裴路，仇雯麗，王佳佳，李紅閣，楊鳳蓮，王俊利

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院a.研究生學(xué)院，b.藥學(xué)院，c.檢驗學(xué)院，廣西百色 533000)

鼻咽癌(nasopharynx cancer,NPC)是一種起源于鼻咽黏膜內(nèi)層的上皮癌[1]，在兩廣地區(qū)高發(fā)。鼻咽癌惡性程度高，75%～90% 的新發(fā)病例已為局部晚期，常伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，鼻咽癌的一線治療是放射治療。雖然放療可以提高局部控制率，延長患者5年生存率至82.1%～83.3%，但放療后的復(fù)發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移是臨床治療中面臨的兩大難題[2]。小柴胡湯(XCHD)出自《傷寒論》，是傳統(tǒng)的和解少陽之方劑，由柴胡、黃芩、半夏、甘草、大棗、人參、生姜組成，其中柴胡為君，用量最大[3]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，深入挖掘小柴胡湯增強鼻咽癌放療敏感性的潛在靶點和作用機制，為小柴胡湯的進一步研究提供方向，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 尋找NPC放療抵抗差異性表達基因通過GEO數(shù)據(jù)庫，搜索關(guān)鍵詞“nasopharynx cancer radiotherapy”得到GSE48501數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集通過鼻咽癌抗輻射亞克隆CNE2-IR細胞系按照實驗方案進行5輪亞致死劑量照射(11 Gy)培養(yǎng)生產(chǎn)，以放療敏感的親代細胞系CNE2細胞系為對照并進行測序，下載該數(shù)據(jù)集通過R4.0.5對這些數(shù)據(jù)整理和注釋并通過edgeR包用于標(biāo)準化基因表達，篩選條件為：(| log2FC| >1 和調(diào)整后的P<0.05)，得到2731個差異表達基因，1551個上調(diào)表達基因，1180個下調(diào)表達基因，并通過“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”等R包進行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析進行功能注釋。

1.2 XCHD有效成分及靶標(biāo)的尋找XCHD的有效成分從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫下載(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，其中包含很多中藥條目，藥物疾病網(wǎng)絡(luò)和藥物靶點網(wǎng)絡(luò)?？蓮腡CMSP數(shù)據(jù)庫中獲得大量草藥信息，包括成分、分子名稱、分子量(MW)、藥物相似性(DL)、人類口服生物利用度(OB)、半衰期(HL)、水分配系數(shù)(AlogP)、氫鍵供體和受體的數(shù)目(Hdon/Hacc)、Caco-2滲透性(Caco-2)。OB是口服藥物最重要的藥代動力學(xué)特性之一，評價藥物向全身循環(huán)的傳遞效率。其值由課題組前期研發(fā)的OBioavail 1.1 模型計算得出[4]。OB表示一個單位口服用藥劑量能夠產(chǎn)生藥效的百分數(shù)，是決定活性分子類藥性的關(guān)鍵指標(biāo)。DL用于評估化合物成為藥的可能性，只有具有較高OB和DL的分子才可能具有良好的藥理學(xué)活性。參考Drug Bank數(shù)據(jù)庫中藥物的DL均值為0.18，所以將口服生物利用度標(biāo)準采用≥30%、DL≥0.18的成分視為有效成分。得到246個有效活性成分。

1.3 將藥物有效基因與NPC差異表達基因交集得到交集基因通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選XCHD的有效成分后，將有效成分上傳到PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)多功能Web服務(wù)器，用于基于分子3D相似性方法探索藥理學(xué)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)。我們從ChemMapper數(shù)據(jù)庫中搜索了XCHD中每種活性成分的預(yù)測目標(biāo)，并根據(jù)3D結(jié)構(gòu)相似性高于1.0和預(yù)測得分高于0的標(biāo)準進行了篩選，找到了有效成分的二維結(jié)構(gòu)。此外，Uniprot(https：//www.uniprot.org/uploadlists/)用于標(biāo)準化預(yù)測的靶標(biāo)，并以基因ID的形式表達它們。為了提高目標(biāo)的可信度，使用STITCH數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de/，這是用于檢索預(yù)測化合物與目標(biāo)蛋白之間相互作用的常用數(shù)據(jù)庫)預(yù)測目標(biāo)。最后，制作了維恩圖，并將兩個數(shù)據(jù)庫的交集視為XCHD的最終基因靶標(biāo)。其中XCHD包括7種中藥成分，一共得到246種有效活性成分，其與NPC差異性表達基因進行交集得到38個交集基因。

