張 諾，任志賢，徐 林，劉 旭，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

【研究意義】植物類(lèi)蛋白激酶家族（protein kinase-like，PKL）可分為真核生物蛋白激酶（eukaryotic protein kinase，ePK）和非典型蛋白激酶（atypical protein kinases，aPK）兩大類(lèi)[1]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆信號(hào)的感知、傳導(dǎo)及基因的表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。ABC1（activity of bc1 complex）家族是存在于原核和真核生物中的一類(lèi)非典型蛋白質(zhì)激酶家族[2]，最早從釀酒酵母中分離，其功能是抑制細(xì)胞色素b mRNA 翻譯的缺陷以及維持線粒體呼吸鏈中bc1復(fù)合體的活性[3]。隨后，在酵母、大腸桿菌等物種中發(fā)現(xiàn)ABC1 家族成員參與線粒體和原核生物蛋白調(diào)控泛醌的生物合成，參與呼吸作用電子傳遞和抗氧化脅迫[4-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前ABC1 基因已在擬南芥、水稻、玉米、小麥、煙草、百合、胡楊等植物中得到鑒定[7-13]。高清松等[8]在水稻中鑒定到15 個(gè)ABC1 蛋白，其中9 個(gè)水稻ABC1 蛋白被預(yù)測(cè)定位在葉綠體上，5個(gè)蛋白的編碼基因表達(dá)受黑暗處理的調(diào)控，表明該家族可能在葉綠體發(fā)育中起作用；在擬南芥中共鑒定到17 個(gè)ABC1 蛋白，8 個(gè)被預(yù)測(cè)定位于葉綠體[14]。Yang 等[15]發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtACDO1定位于葉綠體，并且AtACDO1基因在RNAi干擾的情況下，葉片中類(lèi)胡蘿卜素和葉綠素的含量降低，表明該基因?qū)θ~綠素的生物合成有重要作用。Jasinsiki 等[7]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)鎘和氧化脅迫應(yīng)答因子AtOSA1，王彩香等[10]克隆的小麥類(lèi)ABC1 基因TaABC1L，該基因能夠被滲透、高鹽、低溫脅迫以及ABA 處理誘導(dǎo)表達(dá)。劉繼凱等[11]克隆的煙草NtSIA1基因受到鹽脅迫和Cd2+的誘導(dǎo)。袁迎迎等[12]鑒定到的lilyABC1基因可能對(duì)岷江百合適應(yīng)高鹽、低溫和黑暗等非生物脅迫具有一定作用。Wang 等[16]在小麥中鑒定到一個(gè)ABC1 家族的基因TaAbc1，該基因受條銹病菌（Puccinia striiformisf.sp.tritici，Pst）誘導(dǎo)，沉默TaAbc1會(huì)降低小麥2 個(gè)抗性品種‘水源11’和‘CYR23’引發(fā)的超敏反應(yīng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】谷子是我國(guó)重要的雜糧作物，具有抗旱、耐貧瘠等特點(diǎn)，但谷子生產(chǎn)上受到眾多非生物脅迫及生物脅迫，影響到谷子光合作用及產(chǎn)量。任傳友等[17]研究表明，水分脅迫會(huì)導(dǎo)致谷子光合速率和產(chǎn)量下降，程富英等[18]表明，禾生指梗霉引發(fā)的谷子白發(fā)病或造成谷子葉片褪綠、畸形，嚴(yán)重影響谷子葉片的光合作用，造成谷子產(chǎn)量的損失。ABC1 基因家族可定位于線粒體和葉綠體，對(duì)葉綠體的發(fā)育有一定的功能?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)鑒定谷子ABC1 家族基因，探究不同成員的差異表達(dá)及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解析ABC1 家族基因在谷子葉綠體發(fā)育中所發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ABC1基因家族數(shù)據(jù)獲取及基因鑒定

xiaomi全基因組數(shù)據(jù)從Multi-omics Database forSetaria italica數(shù)據(jù)庫(kù)中（http://www.maizesequence.org/index.html）獲取。從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)及國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心（http://www.ricedata.cn/index.htm）中獲取11 條擬南芥ABC1 家族的蛋白序列及15 條水稻ABC1 家族的蛋白序列，基于Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）中ABC1 家族的HMMER 模型（PF04844），利用TBtools 中的Simple HMM Search工具，在谷子的全基因組蛋白序列中進(jìn)行篩選，E-value＜0.01。

