李宛生，李敏華，張洪亮，李 超，許 滸，付 軍，龔幫俊，郭鎮(zhèn)洋，劉建波，彭金美，周國輝，王 倩*，田志軍*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.北京愛德士元亨生物科技有限公司，北京 101318）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸系統(tǒng)障礙為主要特征的高度接觸性傳染病[1]。國際病毒分類委員會（ICTV）最新分類已將PRRSV 的兩個基因型分別劃分到動脈炎病毒屬的兩個亞屬之中，歐洲型（PRRSV-1）和北美型（PRRSV-2）的種名分別重新命名為Betaarterivirus suid 1和Betaarterivirus suid 2[2]，這意味著對這兩類不同病原的檢測、監(jiān)測和疫病的防控要區(qū)分開來。有研究報道中國流行的PRRSV 遺傳和變異多樣性持續(xù)增加[3-4]，結合我國主要以公司加農(nóng)戶的養(yǎng)殖模式，開發(fā)一種快速、特異、簡便、適合現(xiàn)地初篩的檢測方法，對監(jiān)測我國PRRSV 的流行和疫病防控至關重要。

PRRSV 多為亞臨床感染，致其感染宿主的臨床特征不明顯，大多需通過實驗室檢測手段確診。目前，最常用的檢測方法是PCR，該方法針對病毒保守基因設計引物，準確性和敏感性較高，但也存在一些缺點，如PRRSV 較易變異需要及時更新引物，操作過程較為耗時，易發(fā)生氣溶膠污染，需要專業(yè)的設備和人員，檢測成本較高，限制了其在現(xiàn)地的推廣和應用[5]。免疫層析試紙條（Immunochromatographic strip，ICS）是一種以纖維素膜為載體的新型檢測技術，與PCR 方法相比，ICS 方法是以特異性的抗體作為免疫檢測“探針”，檢測的靶標是病毒蛋白，更方便、快速、特異、安全無污染，檢測結果更加可信，不需要專業(yè)的技術人員或昂貴的設備，更適用于現(xiàn)地檢測[6]。

目前，以膠體金為示蹤劑檢測PRRSV 或其抗體的ICS 已經(jīng)有相關報道[7-9]。雖然膠體金試紙條體系已較為成熟，但限于膠體金顆粒自身特性原因，其穩(wěn)定性及敏感性低于乳膠微球等新型示蹤劑[6]，且基于乳膠微球作為示蹤劑檢測PRRSV 抗原的ICS 方法尚未報道，因此本研究將PRRSV 單克隆抗體（MAb）與乳膠微球偶聯(lián)，將其作為結合墊上的檢測抗體，同時將該MAb 作為檢測線上的捕獲抗體，建立檢測PRRSV 的乳膠微球ICS 方法，為現(xiàn)地PRRSV 的流行病學調查及臨床檢測提供了新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 病毒及臨床樣品北美型PRRSV：高致病性PRRSV（HP-PRRSV）HuN4-F5 株[10]、NADC30-like SDHS 53 株、NADC34-like TZJ1341 株，歐洲型PRRSV DV疫苗株、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬細小病毒（PPV）、PRRSV N 蛋白MAb 1H4[11]、pCold-GST質粒和13 份不同PRRSV 感染的豬血清樣品均由本實驗室保存；108 份疑似PRRSV 感染的臨床豬血清及肺組織樣品于2020 年采自東北地區(qū)部分養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；Protein G 樹脂及層析柱購自金斯瑞生物科技有限公司；Lighting Cloning Kit 購自北京博奧龍免疫技術有限公司；GST Foocurose 4FF Kit 購自武漢匯研生物科技股份有限公司；直徑300 nm 的紅色乳膠微球、乙磺酸（MES）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）均購自Thermo 公司；硝酸纖維素膜（NC 膜）購自Millipore 公司；結合墊購自Pall 公司；吸水墊和聚氯乙烯（PVC）板條購自上海金標生物技術有限公司；羊抗鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DyLightTM800 羊抗鼠IgG購自KPL 公司；TIANamp Virus RNA Kit 購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PRRSV 重組N 蛋白（rN）的表達、純化及鑒定參考GenBank 中北美型PRRSV SDHS53 株（MH 651744.1）的N 基因，利用Oligo 6.0 軟件設計引物（SDHS53-F：CATATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATG CCAAATAACAACGGCAGACAGC/SDHS53-R：GAGAT TACCTATCTAGACTGCAGGTCGACTCATGCTGAGGGT GACGCTGTG）。利 用TIANamp Virus RNA Kit 提 取SDHS53 株基因組RNA，反轉錄為cDNA 后作為模板，采用上述引物擴增N 基因片段，利用Lighting Cloning Kit 利用同源重組法將該片段克隆至pCold-GST 載體中構建重組質粒pCold-GST-SDHS53-N，將重組質粒轉化E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，16 ℃低溫誘導表達，富集菌液超聲處理后，經(jīng)SDS-PAGE檢測rN 的表達。采用GST Foocurose 4FF 純化rN，經(jīng)SDS-PAGE 檢測純化效果，利用BCA 法測定其蛋白濃度，以純化的MAb 1H4（1∶1 000）為一抗，以Dy-LightTM800 羊抗鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定rN 與MAb 1H4 的反應性。純化的rN 用于后續(xù)ICS 的敏感性試驗。