1.4 化合物-靶標(biāo)-疾病(CTD)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用Cytoscape(v.3.8.0)分別構(gòu)建中藥中具有活性成分的246個靶基因和藥物-疾病相同的38個基因的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)及化合物-靶標(biāo)-疾病(CTD)網(wǎng)絡(luò)，可以看到XCHD活性成分網(wǎng)絡(luò)與分子靶向預(yù)測的靶標(biāo)以及化合物-靶標(biāo)-疾病(CTD)網(wǎng)絡(luò)核心關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)分析器插件用于根據(jù)以下標(biāo)準識別關(guān)鍵有效成分和關(guān)鍵候選目標(biāo)：程度值超過網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點平均值的節(jié)點。程度值是節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中具有的邊數(shù)，它指示一個節(jié)點與多少個草藥/成分/目標(biāo)相關(guān)。如果節(jié)點的度數(shù)值較大，則認為該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中起著更重要的作用。

1.5 交集基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建從STRING數(shù)據(jù)庫獲得疾病和目標(biāo)PPI數(shù)據(jù)，對得分≥0.04的PPI數(shù)據(jù)進行了篩選，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建小柴胡湯-target-鼻咽癌PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 將交集基因進行GO、KEGG富集分析使用R軟件處理上述38個交集基因，分別利用clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2，pathview插件包(vision 3.6.2)進行GO與KEGG的可視化，P值過濾條件為：PvalueFilter<0.05，矯正后的P值過濾條件qvalueFilter<0.05。為了進一步闡明XCHD有效成分治療NPC的作用機制，對選定的靶標(biāo)注明了化學(xué)癌變-受體的激活、p53、凋亡等信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 尋找NPC放療抵抗差異性表達基因通過GEO數(shù)據(jù)庫，搜索關(guān)鍵詞“nasopharynx cancer radiotherapy”得到2731個差異表達基因，1551個上調(diào)表達基因，1180個下調(diào)表達基因。見圖1。

2.2 XCHD有效成分及靶標(biāo)的尋找XCHD的有效成分從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，根據(jù)OB和DL對小柴胡湯中的活性成分進行篩選，分別得到柴胡活性成分17個、黃芩活性成分36個、半夏活性成分13個、甘草活性成分92個、人參活性成分22個、生姜活性成分5個、大棗活性成分29個。見表1。

表1 小柴胡湯中靶點數(shù)目排名前9位的潛在有效活性成分

2.3 將藥物有效基因與NPC差異表達基因交集得到交集基因?qū)⑺幬镉行Щ蚺cNPC差異表達基因交集得到38個交集基因。見圖2。

2.4 化合物活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)包括138個節(jié)點,215條線。拓撲結(jié)果顯示，“degree”值較高的成分是槲皮素(quercetin,MOLD00098)、山奈酚(kaempferol,MOL000422)、漢黃芩素(wogonin,MOL000173)、芒柄花黃素(formononetin,MOL000392)、異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone，MOL003896)、豆甾醇(stigmasterol,MOL000449)、柚皮素(naringenin,MOL004328)、β-胡蘿卜素(beta- carotene,MOL002773)、黃芩素(ba-icalein,MOL002714)等,小柴胡湯主要通過9個活性成分作用于PPARG、RXRA、ACHE、MAOB、CASP3、CYP3A4、BAX 7個靶標(biāo)基因,這7個靶標(biāo)基因可能影響增強鼻咽癌放療敏感性。見圖3。

2.5 靶點PPI的構(gòu)建從STRING數(shù)據(jù)庫獲得疾病和目標(biāo)PPI數(shù)據(jù)，對得分≥0.04的PPI數(shù)據(jù)進行了篩選，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建小柴胡湯-target-鼻咽癌PPI網(wǎng)絡(luò)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中“degree”值較高的靶點是PPARG、RXRA、ACHE、MAOB、CASP3、CYP3A4、BAX等,提示這些靶點可能是小柴胡湯增強放療敏感性的關(guān)鍵作用靶點。見圖4。

2.6 GO功能富集分析將上述得到的38個交集靶點通過R語言的Bioconductor生物信息軟件包進行GO功能富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)和分子功能(mo-peculiar function，MF)三部分。根據(jù)P值升序排列結(jié)果前10條顯著富集的條目，生物過程BP主要涉及對藥物反應(yīng)、氧化應(yīng)激、對有毒物質(zhì)反應(yīng)、RNA聚合酶調(diào)控、細胞黏附；細胞組分涉及細胞膜、膜筏、膜微域等方面；分子功能涉及藥物結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合和酶活性等方面。見圖5。

2.7 KEGG通路富集分析通過R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進行KEGG通路富集分析后,富集比較明顯的前20個通路，包括: 化學(xué)致癌作用中-受體的激活、丙型肝炎信號通路、P53信號、凋亡等信號通路。見圖6。

3 討 論

小柴胡湯具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。本研究結(jié)合GEO數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析預(yù)測小柴胡湯增強鼻咽癌放療敏感性的潛在藥理機制。小柴胡湯含有多種活性成分，可影響多個靶點和作用途徑。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出OB≥30%、DL≥0.18的小柴胡湯相關(guān)活性化合物，構(gòu)建了活性化合物-靶基因網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，靶點富集較多的前3位化合物是槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素(FN)。