1.2 谷子ABC1基因家族蛋白特征分析

分別利用ExPASY-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、PSORT Prediction（http://psort1.hgc.jp/form.html）在線工具分析谷子ABC1 家族蛋白的基本理化性質(zhì)以及亞細(xì)胞定位。利用TBtools 工具對(duì)谷子的基因組注釋gff3 文件進(jìn)行分析，并對(duì)基因定位的結(jié)果可視化。

1.3 谷子ABC1基因家族系統(tǒng)進(jìn)化及保守結(jié)構(gòu)域分析

使用MEGA7.0中的最大似然法（maximum likelihood estimate，MLE）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用MEME在線軟件（http://meme-suite.org/tools/meme）鑒定谷子ABC1 家族蛋白中的保守基序，并使用TBtools 工具對(duì)谷子ABC1家族基因的motif進(jìn)行可視化。

1.4 谷子ABC1基因家族的啟動(dòng)子分析

截取ABC1 家族基因起始密碼子上游2 000 bp 的基因序列作為啟動(dòng)子序列提交網(wǎng)站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.gent.e/eboolslantcare/html）預(yù)測(cè)順式作用元件，并在TBtools中進(jìn)行可視化。

1.5 谷子ABC1家族基因的組織特異性表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)分析

從Multi-omics database forSetaria italica數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得谷子種子、根、莖、穗、葉等不同組織的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)?；诟骰蛟谥参锝M織各器官的表達(dá)差異構(gòu)建表達(dá)熱圖，并利用可視化軟件TBtools 展示。谷子ABC1 基因響應(yīng)S.graminicola侵染的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室所測(cè)轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)，取材時(shí)期為：在倒二葉形成期至病葉內(nèi)卵孢子發(fā)育完成期，每隔3 d 取材1 次，共取材5 次，分為S1、S2、S3、S4、S5 5 個(gè)時(shí)期，材料編號(hào)為：處理組TG1、TG2、TG3、TG4、TG5；以同時(shí)期同部位健康葉片為對(duì)照，編號(hào)為CK1、CK2、CK3、CK4、CK5，3次重復(fù)。

1.6 qRT-PCR分析

使用Trizol 試劑（Sangon biotech）分別提取不同時(shí)期谷子葉片RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）合成cDNA。隨機(jī)篩選12 個(gè)ABC1 家族基因，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），采用qRT-PCR 法分析其表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系（15 μL）為：TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）mix 7.5 μL、上下游引物各0.6 μL、cDNA 40 ng、ddH2O 3.3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，用2-ΔΔCT法計(jì)算各個(gè)基因在不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量，以Actin為內(nèi)參，3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 定量引物信息Tab.1 Primer information for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子ABC1蛋白家族的篩選、理化性質(zhì)和基因定位

利用ABC1的HMM 模型在xiaomi基因組中共鑒定得到205個(gè)候選成員，通過(guò)Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)分析后，最終篩選得到谷子ABC1 家族基因共26 個(gè)，將其命名為SiABC1-1～SiABC1-26（表2），編碼282～942 個(gè)氨基酸，平均氨基酸數(shù)目為630 aa，蛋白分子量介于30.56～105.20 ku，等電點(diǎn)5.36～10.08。ABC1 蛋白家族在2、8 號(hào)染色體上的數(shù)目最多，均為6 個(gè)，6、7 號(hào)染色體分布最少，僅有1 個(gè)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SiABC1-5、SiABC1-11、SiABC1-12、SiABC1-19、SiABC1-20、SiABC1-22和SiABC1-257 個(gè)基因定位于葉綠體，SiABC1-6、SiABC1-10、SiABC1-14和SiABC1-184 個(gè)基因定位于線粒體，SiABC1-1、SiABC1-2、SiABC1-8定位于質(zhì)膜，SiABC1-3、SiABC1-4、SiABC1-13、SiABC1-26定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，SiABC1-7、SiABC1-9、SiABC1-21定位于過(guò)氧化物酶體，SiABC1-15、SiABC1-16、SiABC1-17定位于細(xì)胞核，SiABC1-23、SiABC1-24定位于細(xì)胞外。

