rRv0827c 與23 種啟動子的結合情況。

1.5 rRv0827c 與啟動子DNA 菌體內(nèi)結合的免疫共沉淀（ChIP）試驗 根據(jù)染色質ChIP 試驗方法，將200 mL MTB H37Ra 株菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm=0.8），加入終濃度1%的甲醛交聯(lián)10 min，隨后加入終濃度125 mmol/L甘氨酸終止交聯(lián)，3 500 r/min離心15 min 收集菌體沉淀，并用預冷的PBS 洗滌2 次，用3 mL 裂解液重懸沉淀后經(jīng)超聲破碎，13 000 r/min離心收集上清，轉移至新的EP 管中。取上清100 μL進行反交聯(lián)，通過酚氯仿法提取菌體中的基因組后，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確?；蚪M片段破碎后分布在100 bp～700 bp；取上述1.3 方法中制備的rRv0827c 多克隆抗體100 μL，4 ℃包被M-280 山羊抗兔IgG 免疫磁珠90 min，后取1.2 mL 超聲后上清與已包被磁珠于4 ℃過夜孵育，洗滌磁珠后，利用i-Pure DNA 提取試劑盒收集磁珠上多克隆抗體富集的rRv0827c-DNA 復合物，純化并分離出復合物中的DNA，通過乙醇沉淀得到DNA。將收集的DNA 100倍稀釋后作為模板，采用表1 中的引物對23 種啟動子進行PCR 擴增，驗證體內(nèi)條件下rRv0827c 與23 種啟動子的結合情況。

1.6 rRv0827c 與rv3616c啟 動 子DNA 特 異 性 結 合及大溝小溝結合試驗 以MTB H37Ra 基因組為模板，采用5′端Cy5 標記引物Rv3616c-F/R（表1），PCR 擴增得到Cy5 標記的rv3616c啟動子，分別將終濃度為40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L未標記Cy5的rv3616c啟動子加入到終濃度36.1 nmol/L Cy5 標記的rv3616c啟動子與rRv0827 蛋白的反應體系中，進行EMSA，使未標記的rv3616c競爭結合蛋白；甲基綠和放線菌素-D 已被報道能夠分別結合于DNA 的大溝以及小溝[7]，將rRv0827c 和Cy5 標記的rv3616c啟動子DNA 分 別 與0.05 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.25 mmol/L 的放線菌素-D，及分別與20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L 的甲基綠混合，進行EMSA，37 ℃孵育30 min，經(jīng)8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠在200 V 下電泳3 h，結束后用Typhoon 掃描儀對結果進行掃描分析，檢測rRv0827c 與rv3616c啟動子的特異性結合及結合區(qū)域。

1.7 金屬離子對rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA結合影響的檢測 利用EMSA 方法檢測10 種常見金屬離子（Cu2+、Mn2+、Co2+、Pb2+、Cr3+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Cd2+）對rRv0827c 與rv3616c啟動子結合的影響。如上述方法1.4 中的EMSA 方法所述，加入啟動子rv3616c及rRv0827c 后，分別加入終濃度為20 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 的10種金屬離子，37 ℃孵育30 min后經(jīng)凝膠成像分析金屬離子對rRv0827c與rv3616c啟動子結合的影響。

1.8 rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 結合的表面等離子共振（SPR）試驗 以MTB H37Ra 基因組為模板，用生物素化的Rv3616c 引物（表1）擴增rv3616c啟動子片段，使得rv3616c啟動子3′端帶有生物素標簽。采用SPR 試驗檢測rRv0827c 和rv3616c啟動子之間的相互作用，將生物素標記的rv3616c啟動子片段用HBS-EP 緩沖液稀釋至0.125 ng/μL，打開Biacore 8K Control Software 中的偶聯(lián)（Immobilization）程序，選擇芯片種類為SA 芯片，設置流速為10 μL/min，進樣時間為20 s，將生物素標記的rv3616c啟動子偶聯(lián)至SA 芯片表面，隨后使100 nmol/L～1 000 nmol/L 的rRv0827c流經(jīng)芯片表面，設置結合時間為300 s，解離時間為600 s，緩沖液為HBS-EP，通過Biacore Evaluation 軟件，進一步分析rRv0827c 和rv3616c啟動子的特異性結合。

1.9 啟動子DNA 保守核苷酸位點的確定 根據(jù)rRv0827c 與23 種啟動子DNA 的結合特性，將與rRv0827c 結合的啟動子DNA 序列利用MEME 軟件，分析保守的核苷酸位點并繪制Sequence logo 圖。

2 結 果

2.1 rRv0827c 的表達、純化及多克隆抗體的鑒定結果將經(jīng)酶切和測序鑒定構建正確的重組質粒pET-22b-rv0827c轉 化E. coliBL21（DE3）感 受 態(tài) 細胞，經(jīng)IPTG 誘導表達親和層析純化后，利用western blot 鑒定。結果顯示在18.7 ku 處有目的條帶，與預期蛋白大小相符（圖1），表明rRv0827c 正確表達。將純化的rRv0827c 3 次免疫新西蘭大白兔后，對獲得的血清進行親和純化，經(jīng)SDS-PAGE 檢測結果顯示，在50 ku 以及20 ku 處出現(xiàn)重鏈以及輕鏈目的條帶（圖2），表明獲得純化的rRv0827c 多克隆抗體。