1.4 ICS 各反應條件的優(yōu)化及建立

1.4.1 與紅色乳膠微球偶聯(lián)的最佳MAb 即檢測抗體濃度的優(yōu)化 乳膠微球的活化及其與不同濃度N 蛋白MAb 1H4（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL及3.0 mg/mL）的偶聯(lián)均參照盧福莊等[12]的方法，最終獲得不同濃度紅色乳膠微球MAb 1H4 的偶聯(lián)物。將不同濃度的偶聯(lián)物用XYZ3050 點噴系統(tǒng)以3 μL/cm 分別噴在結合墊上，作為檢測抗體，37 ℃干燥處理；將MAb 1H4 用PBS 稀釋至2.0 mg/mL，噴在NC 膜的檢測線（T 線）上作為檢測線捕獲抗體，將羊抗鼠IgG用PBS 稀釋至1.0 mg/mL 噴在NC 膜的質控線（C 線）作為質控線捕獲抗體，37 ℃干燥1 h，經(jīng)含3%的脫脂乳封閉1 h，PBST 洗滌3 次，室溫干燥后4 ℃保存?zhèn)溆?；最后將制備好? 部分：帶加樣孔的樣品墊、含有檢測抗體的結合墊、含有檢測線捕獲抗體及質控線捕獲抗體的NC 膜、末端的吸水墊，依次兩兩重疊組裝在PCV 板條上即為ICS，檢測PRRSV 細胞培養(yǎng)上清液和未接毒細胞對照上清液各5 份，觀察顯色情況，確定與乳膠微球偶聯(lián)的最優(yōu)MAb 即檢測抗體的濃度。

1.4.2 檢測線捕獲抗體濃度的優(yōu)化 檢測線捕獲抗體MAb 1H4 用PBS 稀 釋 成1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL 和3.0 mg/mL 5 種不同濃度，將質控線捕獲抗體羊抗鼠IgG 濃度統(tǒng)一為1.0 mg/mL，使用XYZ3050 點噴系統(tǒng)以1 μL/cm 的流速噴在NC 膜上，按照1.4.1 將最優(yōu)濃度的偶聯(lián)乳膠微球的MAb 噴在結合墊上，再按照1.4.1 所述方法組裝為ICS，檢測PRRSV 細胞培養(yǎng)上清液和未接種病毒的細胞上清液各5 份，觀察試紙條顯色情況，確定最優(yōu)的檢測線捕獲抗體的濃度。

