何 昊，李丹丹，潘非凡，吳 澤，楊書運*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.農(nóng)業(yè)部合肥農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，安徽 合肥 230036）

【研究意義】土壤鹽漬化是限制作物生長及產(chǎn)量的重要逆境脅迫之一，全世界約20%的耕地和33%的灌溉農(nóng)田受到鹽脅迫的影響，預(yù)計到2050年，50%以上的耕地面積將出現(xiàn)鹽堿化[1-3]。中國鹽堿地面積約9 913 萬hm2，是土地鹽堿化最為嚴(yán)重的國家之一[4]。水稻是三大主要糧食作物之一，而水稻屬于中度鹽敏感作物，易受鹽脅迫造成作物減產(chǎn)及品質(zhì)下降，且苗期是最易受脅迫的時期之一[5-6]。在土壤鹽漬化風(fēng)險增加的大趨勢下，深入開展水稻耐鹽性的研究，充分保障鹽堿地水稻種植，對于保障糧食安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】種子引發(fā)（Seed priming）是一項廣泛應(yīng)用的播種前處理技術(shù)，通常做法是采用引發(fā)劑處理種子，控制種子緩慢吸收水分并停留在吸漲的第二階段，同時防止胚根伸出[7]。研究表明，引發(fā)可有效打破種子的休眠，促進(jìn)細(xì)胞膜的修復(fù)，增加種子活力，提高干旱、重金屬、高溫和鹽害等脅迫下的幼苗抗逆性[7-9]。引發(fā)技術(shù)在水稻上已有所應(yīng)用，孫園園等[10]研究表明，水分脅迫下，利用聚乙二醇（PEG）引發(fā)可提高水稻幼苗形態(tài)指標(biāo)及抗氧化酶活性，促進(jìn)相關(guān)糖代謝；Ali 等[11]利用硝酸鉀（2.5%和5%）及二氧化硅（2.5%和5%）溶液引發(fā)，顯著提高水稻種子萌發(fā)指標(biāo)、幼苗活力、可溶性蛋白以及蔗糖含量，增強(qiáng)水稻抗旱性。引發(fā)顯著提高水稻抗脅迫能力，機(jī)理為引發(fā)增加了逆境防御類、能量代謝類等蛋白合成含量和豐度，使種子獲得“逆境記憶（stressful memory）”進(jìn)而提高抗逆性[12]。利用抗壞血酸、氯化鈣及β-氨基丁酸作為引發(fā)劑可提高苗期水稻幼苗活性氧（ROS）的清除能力，保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)以提高種子的萌發(fā)率和幼苗活力，提高水稻的耐鹽性[13-14]。因此，選取適當(dāng)?shù)囊l(fā)劑對于提高水稻幼苗的耐鹽性有著廣泛的應(yīng)用前景?！颈狙芯壳腥朦c】殼聚糖（chitosan，CTS）是甲殼素脫乙?；蟮玫降囊环N聚氨基葡萄糖，作為具有潛力的非生物脅迫抗性誘導(dǎo)劑，在農(nóng)業(yè)方面廣泛應(yīng)用[15-16]。干旱脅迫下，利用CTS處理顯著提高了向日葵葉片葉綠素、可溶性蛋白和游離氨基酸含量，激發(fā)抗氧化防御系統(tǒng)[17]；水分脅迫下，葉面噴施CTS 可有效提高辣椒谷胱甘肽（GSH）及抗壞血酸（AsA）的含量，降低MDA 的含量，因此CTS 可通過調(diào)節(jié)能量合成來達(dá)到緩解逆境脅迫[18]；利用0.5 g/L 殼聚糖包衣能有效提高油菜種子及幼苗的耐鹽性[19]。且有研究得出，鹽脅迫下外源施加殼聚糖可提高玉米、小麥作物的抗氧化酶活性，激活其防御機(jī)制，更好地抵御鹽脅迫[20-21]。然而，利用CTS 引發(fā)對鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)及幼苗生長缺乏系統(tǒng)性的研究，有必要探索最適宜質(zhì)量濃度的CTS 來緩解鹽脅迫?！緮M解決的關(guān)鍵問題】，本研究以皖稻16 為材料，采用不同質(zhì)量濃度CTS溶液進(jìn)行引發(fā)，對其鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)及幼苗生長進(jìn)行分析，為應(yīng)對鹽脅迫制約水稻種植提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點以及供試材料