圖1 rRv0827c的western blot鑒定結果Fig.1 Identification of the recombinant protein rRv0827c by western blot

圖2 抗rRv0827c多克隆抗體的SDS-PAGE鑒定結果Fig.2 Identification of anti-rRv0827c polyclonal antibody by SDS-PAGE

2.2 rRv0827c 與啟動子DNA 體外結合的EMSA 試驗結果利用EMSA 試驗在體外驗證rRv0827c 與預測的23 個基因或基因簇的啟動子結合情況，啟動子片段經(jīng)PCR 擴增并純化后與rRv0827c 37 ℃孵育30 min 后進行凝膠成像分析。結果顯示23 種啟動子均能夠與rRv0827c 形成復合物，與未加入蛋白的游離啟動子DNA 對照相比，加入蛋白后可以觀察到明顯的蛋白-DNA 滯后帶（圖3），表明rRv0827c 在體外條件下能夠與這23 種啟動子結合。

圖3 rRv0827c與23種啟動子在體外結合的EMSA檢測結果Fig.3 The EMSA results of rRv0827c binding to 23 promoters in vitro

2.3 rRv0827c 與啟動子DNA 菌體內(nèi)結合的ChIP 試驗結果利用ChIP 試驗檢測rRv0827c 在菌體內(nèi)與預測的23 種啟動子的結合情況，以多克隆抗體富集的rRv0827c-DNA 復合物作為模板，利用相應的引物（表1）通過PCR 分別擴增23 種啟動子片段，并設置MTB H37Ra 基因組DNA 及免疫前血清作為陽性及陰性對照。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示加入rRv0827c 多克隆抗體富集的DNA 及MTB H37Ra 基因組DNA 均能夠擴增出明暗一致的條帶，而免疫前血清對照組未出現(xiàn)明顯條帶（圖4），表明rRv0827c在體內(nèi)也能夠與這23 種啟動子結合。

圖4 rRv0827c與23種啟動子在菌體內(nèi)結合的ChIP檢測結果Fig.4 The ChIP results of rRv0827c binding to 23 promoters in vivo

2.4 rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 的特異性結合及大溝小溝結合試驗結果為探究rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 能否特異性結合，本研究將高濃度的rv3616c啟動子DNA 分別與低濃度Cy5 標記的rv3616c啟動子DNA 共同孵育，以競爭結合rRv0827c。結果顯示，隨著未標記啟動子DNA 的濃度逐漸升高，rRv0827c 與Cy5 標記的rv3616c啟動子DNA 的結合復合物減少，游離Cy5 標記的rv3616c啟動子DNA逐漸增多，表明rRv0827c 能夠特異性結合rv3616c啟動子DNA（圖5）。為進一步探究rRv0827c 是結合在rv3616c的大溝還是小溝，將不同濃度的甲基綠與放線菌素-D 加入反應體系后分析，結果顯示隨著甲基綠濃度的增加，rRv0827c 與Cy5 標記的rv3616c啟動子DNA 的復合物逐漸減少，出現(xiàn)了更多的游離DNA；相反，增加放線菌素-D的濃度對該蛋白-DNA復合物的形成并未產(chǎn)生明顯的影響（圖6），表明rRv0827c 結合在rv3616c啟動子DNA 的大溝。

圖5 體外EMSA驗證rRv0827c特異性結合p/o rv3616c DNA Fig.5 EMSA identification of specific binding of rRv0827c to p/o rv3616c

圖6 rRv0827c與p/o rv3616c DNA大溝的結合試驗Fig.6 rRv0827c binds to the major groove of p/o rv3616c

2.5 金屬離子對rRv0827c 與rv3616c啟動子結合影響的EMSA 結果本研究利用EMSA 從10 種常見金屬離子中篩選影響rRv0827c 與rv3616c啟動子DNA 結合的金屬離子。結果顯示，Mn2+、Co2+、Pb2+、Cr3+、Fe3+、Ni2+、Mg2+在200 μmol/L 濃度下能夠影響二者的結合。其中Co2+、Ni2+、Cr3+影響較為顯著，進一步驗證發(fā)現(xiàn)，隨著Co2+、Ni2+濃度由20 μmol/L 提高至200 μmol/L 時，能夠明顯抑制rRv0827c 與rv3616c啟動子復合物的形成，游離DNA 逐漸增加；相反，隨著Cr3+濃度的逐漸增加，該蛋白-DNA 復合物更加穩(wěn)定，游離DNA 濃度逐漸減少至無（圖7）。結果表明Co2+、Ni2+能夠抑制rRv0827c 與rv3616c啟動子的結合，而Cr3+則能夠促進rRv0827c與rv3616c啟動子的結合。

圖7 金屬離子對rRv0827c與p/o rv3616c DNA結合的影響Fig.7 The effect of metal ion on rRv0827c binding to p/o rv3616c

