黃梅秀 謝芳 林艷華 陳嵐嵐 李微微

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院婦科，福建 福安 355000）

近半個(gè)世紀(jì)以來，宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于宮頸癌篩查，其中意義不明的非典型磷狀細(xì)胞（ASCUS）在細(xì)胞學(xué)異常中占50%以上，大部分的ASCUS和低級(jí)別病變可自發(fā)性消退[1]。細(xì)胞學(xué)ASC-US中最終被診斷高級(jí)別病變?yōu)?.10%～9.00%。目前，已經(jīng)確定了100多種人類乳頭瘤病毒，包括13種高危類型，它們會(huì)導(dǎo)致宮頸癌和其他肛門生殖器和口咽癌，人類乳頭瘤病毒16型和18型約占所有宮頸癌的70%[2]。因此HPV檢測(cè)成為管理女性ASCUS的主要方法，這種方法被ASCCP指南推薦。據(jù)報(bào)道，在出現(xiàn)ASCUS的女性中有15%～20%在隨后的組織學(xué)診斷中被確定為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）2級(jí)及以上（CIN2+）[3]。5年隨訪結(jié)果也表明，出現(xiàn)ASCUS的女性患宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變3級(jí)及以上（CIN3+）的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于一般人群。然而，若將ASCUS的女性全部轉(zhuǎn)診陰道鏡，則存在過度診斷的問題。ASCCP建議對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS的患者進(jìn)行HPV檢測(cè)。目前的管理指南不推薦患有ASCUS的女性進(jìn)行HPV基因分型。本研究中，我們以宮頸癌篩查人群為研究對(duì)象，通過比較Aptima HPV（AHPV）和Aptima HPV16/18/45 Genotype（AHPV-GT）檢測(cè)對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS患者的分流效果，探討二者用于 ASCUS人群分流的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 參與人群 本數(shù)據(jù)為回顧性分析本院2019年6月至2021年6月期間細(xì)胞學(xué)檢測(cè)為ASCUS的女性，符合條件的女性為21歲或以上，并有ASCUS細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果。如果孕婦、曾報(bào)告曾接種過HPV疫苗、有宮頸疾?。ò┌Y或癌前病變）史或在過去12個(gè)月細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常（ASCUS，低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變，或更糟），或有可能干擾研究或?qū)⑴c者造成不可接受風(fēng)險(xiǎn)的病史者則排除在研究之外。本研究獲得福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，編號(hào)為[2020]寧閩醫(yī)倫理審字第（0820-02號(hào)）。參加宮頸癌篩查者中細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS共397例，其中有完整陰道鏡召回信息及AHPV檢測(cè)結(jié)果陽性的女性作為研究對(duì)象，共239例。

1.2 材料與方法 回顧性分析2019年6月至2021年6月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院婦科門診就診，細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS的有性生活史女性。均自愿接受HPV Aptima HPV檢測(cè)及（Aptima HPV-GT）。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)標(biāo)本采集 醫(yī)師用采樣刷收集1份宮頸細(xì)胞標(biāo)本，進(jìn)行TCT+AHPV及AHPV-GT檢測(cè)。具體如下：取宮頸刷于宮頸管內(nèi)順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)3圈，置入專用細(xì)胞保存液內(nèi)，送病理科進(jìn)行AHPV及AHPV-GT和TCT檢測(cè)。由工作人員給每個(gè)標(biāo)本編號(hào)、送檢。

1.3.2 試驗(yàn)檢測(cè)

1.3.2.1 液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 將保存液中的部分標(biāo)本經(jīng)ThinPrep 2000系統(tǒng)程序化處理后，制成直徑為2 cm的薄層細(xì)胞涂片，95%酒精固定，巴氏染色。采用TBS分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷，診斷結(jié)果包括無上皮內(nèi)病變或惡性病變（NILM）、ASCUS、非典型鱗狀細(xì)胞、不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變、不典型腺細(xì)胞、低度鱗狀上皮內(nèi)病變、高度鱗狀上皮內(nèi)病變、鱗癌、原位腺癌和腺癌。液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果為NILM時(shí)定義為正常。

1.3.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 采用Gen-Probe Technologyand PANTHER System進(jìn)行檢測(cè)。該系統(tǒng)主要基于多重核酸擴(kuò)增體系，可檢測(cè)包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68型在內(nèi)的共14種高危型。主要包括mRNA的提取、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。提取出的mRNA通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)（TMA）法進(jìn)行擴(kuò)增，TMA法是利用小鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶和T7核糖核酸聚合酶而進(jìn)行的以反轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增方法。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶可催化含有T7核糖核酸聚合酶啟動(dòng)子序列的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)而在T7核糖核酸聚合酶作用下，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)一步合成DNA完成mRNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過人類血小板抗原法進(jìn)行檢測(cè)，該方法利用熒光探針特異性與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，選擇劑淬滅未雜交探針上的熒光以區(qū)分雜交和未雜交探針，光度計(jì)測(cè)量雜交混合物上的熒光光量子，通過分析物的信號(hào)與截點(diǎn)比值來進(jìn)行結(jié)果判定。