1.4.3 質控線捕獲抗體羊抗鼠IgG 濃度的優(yōu)化 將質控線捕獲抗體即羊抗鼠IgG 分別稀釋成0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL 和2.0 mg/mL 4 種不同濃度，將檢測線捕獲抗體MAb 的濃度統(tǒng)一為2.0 mg/mL，使用XYZ3050 點噴系統(tǒng)以1 μL/cm 的流速噴在NC 膜上，將最優(yōu)濃度的檢測抗體噴在結合墊上，再按照1.4.1所述方法制備成ICS，檢測PRRSV 細胞培養(yǎng)上清液和未接種病毒的細胞上清液各5 份，觀察試紙條顯色情況，確定最優(yōu)的質控線捕獲抗體濃度。

1.4.4 ICS 的建立、組裝及結果的判定 將活化的紅色乳膠微球與最優(yōu)濃度的MAb 1H4 偶聯(lián)后噴在結合墊上做為檢測抗體，將最優(yōu)濃度的MAb 1H4 噴在NC 膜的檢測線上做為檢測線捕獲抗體，將最優(yōu)濃度的羊抗鼠IgG 噴在NC 膜的質控線上作為質控線捕獲抗體。然后按照1.4.1 將樣品墊、結合墊、NC 膜、末端的吸水墊依次組裝在PCV 板上，各組分相互重疊2 mm，連同保護外殼和干燥劑一起組裝在包裝盒中，即為檢測PRRSV 的ICS。使用時，將待檢樣品加入加入檢測孔中，靜止5 min～15 min 判定結果。

1.5 ICS 的特異性試驗利用制備的ICS 分別檢測HP-PRRSV HuN4-F5 株、NADC30-like SDHS53 株、NADC34-like TZJ1341 株、歐洲型PRRSV DV 疫苗株、CSFV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV 和PPV，根據(jù)結果判定ICS 的特異性。

1.6 ICS 的敏感性試驗將HP-PRRSV HuN4-F5（106.0TCID50/mL）和rN（24 000 ng/mL）分別用PBST和PBS 系 列 稀 釋（105.0TCID50/mL、104.0TCID50/mL、103.0TCID50/mL、2.5×103.0TCID50/mL、103.0TCID50/mL、5×102.0TCID50/mL、2.5×102.0TCID50/mL；24 000 ng/mL、2 400 ng/mL、 240 ng/mL、 120 ng/mL、 60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、7.5 ng/mL、3.75 ng/mL），分別以DMEM 和PBS作為陰性對照，每個稀釋度取100 μL用于ICS 檢測，以能觀察到條帶的最大稀釋濃度確定為該方法的敏感性。

1.7 ICS 的重復性試驗取3 份PRRSV 陽性組織樣品研磨液、2 份北美型PRRSV 和1 份Marc-145 細胞培養(yǎng)上清液，使用同一批次制備的ICS 進行批內重復試驗，每個樣品重復4 次，確定ICS 的批內重復性；選取不同批次制備的ICS 對上述樣品進行批間重復試驗，每個樣品重復4次，確定ICS的批間重復性。

1.8 動物實驗血清樣品及臨床樣品的檢測將13份不同PRRSV 感染實驗豬的血清樣品（分別為4 份HP-PRRSV HuN4 株、4 份NADC30-like SDHS53 株、5 份類高致病性PRRSV）及2020 年采自東北地區(qū)108份疑似PRRSV 感染的臨床血清樣品（18 份）及肺組織樣品（90 份）（參照1.5 處理該類樣品），參照張洪亮等建立的PCR 方法分別檢測[13]，同時采用本研究建立的ICS檢測，比較二者的檢測結果并計算符合率。

