周?；?林金 奚娜 周繼恩 陳序偉 王其泰 徐苗燕 陳景丹 楊章女

1浙江省三門縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，臺州 317100；2浙江省三門縣疾病預(yù)防控制中心傳染病防治科，臺州 317100；3浙江省三門縣人民醫(yī)院感染科，臺州 317100；4浙江省疾病預(yù)防控制中心微生物所，杭州 310051

臨床診療中以發(fā)熱為首發(fā)癥狀就診的患者很多，其病因復(fù)雜多樣，是臨床上面臨的挑戰(zhàn)。感染是發(fā)熱的主要病因，致病原包括細(xì)菌、病毒、真菌、放線菌、支原體、衣原體、螺旋體和立克次體。本研究對浙江省三門縣部分不明原因發(fā)熱患者進(jìn)行血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測，探索其病因并分析基因型。

對象與方法

一、患者和樣本采集

將2021年4—11月三門縣人民醫(yī)院接診的，經(jīng)常規(guī)檢查無法明確病因的8例急性發(fā)熱患者納入研究。臨床醫(yī)生結(jié)合流行病學(xué)史，判斷為疑似恙蟲病，故采集急性期和恢復(fù)期血液樣本進(jìn)行恙蟲病病原學(xué)診斷；同時由于恙蟲病和斑點(diǎn)熱的臨床表現(xiàn)極其相似，因此對所有病例進(jìn)行斑點(diǎn)熱病原學(xué)檢測。所有病例均對本研究知情同意，研究符合赫爾辛基宣言。

二、立克次體感染檢測

患者急性期血液樣本進(jìn)行恙蟲病東方體、斑點(diǎn)熱群（SFGR）和斑疹傷寒群（TGR）立克次體核酸檢測。核酸提?。喝?00 μL全血，采用Qiagen DNA Blood Mini Kit（QIAGEN,Hilden,Germany）提取全血DNA，按說明書進(jìn)行。實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）：采用實(shí)時熒光PCR法恙蟲病東方體核酸檢測試劑盒和立克次體屬核酸檢測試劑盒(碩世生物科技股份有限公司，江蘇)檢測恙蟲病東方體、SFGR和TGR核酸，按說明書進(jìn)行。巢式PCR（n-PCR）：參照中國CDC《立克次體病診斷與處置手冊》[1]，分別靶向恙蟲病東方體和立克次體屬groEL基因片段。

三、序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)條帶測序由擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。獲得的核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），初步確定病原學(xué)分類地位。從Genbank中檢索相關(guān)groES基因序列，選擇部分在中國和亞太地區(qū)具有代表性的基因型序列。應(yīng)用MEGA7.0（https://www.megasoftware.net/）軟件，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

四、間接免疫熒光（IFA）

按照國家CDC《立克次體病診斷與處置手冊》進(jìn)行[1]，恙蟲病和斑點(diǎn)熱特異性抗原片由浙江省CDC微生物所提供，抗人IgG熒光抗體購自Sigma公司，患者血清1∶16起倍比稀釋，以≥1∶32為陽性參考值，雙份血清4倍及以上增高或單份血清≥1∶512認(rèn)為現(xiàn)癥感染。

結(jié) 果

一、一般資料

8例不明原因發(fā)熱患者中，男性7例，女性1例（病例6）；職業(yè)均為農(nóng)民；發(fā)病前2周內(nèi)均有上山或灌木草叢等野外活動史；5例患者有特異性焦痂和/或皮疹，其中2例有淋巴結(jié)腫大，伴有輕度肝損害。病例4為重癥患者，發(fā)熱，咳嗽，無痰，活動時胸悶氣促，伴有肺炎、胸腔積液、肝腎功能不全和凝血功能異常等并發(fā)癥。

二、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

8例患者實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果見表1，共計(jì)5例患者實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)為恙蟲病東方體感染。病例4在病程第2天時，WBC 2.6×109/L，中性粒細(xì)胞90%，血小板19×109/L，ALT 86 U/L，AST 182 U/L，堿性磷酸酶253 U/L，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶213U/L，總膽紅素84.8 μmol/L,直接膽紅素55.3 μmol/L，總蛋白46.2 g/L，白蛋白24.4 g/L，球蛋白21.8 g/L，血肌酐370 μmol/L，尿素23.22 μmol/L。該病例的凝血功能常規(guī)檢查+D-二聚體(DD)結(jié)果顯示，病程第5天：凝血酶原國際標(biāo)準(zhǔn)化比值為1.18，活化部分凝血活酶時間(APTT)59.5 s，DD18.59 mg/L；病程第9天：纖維蛋白原(FIB)1.47 g/L，纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)6 633 μg/L；病程第10天：血肌酐417 μmol/L，尿素29.70 μmol/L，血尿酸491 μmol/L。

表1 8例急性不明原因發(fā)熱疑似恙蟲病患者的部分實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果

三、影像學(xué)檢查

病例4在病程第4天時，CT平掃結(jié)果顯示，慢性支氣管炎，肺氣腫，兩肺散在感染，兩側(cè)少量胸腔積液，兩側(cè)腋窩多發(fā)淋巴結(jié)腫大；頸部彩超探及雙側(cè)淋巴結(jié)。在病程第9天時，慢性支氣管炎，肺氣腫，兩肺炎癥及肺水腫，兩肺胸腔積液伴兩肺下葉部分萎縮，兩肺散在纖維增生灶，右肺中葉肺氣囊，縱膈及兩側(cè)腋窩數(shù)枚淋巴結(jié)腫大。其他病例肺部影像學(xué)無明顯改變。