2.6 rRv0827c 和rv3616c啟動子DNA 結合的SPR試驗結果將rRv0827c 經(jīng)SPR 檢測，分析rRv0827c與rv3616c啟動子DNA 之間的相互作用。結果顯示，由上到下的曲線依次是濃度由高到低的rRv0827c 在rv3616c啟動子DNA 表面流過的響應值，隨著蛋白濃度由100 nmol/L 升高至1 000 nmol/L，響應值由0.23 RU 逐漸上升至3.58 RU（圖8），響應值的變化表明rRv0827c 能夠特異性結合rv3616c啟動子DNA。

圖8 rRv0827c與rv3616c啟動子DNA結合的SPR試驗結果Fig.8 SPR analysis of rRv0827c binding to rv3616c promoter

2.7 保守核苷酸位點的確定利用MEME 軟件分析23 種啟動子DNA 序列，繪制了Sequence logo，確定了長11 bp 的堿基序列，橫坐標代表核苷酸的位置，縱坐標代表該堿基在該位置的保守性。結果顯示，G4 和G10 非常保守，T2 和G7 相對保守（圖9），表明4G 和10G 為rv3616c啟 動 子DNA 與rRv0827c 互 作 的關鍵核苷酸位點。

圖9 保守核苷酸位點的確定Fig.9 Determination of conserved nucleotide sites

3 討 論

ArsR/SmtB 家族為目前研究的較為廣泛的金屬離子感應蛋白，盡管ArsR/SmtB 家族成員具有許多共同的特征，但該家族成員間卻表現(xiàn)出對不同金屬離子的適應性，如SmtB 蛋白介導的轉錄抑制作用能夠被Zn2+緩解[8]，CzrA 介導的抑制作用能夠被Co2+以及Zn2+緩解[9]。Rv0827c（KmtR）屬于ArsR/SmtB 家族轉錄因子中的一員。本研究首先通過EMSA 試驗與ChIP試驗證實發(fā)現(xiàn)Rv0827c 能夠與細菌單雜交預測的與氧化還原及金屬離子轉運等功能相關的23 種啟動子發(fā)生結合，表明Rv0827c 能夠參與菌體內(nèi)各種重要的生理過程，對維持菌體內(nèi)金屬離子環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著不可忽視的作用，具有極其廣泛的轉錄調控功能與潛在的研究價值。

MTB 作為胞內(nèi)寄生菌給人類的健康造成了嚴重的危害，但目前對MTB 的致病機制仍知之甚少。MTB 的ESX-1 分泌系統(tǒng)對其毒力以及與宿主之間的相互作用是必需的，同時ESX-1 對ESAT-6 以及CFP-10 的分泌同樣至關重要，ESAT-6 是一種主要的毒力因子[10]，與多種宿主病原體相互作用有關[11]，包括宿主細胞裂解[12]、T 細胞抑制[13]和巨噬細胞炎性體激活[14]。Rv3616c（EspA）作為ESX-1 分泌系統(tǒng)的新成員之一受到越來越多的關注，EspA 和ESAT-6 的分泌相互依賴，EspA 的缺失導致ESAT-6 分泌的降低甚至喪失[15]。EspA 中二硫鍵形成的破壞雖然保留了ESX-1 的功能，但產(chǎn)生了大量的弱毒株，表明EspA 本身是一種主要的毒力因子[16]。細菌單雜交預測EspA 為Rv0827c 的潛在靶點，通過EMSA 試驗、ChIP試驗以及SPR 試驗證實Rv0827c 能夠特異性地結合rv3616c啟動子，這表明Rv0827c 能夠直接調控rv3616c的表達，影響MTB 的毒力。

金屬離子是生物體生存所必需的，過高濃度的金屬離子會產(chǎn)生毒性，在本研究中，Ni2+、Co2+能夠抑制Rv0827c 與rv3616c啟動子DNA 的結合，Cr3+則促進二者的結合，表明Rv0827c 蛋白表現(xiàn)出不同的金屬離子適應性，但這種差異產(chǎn)生的原因尚不清楚，原因之一可能是不同的金屬離子與蛋白結合后會帶來Rv0827c 蛋白構象的變化進而導致結合能力發(fā)生改變。通過分析23 個基因的啟動子序列結果顯示G4 以及G10 在大多數(shù)的DNA 序列中均非常保守，Rv0827c蛋白與啟動子的結合很大程度上依賴這兩個核苷酸位點發(fā)生相互作用。

本研究首次解析了MTB ArsR/SmtB 轉錄抑制因子家族中Rv0827c 潛在的23 個調控靶點，并對Rv0827c與毒力因子rv3616c調控靶點的相互作用進行了更進一步的研究，Rv0827c 能夠直接結合rv3616c啟動子DNA，推測其可能參與EspA 轉錄的調控甚至影響ESX-1 分泌系統(tǒng)的功能，表明Rv0827c 不僅在金屬離子轉運方面具有一定的調控作用，對MTB 毒力也有著重要的影響。綜上，本研究為深入解析Rv0827c的調控功能及完善Rv0827c 的調控網(wǎng)絡研究奠定了實驗基礎，也為開發(fā)新的抗MTB 藥物提供了參考。