1.3.2.3 Aptima HPV-GT檢測(cè) 對(duì)Aptima HPV檢測(cè)陽性的標(biāo)本，進(jìn)一步采用Aptima HPV-GT檢測(cè)試劑盒對(duì)HPV 16型和HPV 18/45型進(jìn)行分型檢測(cè)，具體步驟按照其說明書進(jìn)行操作，由儀器自動(dòng)檢測(cè)4 h后查看檢測(cè)結(jié)果。Aptima HPV檢測(cè)陰性的標(biāo)本視為Aptima HPV-GT檢測(cè)陰性。

1.3.2.4 陰道鏡檢查及活檢 宮頸充分顯露后，使用4%醋酸溶液涂抹整個(gè)宮頸，全面觀察后用碘液涂抹，再經(jīng)充分觀察，對(duì)白色病變、點(diǎn)狀血管、碘不著色等可疑病變部位行多點(diǎn)取樣及宮頸搔刮術(shù)。采集的活檢組織使用甲醛固定處理，送至病理科進(jìn)行活檢：標(biāo)本經(jīng)脫水、組織包埋、切片、染色、封片后，由2位專業(yè)的病理診斷醫(yī)師進(jìn)行閱片診斷，診斷結(jié)果描述采用世界衛(wèi)生組織三級(jí)分類法，分為無病變或炎癥（NILM）；低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（LSIL）包含CIN1和（或）宮頸濕疣；高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變（HSIL）包含CIN2和（或）CIN3；癌（Ca）4組。

1.3.3 質(zhì)量控制 對(duì)工作人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，婦科檢查和陰道鏡檢查醫(yī)師均有豐富的臨床工作經(jīng)驗(yàn)。細(xì)胞學(xué)診斷和病理學(xué)診斷均由福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院具有多年工作經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師完成。在研究開始前，召開陰道鏡培訓(xùn)會(huì)和組織病理閱片會(huì)，統(tǒng)一病理判讀標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)比較Aptima HPV檢測(cè)和TCT檢查對(duì)組織學(xué)診斷≥HSIL的篩查價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染與年齡關(guān)系 本研究參與者的平均年齡（47.51±12.39）歲（26～84歲）。該人群HPV16陽性率為13.56%（32/236），HPV18/45陽性率8.47%（20/236），HPV16、18/45陽性率1.27%（3/236）。不同年齡段的HPV陽性率79.55%（20～30歲），56.70%（31～40歲），55.70%（41～50歲），53.97%（51～60歲），70.73%（≥61歲）（圖1）。HPV感染率呈雙峰型趨勢(shì)，30歲以下達(dá)高峰，61歲之后再次升高。不同年齡組的HPV感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.30，P＜0.0001）。

圖1 HrHPV陽性ASCUS病例流程圖

2.2 HPV檢測(cè)流程 本研究中TCT為ASCUS，AHPV陽性者共236例，其中失訪人員（未進(jìn)行陰道鏡檢查）為64例，占27.12%。進(jìn)行陰道鏡活檢患者為172例。在AHPV-GT陽性者中HSIL占36.17%（17/47），宮頸癌占4.26%（2/47）。而AHPV-GT陰性者中HSIL占19.20%（24/125），宮頸癌占2.40%（3/125），二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.906；P=0.0151）。AHPV-GT陽性患者中，HPV16、18/45均陽性患者3例，其中2例行陰道鏡活檢，病理結(jié)果皆為CIN2+，比例為1.16%（2/172）、100.00%，HPV16 陽性為6.40%（11/172），HPV 18/45陽性為3.49%（6/172）。見表1。

表1 ASCUS患者HPV感染與年齡的關(guān)系

表1 陰道鏡檢查ASCUS/HPV陽性女性細(xì)胞學(xué)結(jié)果

2.3 ASCUS/AHPV-GT陽性對(duì)比ASCUS/AHPV-GT陰性 病理結(jié)果為NILM（χ2=0.386，P=0.621）、CIN1（χ2=2.788，P=0.095）、CIN2（χ2=1.038，P=0.308）的發(fā)病率上無顯著差異。其中ASCUS/AHPV-GT陽性時(shí)CIN2+、CIN3+、宮頸癌發(fā)病率分別為40.5%、23.5%、4.3%，而ASCUS/AHPV-GT陰性患者該發(fā)病率相應(yīng)為21.6%、10.4%、2.4%。CIN2+（χ2=4.811，P=0.028）、CIN3+（χ2=6.179，P=0.013）發(fā)病率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