四、核酸檢測結(jié)果

3例患者急性期血液RT-qPCR法恙蟲病東方體核酸陽性，他們的Ct值均≤30.98，其中2份的n-PCR結(jié)果擴(kuò)增到約360 bp核酸片段（圖1）。所有樣本RT-PCR和n-PCR均未檢測到立克次體屬核酸。

2份n-PCR核酸陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段測序，獲得其365 bp的核苷酸序列，分別是Fang/2021（病例6）和Jing/2021（病例7）。BLAST比對2份樣本均屬恙蟲病東方體，應(yīng)用MEGA7.0軟件，構(gòu)建了2條序列和中國及亞太地區(qū)部分相關(guān)基因型序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。2條序列在系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不同支系，表明2例患者感染了不同基因型的恙蟲病東方體，F(xiàn)ang/2021與Karp原型株有一個堿基的差異（2次核酸提取，PCR擴(kuò)增測序結(jié)果相同），屬于無義突變；Jing/2021與浙江-2型Liu/2011[2]一致性為100%。

圖1 364 bp恙蟲病東方體groEL基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

五、病原學(xué)診斷

3例急性期恙蟲病東方體核酸陽性患者，其中2例同時采集到恢復(fù)期血清，雙份血清抗恙蟲病IgG抗體滴度4倍以上增高；另有2例急性期恙蟲病東方體核酸陰性患者，其中1例雙份血清抗恙蟲病IgG抗體滴度4倍以上增高，1例單份滴度血清≥1∶512。IFA檢測抗恙蟲病IgG抗體結(jié)果表明，病例5病程第4天滴度達(dá)1∶512，其余病例1～5 d陰性或在臨界值；4例患者采集到恢復(fù)期血清，其中3例抗恙蟲病IgG抗體滴度≥1∶1 024。所有血清抗斑點(diǎn)熱抗體陰性。其余3例未得到恙蟲病東方體感染確認(rèn)的病例，病例1和病例2診斷為急性上呼吸道感染，病例8為不明原因感染性發(fā)熱。

六、治療

8例患者中，5例患者為恙蟲病，其中4例輕型，1例重癥。4例輕型恙蟲病患者經(jīng)口服多西環(huán)素腸溶膠囊及其他對癥治療痊愈。1例重癥恙蟲病患者經(jīng)多西環(huán)素腸溶膠囊和特治星抗感染治療，基本痊愈。其余3例病例經(jīng)抗感染治療后均治愈出院。

討 論

本研究對流行季節(jié)并有野外活動史的急性發(fā)熱患者進(jìn)行了恙蟲病東方體和斑點(diǎn)熱立克次體的核酸和特異性抗體檢測，病原學(xué)確認(rèn)三門地區(qū)存在散發(fā)恙蟲病東方體感染。我國為恙蟲病重點(diǎn)疫區(qū)之一，2006—2016年，國家疾病監(jiān)測系統(tǒng)共記錄93 481例恙蟲病病例，總體實(shí)驗(yàn)室確診比例僅為4.7%[2-3]。國內(nèi)立克次體病常見致病原為恙蟲病東方體和斑點(diǎn)熱立克次體，分別引起恙蟲病和斑點(diǎn)熱，都以高熱、皮疹、特征性焦痂、淋巴結(jié)腫大為典型臨床特征，僅依據(jù)臨床表現(xiàn)難以鑒別[4]。

8例發(fā)熱并有野外活動史患者中，5例恙蟲病確診患者有特異性焦痂和/或皮疹，其中1例僅有皮疹，如果不進(jìn)行病原學(xué)檢測，很容易漏診。恙蟲病東方體感染可引起多種并發(fā)癥，其中并發(fā)肺炎和胸腔積液報(bào)道較多[5-6]，本研究1例恙蟲病重癥患者并發(fā)肺炎、胸腔積液和凝血功能異常，其胸部CT影像與其它感染引起的肺炎無特征性差別。多西環(huán)素和哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉抗感染治療有效。恙蟲病治療有特效敏感的抗菌素，但早期臨床癥狀不典型，易造成誤診和漏診，導(dǎo)致病情加重。因此，精確和快速的病原學(xué)診斷對于恙蟲病的確診和治療具有非常重要的意義。

本研究檢測到恙蟲病東方體核酸，序列分析表明為不同基因型，分別為Karp相關(guān)和Liu/2011相關(guān)，但由于獲得序列較短，還不能確切鑒定基因型。值得注意的是，恙蟲病東方體血液樣本內(nèi)載量較低；對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類等抗菌素敏感，菌血癥維持時間短；常溫下樣本內(nèi)恙蟲病東方體存活時間短，DNA極易降解，給核酸檢測尤其是序列分析帶來困難。因此，臨床要在發(fā)熱期、使用有效抗菌素之前盡快采集血液和焦痂樣本，低溫運(yùn)輸和貯藏，盡快檢測。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明周?；郏横j釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)研究、采集數(shù)據(jù)、分析解釋數(shù)據(jù)和撰寫文章；林金、奚娜、周繼恩、陳序委、王其泰、徐苗燕、陳景丹：采集數(shù)據(jù)；楊章女：指導(dǎo)研究