本試驗于2021年在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院土壤學(xué)實驗室進(jìn)行。供試水稻品種為皖稻16，該品種穗大且成穗率高，生育期約150 d。供試殼聚糖藥劑為生物技術(shù)級，利用2%的醋酸溶解，然后再分別稀釋成所需質(zhì)量濃度，調(diào)節(jié)各質(zhì)量濃度pH值至6.5左右。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 種子引發(fā)處理選取均勻飽滿的水稻種子，使用0.2%HgCl2消毒10 min，之后用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈。未經(jīng)引發(fā)且無鹽脅迫處理記為CK，未引發(fā)但有鹽脅迫處理記為S-CK；設(shè)置6個引發(fā)處理，即用純水及50，100，150，200，250 mg/L CTS溶液（分別以S-0，S-50、S-100、S-150、S-200、S-250表示）對水稻種子進(jìn)行引發(fā)，種子質(zhì)量（g）與溶液體積（mL）比約為1∶3，在25 ℃的發(fā)芽箱內(nèi)引發(fā)培養(yǎng)24 h，引發(fā)結(jié)束后將種子純水沖洗干凈，使用吸水紙吸干表面水分，置于28 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥至原含水量（約為13.3%）。

1.2.2 發(fā)芽試驗將各處理水稻種子置于平鋪有蛭石的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽皿中（規(guī)格為12 cm×12 cm×5 cm），分別加入80 mL 的100 mmol/L 的NaCl 溶液，保證蛭石被溶液淹沒；各處理重復(fù)3 次，每個重復(fù)播種30 粒種子，按5行6列均勻擺置。發(fā)芽皿放置在28 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待種子出土后，設(shè)定光照4 000 lx，每天光照時長12 h，晝夜溫度分別為28 ℃與20 ℃。

1.2.3 測定項目與方法（1）發(fā)芽指標(biāo)。播種后第1天開始，計算以下參數(shù)：發(fā)芽勢=（3天內(nèi)供試種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)）×100；發(fā)芽率=（7 天內(nèi)供試種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt（Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽的天數(shù)）。（2）幼苗形態(tài)指標(biāo)。播種后第12天，選取長勢一致的水稻幼苗，測量相關(guān)的水稻根苗形態(tài)指標(biāo)。將水稻分為地下部分與地上部分，利用天平測量鮮重；并且利用游標(biāo)卡尺測量水稻的根長、苗長與根直徑；利用描形數(shù)格法測定水稻單株葉面積。（3）丙二醛以及相關(guān)抗氧化酶活性含量。參照王學(xué)奎[22]的方法，采用硝基氮藍(lán)四唑（NBT）法測定幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；紫外分光光度計法測定過氧化氫酶（CAT）活性；硫代巴比妥酸（TBA）染色法測定丙二醛（MDA）含量。（4）可溶性糖含量、蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）活性的測定參照劉麗杰[23]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響

由圖1和表1可知，鹽脅迫明顯降低了水稻種子萌發(fā)速率，且均顯著降低種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)（P＜0.05），降幅依次分別為12.36%、52.18%和36.99%；利用純水引發(fā)可有效緩解鹽脅迫對水稻種子發(fā)芽的抑制，而加入各質(zhì)量濃度CTS溶液引發(fā)可進(jìn)一步緩解鹽脅迫，表現(xiàn)為隨CTS溶液質(zhì)量濃度的增加，各項發(fā)芽指標(biāo)呈先升高后下降的趨勢。與S-CK相比，各引發(fā)處理下水稻發(fā)芽指標(biāo)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。綜合來看，以S-100與S-150處理表現(xiàn)較優(yōu)，與S-CK相比，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別顯著提高12.10%、90.94%和33.57%（S-100）及10.48%、87.29%和37.01%（S-150），且2個處理間無顯著差異。

表1 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)指標(biāo)的影響Tab.1 Effects of CTS priming on rice seeds germination under salt stress

圖1 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻種子萌發(fā)率的影響Fig.1 The effects of CTS priming on the germination rate of rice seeds under salt stress

2.2 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻根苗生長的影響

由圖2可得，鹽脅迫顯著降低了水稻幼苗鮮重（35.33%）、苗長（22.14%）和單株葉面積（22.51%）。利用水和各質(zhì)量濃度CTS 溶液引發(fā)可有效緩解鹽脅迫對水稻幼苗的抑制作用，且整體表現(xiàn)為隨溶液質(zhì)量濃度的提高先升后降。各處理中以S-100處理緩解幼苗鹽脅迫最佳，與S-CK 相比，幼苗鮮重、苗長和單株葉面積分別增加52.32%、20.64%和22.51%，且均與CK 無顯著差異（P＞0.05）；其次為S-150 處理，各幼苗生長指標(biāo)與S-100 無顯著差異，與CK 相比，幼苗鮮重?zé)o顯著差異，而苗長與單株葉面積則差異顯著。