表2 谷子ABC1家族基因的序列特征Tab.2 Sequence characteristics of the genes of ABC1 family in foxtail millet

2.2 谷子ABC1家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析及保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)擬南芥、水稻與谷子的52 個(gè)ABC1 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果顯示：ABC1 家族基因可被分為6 類(lèi)（圖1A）。在藍(lán)色、綠色、黃色分支中，僅包含谷子與水稻的ABC1同源基因，包括19個(gè)谷子ABC1家族基因和9個(gè)水稻ABC1家族基因，在橙色、紫色分支中，包括7個(gè)谷子ABC1家族基因，6個(gè)水稻ABC1家族基因以及2個(gè)擬南芥ABC1家族基因，粉色分支中僅包含9個(gè)擬南芥ABC1家族基因。推測(cè)ABC1家族基因在進(jìn)化過(guò)程中部分基因存在功能分化。在ABC1 氨基酸序列中共鑒定到8 個(gè)推定的基序（圖1B）。其中motif2 和motif3 在26 條ABC1 蛋白序列中均存在，且均按照motif3-motif2 的順序排列。Motif3 中較為保守的序列為PIAAASLGQVYRARLKDGGEV，Motif2中的保守序列為AYLRQLLEFHADPHPGNI（圖1C）。

圖1 谷子ABC1家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及motif 分析Fig.1 Phylogenetic tree and protein motif analysis of ABC1 family of foxtail millet

2.3 谷子ABC1家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

順式作用元件預(yù)測(cè)表明（圖2），ABC1家族基因啟動(dòng)子中與激素響應(yīng)和光響應(yīng)相關(guān)的元件較多，26個(gè)基因中均存在脫落酸作用響應(yīng)元件，含有響應(yīng)生長(zhǎng)素作用元件的基因有11個(gè)，含有響應(yīng)赤霉素作用元件的基因有17個(gè)，含有響應(yīng)茉莉酸作用元件的有21個(gè)，含有響應(yīng)水楊酸作用元件的基因有8個(gè)，表明ABC1家族在谷子中可能與激素調(diào)控代謝途徑相關(guān)。同時(shí)，谷子ABC1家族的26個(gè)基因均存在光響應(yīng)元件，說(shuō)明該基因家族可能在光合作用中也發(fā)揮重要作用。

圖2 谷子ABC1家族基因啟動(dòng)子順式作用元件功能Fig.2 Function of promoter cis-acting elements in ABC1 family genes in foxtail millet

2.4 谷子ABC1家族基因的組織特異性表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)

谷子ABC1 家族基因組織特異性表達(dá)結(jié)果表明（圖3A），SiABC1家族基因在種子與根中幾乎不表達(dá)，SiABC1-1、SiABC1-5、SiABC1-12在葉部高表達(dá)，其中SiABC1-12表達(dá)量最高，TPM 值可達(dá)84.34。在受到禾生指梗霉侵染的谷子葉片中，共檢測(cè)到18 個(gè)SiABC1基因被誘導(dǎo)表達(dá)，聚類(lèi)分析可分為classⅠ和classⅡ兩類(lèi)（圖3B）。其中classⅡ中的基因均在健康葉片中高表達(dá)，發(fā)病葉片中低表達(dá)，可能與禾生指梗霉侵染導(dǎo)致谷子葉片葉綠體合成及光合作用受阻有關(guān)，結(jié)合基因功能預(yù)測(cè)分析，在classⅡ中，SiABC1-1、SiABC1-2、SiABC1-3、SiABC1-5、SiABC1-6、SiABC1-12、SiABC1-14、SiABC1-15、SiABC1-17、SiABC1-26這10 個(gè)基因的功能全部預(yù)測(cè)到與葉綠體相關(guān)，同時(shí)，在classⅡ中，SiABC1-5、SiABC1-12這兩個(gè)基因定位于葉綠體，預(yù)測(cè)其功能發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均與葉綠素分解代謝過(guò)程相關(guān)，進(jìn)一步證明了SiABC1-5、SiABC1-12可能在谷子的光合作用中發(fā)揮重要作用。

圖3 谷子ABC1家族基因表達(dá)結(jié)果Fig.3 Gene expression results of ABC1 genes in different tissues of foxtail millet