3.1 宮頸癌是一種眾所周知的、可預(yù)防的惡性腫瘤。ASCUS是一個(gè)模糊的術(shù)語，是一種排除性診斷，提示有疾病風(fēng)險(xiǎn)，而不是異常病變的明確診斷。對(duì)于有ASCUS的女性，如果診斷不明確或不及時(shí)，會(huì)延誤最佳治療；另外，過度的診治不僅會(huì)給婦女帶來身體和心理上的負(fù)擔(dān)，還會(huì)造成不良的妊娠結(jié)局[4]。對(duì)于ASCUS的細(xì)胞學(xué)處理的目的是發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)高級(jí)別病變甚至潛在宮頸癌的患者[5]。然而，對(duì)于這些情況，沒有一種全球可接受的戰(zhàn)略。對(duì)于ASCUS的處理包括重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查和（或）HPV檢測(cè)。ASCCP建議對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS的患者進(jìn)行HPV檢測(cè)，如果HPV檢測(cè)結(jié)果呈陽性，則建議進(jìn)行陰道鏡檢測(cè)[6]。如果HPV檢測(cè)結(jié)果為陰性，則建議在3年隨訪時(shí)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。如果無法進(jìn)行HPV檢測(cè)，則可在1年后再次進(jìn)行細(xì)胞學(xué)評(píng)估，如果重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查再次發(fā)現(xiàn)ASCUS，建議進(jìn)行陰道鏡檢查[7]。

3.2 在本研究中，如果ASCUS/HPV陽性，則對(duì)所有轉(zhuǎn)至本研究診所的患者進(jìn)行陰道鏡檢查。本研究表明，細(xì)胞學(xué)為ASCUS女性中，HPV感染率與年齡呈雙峰型趨勢(shì)，HPV感染高峰出現(xiàn)在30歲以下，隨年齡增長逐漸下降，到中年處于平臺(tái)期，61歲后開始逐漸升高。而從全球數(shù)據(jù)來看，HPV感染高峰出現(xiàn)在25歲以下，隨年齡增長逐漸下降，到中年處于平臺(tái)期，65歲后略有上升。我們數(shù)據(jù)與全球數(shù)據(jù)趨勢(shì)相似。我們發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)峰值模式可能部分歸因于HPV感染的自然史[8]。

3.3 目前的管理指南不推薦患有ASCUS的女性進(jìn)行HPV基因分型[9]。然而，由于HPV 16相關(guān)的宮頸疾病風(fēng)險(xiǎn)非常高，即使在陰道鏡檢查時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)病變，HPV 16陽性的女性在未來發(fā)展為宮頸疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高。本研究中ASCUS/HPV陽性患者中，HPV16陽性率為13.56%（32/236），且CIN2+檢出率39.29%（11/28）。HPV18/45陽性率8.47%（20/236），CIN2+檢出率35.29%（6/17）。HPV16、18/45陽性率1.27%（3/236），CIN2+檢出率100.00%（2/2），失訪1例，ASC-US/AHPV-GT陽性CIN2+及CIN3+檢出率明顯高于ASCUS/AHPV-GT陰性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2CIN2+=4.811，P=0.028；χ2CIN3+=6.179，P=0.013）。ASCUS患者進(jìn)行HPV16、18/45分型是有意義的。

3.4 在中國，近一半被診斷為侵入性宮頸癌的女性從未接受過篩查，另外一部分癌癥病例發(fā)生在過去5年未被追蹤的女性中[10]。本研究失訪率達(dá)27%，可能與該研究為福建一少數(shù)民族占多數(shù)的欠發(fā)達(dá)地區(qū)，民眾對(duì)相關(guān)知識(shí)的匱乏、經(jīng)濟(jì)文化水平等相關(guān)。對(duì)細(xì)胞學(xué)為ASCUS，HPV16、18/45均陽性患者可考慮進(jìn)行快速治療。對(duì)AHPV-GT積極治療，特別是欠發(fā)達(dá)的農(nóng)村地區(qū)，減少宮頸高級(jí)別以上病變的失訪[11]。隨著基因分型分析的出現(xiàn)，可以識(shí)別出更多的個(gè)體高危型HPV基因型，基于風(fēng)險(xiǎn)的管理指南可能會(huì)更新[12-15]。

3.5 作為一項(xiàng)回顧性觀察分析，我們對(duì)數(shù)據(jù)的解釋存在一定的局限性，如對(duì)實(shí)際有細(xì)胞學(xué)和hrHPV結(jié)果以及隨訪活檢結(jié)果的女性數(shù)據(jù)的選擇偏倚。因此，我們的研究更有可能反映現(xiàn)實(shí)世界的實(shí)踐。未來的研究將集中在使用更新的HPV檢測(cè)方法的相對(duì)優(yōu)勢(shì)上，這些方法可以提高宮頸高級(jí)別病變檢測(cè)的特異性，從而為女性提供最有效的宮頸癌篩查策略。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA可用于 ASCUS人群分流?；诒敬窝芯亢推渌麌鴥?nèi)外研究結(jié)果，建議采用HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)ASCUS人群分流同時(shí)進(jìn)行AHPV-GT檢測(cè)，如HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽性，患者可直接轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，且密切隨訪；若HPV16、18/45均陽性患者可考慮進(jìn)行快速治療，如HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陰性，臨床醫(yī)師觀察宮頸處無異常，可以按照篩查指南，再次納入常規(guī)的宮頸癌篩查人群進(jìn)行隨訪。