麗 麗，烏日漢，畢力格，孟香花，寶樂爾，陳玉花，韓曉靜，白梅榮

(內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院/蒙醫(yī)藥研發(fā)工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

梔子作為蒙藥的《三子》藥材之一，在蒙醫(yī)藥的應用廣泛。研究資料顯示，本品為茜草科植物梔子(Gardenia)的成熟干燥果實，具有苦、涼、鈍、糙等藥性，主治血熱、肝熱、面目發(fā)黃、血希日性眼病、腎熱、膀胱熱、口渴[1]?，F(xiàn)代研究資料表明[2-3]，梔子具有抗炎、抗氧化、治療糖尿病、降壓、調(diào)脂、保肝、神經(jīng)保護、保健、保護視力、降血糖、抗動脈粥樣硬化、抗菌、抗腫瘤、保肝利膽、抗抑郁等現(xiàn)代藥理作用。課題組前期研究[4]中發(fā)現(xiàn)梔子苷在腎臟有明顯的分布，推測梔子對腎臟疾病及代謝產(chǎn)物具有一定的影響。因此，本研究以梔子為研究藥物，以正常大鼠為研究對象，采用代謝組學分析方法，探討梔子臨床等效量(3.8571g/kg)連續(xù)21d給藥后對腎組織代謝產(chǎn)物的影響，以期為梔子對腎臟功能調(diào)節(jié)研究提供科學鋪墊。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

SD雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量為(200±20)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供[SCXK(遼)2015-0001]。

1.1.2 藥品與試劑

實驗藥品與試劑信息，見表1。

表1 實驗藥品與試劑信息

1.1.3 儀器

實驗儀器信息，見表2。

表2 實驗儀器信息

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及取材

取大鼠16只，按體重隨機分為正常組8只(K8組)和給藥組6只(K6組)。從實驗第一天開始，給藥組灌胃梔子生藥粉碎的5%CMCNa溶液(3.8571g/kg)，1次/d，連續(xù)21d。正常組灌胃等容量5%CMCNa溶液。末次給藥30min后麻醉，采集同一部位腎組織置-80℃凍存管儲存，備檢。

1.2.2 代謝物提取

稱取50mg腎臟樣品放置于PE管，再加入1 000μL甲醇，采用研磨器制備50%勻漿液，離心15min(4℃，12 000rpm)，分離勻漿液，取上清液進樣10μL，用液質(zhì)聯(lián)用儀(UPLC-MS)檢測。

1.2.3 UPLC-MS檢測

(1)色譜柱：Waters BEH HILIC 色譜柱(100×2.1mm，1.7μm)。流動相：A(0.1%甲酸水，乙酸銨)和B(乙腈)；柱溫：35℃；流速：0.3mL/min；進樣量：10μL。洗脫梯度如表3。

表3 梯度洗脫程序表

(2)質(zhì)譜參數(shù)條件：采用電噴霧電離(ESI)正離子和負離子模式進行檢測。ESI源條件如表4。二級質(zhì)譜采用 information dependent acquisition(IDA)獲得，high sensitivity模式，去簇電壓(DP)為±60V，碰撞能量為(35±15)eV。

表4 ESI源條件

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗、秩和χ2檢驗、單因素方差分析分別進行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCA 分析結(jié)果

PCA通過新變量對各組數(shù)據(jù)進行歸類，去除重復性差和異常樣本，可觀察樣品的聚集、離散程度。如圖1所示，K8組與K6組大鼠腎組織代謝物出現(xiàn)一部分分離，一部分重疊的現(xiàn)象，說明代謝物具有一定的差異。利用MetaboAnalyst軟件進行聚類分析，以熱圖的聚類結(jié)果分析組間差異，顏色深淺表示代謝物水平，紅色為升高、藍色為降低。如圖2所示，K8組與K6組的代謝物相對豐度呈明顯差異，表明梔子可使大鼠腎組織代謝物產(chǎn)生一定變化。

圖1 腎代謝物 PCA

圖2 腎代謝物熱圖

2.2 OPLS-DA結(jié)果

OPLS-DA作為一種有監(jiān)督的分析方法，能夠篩選出差異代謝物。如圖3所示，K8組大鼠腎組織代謝物與K6組完全分離，說明代謝物譜有顯著差異。通過參數(shù)檢驗進行OPLS-DA模型驗證，具有良好的準確率和預測率(參數(shù)R2Y和Q2均大于0.5)。

圖3 腎OPLS-DA的S-plot圖

2.3 腎臟差異代謝物的篩選

為尋找潛在差異代謝物，采用OPLS-DA中VIP≥1和P<0.05，且fold change>1.5(或<0.5)的標準篩選，通過MassBank、Respect、GNPS數(shù)據(jù)庫進行檢索分析。甜菜堿、煙酰胺明顯上升，氨基戊酸、天冬氨酸鹽明顯下降，見表5。

表5 腎臟差異代謝物鑒定

2.4 差異代謝物通路分析

采用MBRole 2.0分析軟件，對差異代謝物進行通路富集分析。如圖4所示，腎組織差異代謝物涉及通路分別為：嘧啶和嘌呤代謝、蛋白質(zhì)消化和吸收、氨基酸的生物合成和代謝、氨酰-tRNA的生物合成、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等代謝通路。

圖4 腎臟樣品代謝通路氣泡圖

3 討 論

梔子是蒙醫(yī)臨床常用于治療血熱引起的各種疾病的藥物,臨床傳統(tǒng)用法主要集中于肝膽熱，但未涉及腎熱[2]。梔子主要成分梔子苷大量分布于腎組織,推測梔子可能對腎臟功能及代謝產(chǎn)物有一定調(diào)節(jié)作用[5]。本實驗結(jié)果顯示，腎組織中甜菜堿含量明顯升高，原因可能是梔子對腎細胞有一定的毒性影響。通過實驗發(fā)現(xiàn)腎組織煙酰胺含量升高，這可能表明梔子對腎組織新陳代謝有一定的毒性影響。與黃敏研究[6]一致。

氨基酸是機體所必需的生物活性物質(zhì)，腎臟在氨基酸的合成、轉(zhuǎn)運、排泄及重吸收等各個環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要作用，腎臟功能異常則氨基酸代謝異常。因此，氨基酸代謝異?？勺鳛槟承┠I臟疾病的特征性改變,對腎病疾病的早期診斷具有重要意義。實驗研究結(jié)果表明，梔子可使腎組織中天冬氨酸鹽和氨基戊酸表達明顯下降。可見，梔子對腎細胞也可能有一定損傷。該實驗結(jié)果為梔子腎毒性的探索研究提供了線索。