2 結 果

2.1 PRRSV rN 的表達及鑒定結果將重組質粒pCold-GST-SDHS53-N 轉化E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，IPTG 低溫誘導，利用SDS-PAGE 檢測。結果顯示，在超聲處理后的重組菌液上清中檢測到了40 ku左右的目的條帶，與預期相符。經(jīng)GST Foocurose 4FF 親和層析純化后，雖然存在少量雜蛋白，但rN的純化效果仍較好（圖1A）；Western blot 結果顯示，在40 ku 左右出現(xiàn)特異性條帶（圖1B）。BCA 測定結果顯示，rN 的濃度為240 μg/mL。上述結果表明，獲得了純化效果較好的PRRSV rN，且與MAb 1H4 的反應原性較好。

圖1 PRRSV rN表達的SDS-PAGE（A）及western blot（B）鑒定Fig.1 SDS-PAGE(A)and western blot(B)identification of PRRSV recombinant N protein

2.2 ICS 各反應條件的優(yōu)化結果各反應條件的優(yōu)化結果顯示，MAb 1H4 的濃度為1.5 mg/mL 時，與乳膠微球的偶聯(lián)效果較好，檢出率最高，抗體消耗最少，為最優(yōu)偶聯(lián)乳膠微球MAb 即檢測抗體的最優(yōu)濃度；檢測線捕獲抗體MAb 1H4 的濃度為2.0 mg/mL時，質控線捕獲抗體羊抗鼠IgG 的濃度為1.0 mg/mL時，檢出率最高，檢測線顯色最強，抗體消耗最少，分別為最優(yōu)的檢測線捕獲抗體和質控線捕獲抗體的工作濃度。

2.3 ICS 的組裝及結果的制定將樣品墊、結合墊、NC膜、吸水墊依次組裝在PCV板上，并與保護外殼和干燥劑一起組裝在包裝盒中即為ICS（圖2B）。使用時，將待檢樣品加入檢測孔中（圖2A），靜止5 min～15 min，結果判定如圖2C 所示。

圖2 ICS的組裝（A、B）及結果的判定（C）Fig.2 Composition(A,B)and result judgment criteria(C)of ICS

2.4 特異性試驗結果利用制備的ICS 檢測不同類型的PRRSV 和其他主要豬病病毒，結果顯示，該ICS 與北美型PRRSV 中的HP-PRRSV HuN4-F5 株、NADC30-like SDHS53 株和NADC34-like TZJ1341 株均呈陽性反應，在相應檢測線出現(xiàn)條帶（圖3A），與歐洲型PRRSV DV 疫苗株及豬的其他常見病毒均呈陰性結果（圖3B），表明本研究制備的ICS 對北美型PRRSV 的檢測具有廣譜性，且特異性較強。

圖3 ICS的特異性試驗結果Fig.3 Specific test result of the strip

2.5敏感性試驗結果將106.0TCID50/mL 的HPPRRSV HuN4-F5 株及rN 均做系列稀釋后分別利用該ICS 檢 測。結 果 顯 示，ICS 對HP-PRRSV HuN4-F5 株的最低檢測限為5×102.0TCID50/mL（圖4A），對rN 的最低檢測限為15 ng/mL（圖4B），表明本研究制備的ICS敏感性較高。

圖4 ICS對HP-PRRSV HuN4-F5株（A）及rN（B）的敏感性試驗結果Fig.4 Sensitivity test results of ICS detection for high pathogenic PRRSV HuN4-F5 strains(A)and recombinant N protein(B)

2.6 重復性試驗結果利用本研究建立的ICS 分別對3 份PRRSV 陽性組織樣品研磨液、2 份PRRSV 和1份Marc-145 細胞培養(yǎng)上清分別進行批內和批間的重復性檢測，結果顯示，批內檢測結果均一致，批間的檢測結果也均一致（圖略），表明本研究制備的ICS重復性較好。