2.6 qRT-PCR分析結(jié)果

RNA-seq 測(cè)定結(jié)果表明，所篩選12個(gè)ABC1家族基因在受侵染谷子葉片中均差異表達(dá)，為進(jìn)一步驗(yàn)證SiABC1 基因參與谷子抗逆脅迫響應(yīng)的表達(dá)差異，選擇SiABC1-1、SiABC1-2、SiABC1-3、SiABC1-5、SiABC1-6、SiABC1-10、SiABC1-12、SiABC1-14、SiABC1-15、SiABC1-17、SiABC1-23、SiABC1-26進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，其中SiABC1-1、SiABC1-2、SiABC1-3、SiABC1-6、SiABC1-10、SiABC1-12、SiABC1-14、SiABC1-17在受到禾生指梗霉侵染時(shí)5 個(gè)時(shí)期與健康葉片相比均下調(diào)表達(dá)，SiABC1-5、SiABC1-15在第4 時(shí)期上調(diào)表達(dá)，SiABC1-23在第2 時(shí)期上調(diào)表達(dá)，SiABC1-26在第1時(shí)期上調(diào)表達(dá)，被檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果具有相似的表達(dá)趨勢(shì)，且兩組數(shù)據(jù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.729 7（圖5），達(dá)到強(qiáng)相關(guān)。

圖4 基因表達(dá)水平及qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Gene expression levels and qRT-PCR validation results

圖5 RNA-Seq與qRT-PCR表達(dá)模式相關(guān)性點(diǎn)圖Fig.5 The correlation point map between RNA-Seq and qRT-PCR expression patterns

3 討論與結(jié)論

ABC1屬于非典型蛋白激酶，主要參與非生物脅迫的應(yīng)答，但在線粒體、葉綠體以及在不同的物種中執(zhí)行的功能存在著差異[7]。Lundquist 等[19]在擬南芥中鑒定到的17 個(gè)ABC1 基因有8 個(gè)定位于葉綠體，這些基因可能通過(guò)使葉綠體質(zhì)體小球上的其他蛋白磷酸化從而調(diào)節(jié)其活性。Yang等[20]將擬南芥在低光強(qiáng)下用20 μmol/L 甲基紫精處理2 h 后，發(fā)現(xiàn)定位于葉綠體的基因At4g31390（ABC1K1）顯著上調(diào)，通過(guò)構(gòu)建突變體發(fā)現(xiàn)該基因在介導(dǎo)葉綠素降解和光氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[15]。本研究利用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出26個(gè)ABC1家族成員，進(jìn)化分析結(jié)果顯示，SiABC1-5、SiABC1-12與水稻Os07g12530、Os11g11000同源性較高，高清松等[8]研究表明，Os07g12530、Os11g11000在葉片中特異性表達(dá)，并且亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)定位于葉綠體，與本研究結(jié)果相似，其中Os07g12530在黑暗處理時(shí)，表達(dá)量受到抑制。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)有7個(gè)基因定位于葉綠體，根據(jù)組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，定位于葉綠體SiABC1-5、SiABC1-12這2個(gè)基因在葉部高表達(dá)，并且結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，SiABC1-5、SiABC1-12在健康葉片中的表達(dá)量顯著高于病葉中表達(dá)量，推測(cè)這兩個(gè)基因可能參與葉綠素的合成及光合作用，下一步將繼續(xù)對(duì)這2個(gè)基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證和分析。同時(shí)，許多研究者發(fā)現(xiàn)，脫落酸作為一種逆境信號(hào)分子，ABC1基因家族廣泛地參與了對(duì)其的響應(yīng)，如擬南芥的ABC1 家族成員對(duì)脫落酸響應(yīng)；大多數(shù)水稻的ABC1 家族成員響應(yīng)脫落酸[12]；利用外源脫落酸處理后的小麥TaABC1上調(diào)表達(dá)[14]，說(shuō)明ABC1 家族的基因可能與ABA 信號(hào)通路有關(guān)，從而介導(dǎo)ABC1 對(duì)逆境響應(yīng)。同時(shí)根據(jù)谷子ABC1 家族基因的啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)到與光響應(yīng)和激素響應(yīng)相關(guān)的作用元件最多，表明該家族基因可能參與谷子生長(zhǎng)發(fā)育中的光合作用和抗逆反應(yīng)。

致謝：山西省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2021Y331）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！