圖2 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻幼苗生長的影響Fig.2 Effects of CTS priming on the seeding growth of rice under salt stress

由表2 可得，與CK 相比，鹽脅迫（S-CK）顯著降低了水稻幼苗根系的生長，根直徑、根數(shù)、根長和根系鮮重分別降低了22.90%、19.36%、39.94%和32.54%。利用純水以及各質(zhì)量濃度CTS溶液引發(fā)均能不同程度促進(jìn)水稻根系的生長，其中，根系各項指標(biāo)以S-100處理表現(xiàn)最優(yōu)，與S-CK 相比，根直徑、根數(shù)、根長和根系鮮重分別提高了23.65%、10.72%、38.31%和29.52%，且根系直徑與CK 無顯著差異，其次為S-150處理。而過高質(zhì)量濃度的CTS溶液引發(fā)對于緩解鹽脅迫效果相對較低，且隨質(zhì)量濃度增加存在下降的趨勢。

表2 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻根系生長的影響Tab.2 Effect of CTS priming on the growth of rice roots under salt stress

2.3 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻幼苗MDA含量以及抗氧化酶活性的影響

由表3可得，與CK相比，鹽脅迫（S-CK）導(dǎo)致水稻幼苗葉片MDA含量顯著增加了67.41%；與S-CK相比，利用純水以及各質(zhì)量濃度CTS 溶液引發(fā)均顯著降低了水稻葉片中MDA 含量，降低幅度為15.53%～28.79%，其中以S-100、S-150與CK相比差異最小，但仍顯著（P＜0.05）。

表3 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻葉片MDA含量及抗氧化酶活性的影響Tab.3 Effects of CTS priming on MDA content and antioxidant enzyme activities of rice seedling leaves under Nacl stress

與MDA 表現(xiàn)趨勢相反，水稻幼苗葉片SOD、POD 和CAT 活性在鹽脅迫下均顯著降低，分別為39.74%、42.75%與52.00%。與S-CK相比，隨著CTS引發(fā)質(zhì)量濃度的增加，葉片中3種抗氧化酶活性均大致呈先升高后降低趨勢，SOD、POD 和CAT 活性增加幅度分別為28.89%～53.99%、21.27%～50.33%以及62.88%～81.19%。綜合來看，以S-100 最佳，與S-CK 相比，SOD、POD 和CAT 活性分別提高53.99%、50.33%與81.19%，其次為S-150 處理，3 種抗氧化酶活性依次提高50.17%、34.12%與77.09%，但各處理的抗氧化酶活性與CK相比仍差異顯著。

2.4 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻幼苗可溶性糖含量及相關(guān)蔗糖酶活性的影響

由圖3 可得，與CK 相比，鹽脅迫（S-CK）顯著提高水稻幼苗葉片的可溶性糖含量（38.47%）；與S-CK相比，利用純水以及各質(zhì)量濃度CTS引發(fā)處理會進(jìn)一步增加可溶性糖含量，增加幅度為61.74%～94.55%；其中以S-100 增幅最大，為94.55%，其次為S-150與S-50，增幅分別為87.95%與87.00%，3 組處理之間無顯著差異。

圖3 殼聚糖引發(fā)對鹽脅迫下水稻幼苗葉片可溶性糖和蔗糖代謝酶活性的影響Fig.3 Effects of CTS priming on soluble sugar content，SS and SPS activity of rice seedling leaves under NaCl stress

鹽脅迫（S-CK）顯著增加水稻幼苗蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性，增幅為15.84%，而蔗糖合成酶（SS）活性則顯著下降，降幅為37.19%。與S-CK 相比，各引發(fā)處理提高了水稻幼苗SPS 與SS 活性，增加幅度分別為1.76%～17.38%與10.54%～55.74%。其中，S-100 與S-150 處理提升SPS 活性最大，分別為17.38%與16.80%，且2 個處理之間無顯著差異；以S-100 提升SS 活性最高，為55.74%，且與CK 相比無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