2.7 ICS 的初步應用

2.7.1 豬血清樣品的檢測結果 分別采用本研究制備的ICS 和本研究室建立的PCR 方法[13]檢測本實驗室保存的13 份不同PRRSV 感染豬第21 d 的血清樣品。結果顯示，4 份HP-PRRSV HuN4 株感染的豬血清樣品經(jīng)ICS（圖5A）和PCR 檢測結果均為陽性，二者的符合率達100%；4 份NADC30-like SDHS53 株感染的豬血清樣品，ICS（圖5B）和PCR 檢測結果均為陽性的2 份，ICS 檢測為陰性、PCR 檢測為陽性的2 份，二者的符合率為50%；5 份類HP-PRRSV 感染的豬血清樣品，ICS（圖5C）和PCR 檢測結果均為陽性的3份，均為陰性的1 份，PCR 檢測為陰性、ICS 檢測為陽性1 份，二者符合率為80%。表明，本研究建立的ICS可以用于我國當前主要流行PRRSV感染豬血清的檢測。

圖5 不同北美型PRRSV感染豬血清樣品的檢測結果Fig.5 Detection results of swine serum samples infected by different North American-type PRRSV strains

2.7.2 臨床樣品的檢測結果 采用該ICS 和本研究室建立的PCR[13]方法同時檢測108 份臨床豬血清樣品（18份）和豬肺組織樣品（90份）。ICS 結果顯示，40份樣品為陽性，68 份樣品為陰性，陽性率為37.03%；PCR 結果顯示，46 份樣品為陽性，62 份樣品為陰性，陽性率為42.59%，經(jīng)統(tǒng)計學分析，ICS 與PCR方法的總符合率為83.33%（表1）。表明本研究建立的ICS 方法可以用于檢測臨床樣品。

表1 ICS與PCR對臨床樣品檢測結果的比較Table 1 Comparison of the results of clinical samples detection by ICS and PCR

3 討 論

PRRS 是最重要的動物傳染病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，快速、敏感、準確的診斷可以極大防制PRRSV 在豬群內的傳播。常規(guī)PCR方法漏檢和誤檢時常發(fā)生，且檢測周期長，專業(yè)性強，總體檢測成本較高，而ICS 體系已比較成熟，基于不同標記示蹤劑的ICS 已廣泛應用于生物醫(yī)學或食品安全檢測以及各種動物疫病的監(jiān)測[6]。

基于不同的標記示蹤劑和PRRSV蛋白，國內外學者已經(jīng)建立了多種檢測PRRSV 或其抗體的ICS[7-9]，以針對核衣殼蛋白（N 蛋白）和膜蛋白（M 蛋白、GP5）等結構蛋白建立的方法居多，特別是ORF7 編碼的N 蛋白高度保守，在相同基因型PRRSV 內的同源性較高，可達94%～100%，其含量高達PRRSV 蛋白總量的20%～40%，且免疫原性較強，是目前PRRSV 檢測和免疫監(jiān)測方法的主要靶結構蛋白之一[14]。李雪松等均以膠體金標記的PRRSV N 蛋白MAb 作為檢測探針[15-17]，將另一株識別PRRSV N 蛋白不同表位的MAb和羊抗鼠IgG 抗體分別作為檢測線和質控線建立的ICS，對PRRSV 的最低檢測限均可達103.0TCID50/mL 左右，與RT-PCR 方法的符合率也在91%～95%，一致性較高，適合于現(xiàn)地篩查的推廣應用。