槲皮素是廣泛存在于水果、蔬菜及中草藥中的天然黃酮醇類化合物，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外AMPK途徑、PI3K-AKT途徑和mTOR等多個信號通路[5-6]，進而影響腫瘤細胞的生長。SU等研究表明，槲皮素可通過AMPK信號通路激活誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡[7]，其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用機制可能是通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達而實現(xiàn)。槲皮素可通過調(diào)節(jié)miR-16-5p和WEE1的表達增強NSCLC細胞的放射敏感性[8]；也可通過靶向Notch-1通路增強結(jié)腸癌細胞的放射敏感性[9]。山奈酚是一種安全且潛在的放射增敏劑，可通過抑制AKT/PI3K和ERK通路以及激活線粒體凋亡通路，在體外和體內(nèi)增加了輻射對腫瘤細胞的殺傷作用[10]。FN是一種從紅三葉草中提取的功能性植物雌激素[11]，越來越多的證據(jù)表明FN對某些惡性腫瘤具有有效的藥理活性，包括乳腺癌、卵巢腫瘤和肝癌[12]，此外，另一項研究表明，F(xiàn)N抗NPC是通過直接參與抑制鼻咽癌細胞的增殖過程，其藥理機制與誘導(dǎo)線粒體依賴性細胞凋亡有關(guān)，F(xiàn)N的抗增殖和侵襲性益處是通過抑制細胞ERK1/2通路和滅活NPC細胞中的細胞內(nèi)Lamin A/C信號來實現(xiàn)的[13]。本研究中靶點富集較多的槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素在抗腫瘤方面的作用研究較少，可能是有價值的研究方向。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，NPC中有5個樞紐基因MAPK3、CAT、CASP3、PPARG和CCND1受小柴胡湯調(diào)節(jié)。MicroRNA-143靶向MAPK3調(diào)節(jié)人乳腺癌細胞的增殖和骨轉(zhuǎn)移。CASP3的遺傳變異可能會增加頭頸部鱗狀細胞癌的風(fēng)險；CASP3是一種重要的凋亡成分，是細胞凋亡的關(guān)鍵分子，細胞凋亡的形態(tài)變化是一系列胱天蛋白酶活化并水解底物的結(jié)果，其異常功能或許在癌癥發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[14]。在人類非小細胞肺癌細胞中，PPARγ的激活能夠克服 NRF2 依賴性化學(xué)抗性，在基底樣乳腺癌中，PPARG激活顯著降低了MnSoD的表達并增加了化學(xué)敏感性[15]。到目前為止，PPARG的參與已在一些其他位于頭部或頸部的鱗狀細胞癌中進行了探索，lncRNA HCG18在NPC中高度表達，并與NPC患者的不良預(yù)后相關(guān)。HCG18通過調(diào)節(jié)miR-140/CCND1軸和Wnt/β-catenin與Hedgehog途徑充當(dāng)腫瘤啟動子[16]。CCND1的過度表達是人類癌癥的公認標(biāo)志，通過催化SAGA亞基 USP22控制CCND1泛素化對于癌細胞通過G1的細胞周期進程十分重要。

在GO富集方面，我們推斷小柴胡湯可能通過干擾對藥物的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄、氧化應(yīng)激、對有毒物質(zhì)反應(yīng)、細胞黏附。RNA聚合酶Ⅱ是一種RNAP酶，存在于真核細胞的細胞核中，與NPC細胞的生長有關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示化學(xué)癌變-受體的激活、p53、凋亡和癌癥中的通路相關(guān)。有相關(guān)文獻報道，在神經(jīng)母細胞瘤小鼠模型中，p53的缺失誘導(dǎo)體內(nèi)放射抗性[17]，在黑色素瘤中，p53的恢復(fù)有利于體內(nèi)放射敏感性[18]。 在NPC細胞和小鼠中，發(fā)現(xiàn)MDM2抑制劑可抑制MDM2并增強TP53的mRNA和蛋白質(zhì)水平，并促進細胞凋亡和腫瘤生長[19]。鼻咽癌組織內(nèi)存在TP53基因突變，其可通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達，阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞衰老或凋亡[20]。因此，我們提出小柴胡湯對NPC的藥理作用可能通過這些途徑發(fā)生。本研究也存在不足，中藥單體是多靶點、多通路綜合作用的結(jié)果，由于數(shù)據(jù)庫不完善以及計算機無法真實模擬體內(nèi)環(huán)境，因此本研究著重于理論分析，后期仍需要更多體內(nèi)和體外實驗進行驗證，但這為后續(xù)機制實驗及臨床用藥提供理論依據(jù)。