根系是作物吸收水分以及礦質(zhì)的重要器官，鹽脅迫導(dǎo)致水稻根系生長指標(biāo)顯著下降，表明鹽離子通過根系吸收進(jìn)入到植株體內(nèi)，存在于細(xì)胞液泡中，阻礙水稻的地上部分的生長[24-25]，利用一定質(zhì)量濃度CTS 溶液對于提高根系直徑、根數(shù)、根長和根系鮮重等關(guān)鍵根系形態(tài)指標(biāo)效果明顯，表明CTS 可進(jìn)入植株體內(nèi)與鹽離子發(fā)生螯合作用，以緩解鹽脅迫[20]。本研究中，鹽脅迫（S-CK）顯著降低水稻種子的萌發(fā)指標(biāo)，利用純水引發(fā)可有效緩解鹽脅迫對水稻種子發(fā)芽的抑制，并且加入各質(zhì)量濃度CTS 溶液會進(jìn)一步緩解鹽脅迫，促進(jìn)根苗的生長，其中以100 mg/L CTS 溶液引發(fā)效果更佳。表明利用純水以及CTS溶液引發(fā)可有效提高種子發(fā)芽率，緩解逆境脅迫，這與相關(guān)學(xué)者利用CTS 提高綠豆、花生以及玉米的抗逆性研究結(jié)果一致[16,20,26]。

植株體內(nèi)MDA 含量是評估細(xì)胞膜受逆境脅迫損傷程度的重要指標(biāo)，MDA 含量越高，表明植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害越加嚴(yán)重；鹽脅迫導(dǎo)致水稻幼苗積累大量ROS，植株體通過增加SOD、POD 以及CAT 等酶活性，參與到ROS 的清除[27-29]。本研究表明，鹽脅迫顯著增加水稻幼苗葉片MDA 含量，降低SOD、POD 及CAT 活性，這可能是植物應(yīng)對逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[30]，利用CTS 引發(fā)可提高幼苗抗氧化酶活性，表明CTS 作為一類常見的抗氧化劑，可參與到植株體ROS 的清除，降低脅迫對水稻幼苗葉片氧化損傷，保持細(xì)胞膜的完整。曲丹陽等[31]研究表明，利用100 mg/L 殼聚糖處理提高了玉米幼苗AsA-GSH 循環(huán)速率，顯著提高可溶性蛋白含量以及根苗抗氧化酶活性，更好抵御鎘脅迫，這與本研究結(jié)果相似。此外，與POD 活性相比，CTS 引發(fā)提高SOD 與CAT 酶活性效果更佳，可能是由于CTS 引發(fā)主要調(diào)控SOD 與POD 酶活性基因的表達(dá)，以達(dá)到抗逆境的目的，這與王聰?shù)萚15]對大豆幼苗的研究結(jié)果相似。然而隨著引發(fā)質(zhì)量濃度的升高，根苗生長、抗氧化酶活性呈下降趨勢，因此利用CTS 引發(fā)存在一定的質(zhì)量濃度效應(yīng)，在今后的研究中針對不同作物，有必要探究最適引發(fā)質(zhì)量濃度以達(dá)到植株抗逆效果。

可溶性糖含量與植株體抗逆性呈正相關(guān)關(guān)系，含量越高，逆境脅迫下失水可能性越低，細(xì)胞膜穩(wěn)定性越強(qiáng)，蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性與植株體蔗糖合成能力息息相關(guān)[32-33]。研究表明，鹽脅迫下新麥草、黃芪幼苗可溶性糖含量會明顯增加[34-35]；外源施加殼聚糖可有效提高小麥幼苗葉片可溶性糖含量，促進(jìn)生長發(fā)育[36]，均與本試驗結(jié)果相似。鹽脅迫下，水稻幼苗葉片可溶性糖含量、SPS 活性均顯著提高，表明植株體在應(yīng)對鹽脅迫時會產(chǎn)生應(yīng)激抵御機(jī)制，而SS活性則有所降低，是由于鹽脅迫阻礙了幼苗正常的呼吸作用，阻礙了正常的糖代謝進(jìn)程[36]。本研究證實，引發(fā)促進(jìn)可溶性糖含量、SPS與SS活性提高，緩解細(xì)胞滲透壓，促進(jìn)蔗糖的合成速率，維持正常的生理活動，提高水稻幼苗抗鹽能力。

鹽脅迫顯著降低水稻種子萌發(fā)指標(biāo)，抑制根苗的生長，影響相關(guān)抗氧化酶活性，并阻礙了正常的糖代謝進(jìn)程。引發(fā)劑殼聚糖可提高鹽脅迫下水稻種子發(fā)芽指標(biāo)及發(fā)芽速率，促進(jìn)水稻幼苗葉片相關(guān)蔗糖酶、抗氧化酶活性，進(jìn)而提高水稻種子萌發(fā)過程中的抗鹽脅迫能力，以100 mg/L CTS 溶液引發(fā)效果為佳。