隨著我國PRRSV 流行態(tài)勢的日益復雜多變，以NADC30-like 株和高致病性株為主要流行株，多種譜系病毒共存的局面已經(jīng)形成，上述以膠體金為示蹤劑的ICS 方法建立時間過久，均只適用于檢測中國當時分離的流行株（經(jīng)典株/高致病性株），且缺乏對目前我國當前主要流行株NADC30-like 和潛在流行株NADC34-like 以及其他譜系PRRSV 的檢測效果評估。因此，本研究基于一株北美型PRRSV N 蛋白的廣譜性MAb 1H4，將乳膠微球偶聯(lián)的MAb 1H4 噴在結合墊上作為檢測抗體，將MAb 1H4 噴在檢測線上作為檢測線捕獲抗體，山羊抗鼠IgG 噴在質控線作為質控線捕獲抗體，建立了一種敏感性高、特異性強、檢測廣譜且快速的ICS 方法。膠體金技術已較為成熟，但為了提高其檢測的敏感性，本研究選用乳膠微球作為標記探針主要基于以下考慮：一方面，乳膠微球與MAb 通過共價偶聯(lián)作用結合，比膠體金的靜電吸附作用更穩(wěn)定；另一方面，乳膠微球的粒徑范圍遠大于膠體金顆粒，比表面積較大，可以結合更多的抗體，這就是乳膠微球探針的敏感性高于膠體金顆粒的原因[6]。結果顯示，本研究制備的ICS 的敏感性高于國內已建立的ICS 方法[15-17]，對PRRSV 的最低檢測限為5×102.0TCID50/mL，對N 蛋白的最低檢測限為15 ng/mL；為了提高該ICS 方法的特異性，本研究利用針對PRRSV 免疫原性最強的N 蛋白MAb 1H4 作為檢測抗體和檢測線捕獲抗體，早期報道表明，N 蛋白之間可以通過二硫鍵及非共價相互作用形成二聚體等高級結構，這也是本研究能夠通過一株N 蛋白MAb 捕獲并檢測到PRRSV N 蛋白的理論基礎[18]。該ICS 可檢測我國目前出現(xiàn)的高致病性株、NADC30-like 株、NADC34-like 株等北美型代表性PRRSV，與歐洲型PRRSV 代表株DV 和其他常見豬病毒均無交叉反應，這也與前期研究MAb 1H4 識別的抗原表位在北美型PRRSV 中高度保守[11]的結果相符合。該ICS 方法對108 份臨床樣品的檢測結果與PCR 方法的整體符合率為83.33%，符合率較高，但略低于國內已建立的PRRSV ICS 檢測方法[15-17]。推測原因：一方面可能是方法間的差異所導致，兩種方法檢測的靶標不一樣，PCR 側重于檢測病毒的核酸，ICS 側重于檢測病毒的蛋白，病毒核酸和病毒蛋白的含量并不相同，造成二者的檢測結果有差異；另一方面可能是不同病毒株間差異所導致，本研究所檢樣品測序結果顯示，NADC30-like 株感染的樣品占比較高，而已有研究[15-17]所檢測的樣品主要是HPPRRSV 株流行時期的樣品，而近年來NADC30-lik 株已取代HP-PRRSV 成為當前主要的流行株[19]，其致病力低于HP-PRRSV，且多數(shù)病毒株為中等致病力，其感染后的組織及血清中的病毒載量相對低于HP-PRRSV，這也可能是本研究方法與PCR符合率相對較低的原因；進一步利用該ICS 檢測了不同類型PRRSV感染實驗豬的血清，結果顯示，HP-PRRSV 株感染21 d的豬血清PRRSV 的檢出率高于NADC30-like株和類高致病PRRSV株，這與本研究室之前的推測一致。后續(xù)將進一步通過動物實驗，比較不同類型PRRSV 株感染后豬血清中PRRSV 抗原含量的差異，為該方法提供更多的臨床數(shù)據(jù)支持，但總體而言該ICS 可用于我國PRRSV 主要流行株的血清學檢測，雖然該ICS 的敏感性低于RT-PCR，但該方法耗時更少，也無需專門的設備或專業(yè)人員，更適用于現(xiàn)地PRRSV 的大規(guī)模篩查。

綜上所述，本研究首次建立了一種基于乳膠微球為示蹤劑，以一株PRRSV N 蛋白MAb 同時作為檢測抗體和檢測線捕獲抗體的ICS 方法，該方法簡便快捷、成本低廉，具有良好的敏感性、特異性、重復性和檢測的廣譜性，具有較大的應用潛力，非常適合于現(xiàn)地PRRSV 的篩查。