白詩(shī)睿 ，馬志杰 ，梅 薩 ，陳生梅 ，陳付菊 ，郭衛(wèi)興

（1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原畜禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；3.青海省高原家畜遺傳資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；4.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；5.青海省果洛州班瑪縣畜牧獸醫(yī)站，青海 班瑪 814399）

牦牛是生活在青藏高原高寒牧區(qū)的牛族物種，享有“高原之舟”和“全能家畜”的美譽(yù)[1]。青海省是我國(guó)牦牛存欄數(shù)最多的省份，被譽(yù)為“世界牦牛之都”。青海省果洛藏族自治州平均海拔在4 200米以上，是純牧業(yè)州，牦牛是其優(yōu)勢(shì)的家畜遺傳資源，牦牛產(chǎn)業(yè)在其諸產(chǎn)業(yè)中居于支柱地位和母體地位，承擔(dān)著促進(jìn)當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)可持續(xù)發(fā)展和實(shí)現(xiàn)群眾共同脫貧致富的重任。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）被廣泛用于哺乳動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)、多樣性及系統(tǒng)發(fā)育等研究[2]。當(dāng)前，已有研究者對(duì)我國(guó)6個(gè)牦牛主產(chǎn)區(qū)的多個(gè)牦牛品種（群體）進(jìn)行了母系遺傳探究，如賴松家等[3]分析了我國(guó)5個(gè)牦牛品種的mtDNA D-loop區(qū)全序列，表明我國(guó)牦牛遺傳多樣性豐富且存在2個(gè)母系起源。郭松長(zhǎng)等[4]研究表明，我國(guó)多數(shù)牦牛品種表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性且存在較大的遺傳多樣性差異，揭示牦牛有2個(gè)母系起源。Wang Z.F.等[5]研究表明，家、野牦牛單倍型多樣度均較高且存在3個(gè)母系支系，其中第Ⅲ支系僅包含少量野牦牛，家、野牦牛共享第Ⅰ和Ⅱ支系。隨后，鐘金城等[6]、成述儒等[7]、官久強(qiáng)等[8]、Yue X.P.等[9]、李靜等[10]及Li G.Z.等[11]先后分析了西藏、甘肅、四川、新疆和青海的多個(gè)牦牛品種（群體）的母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育等，表明各?。ㄗ灾螀^(qū)）多數(shù)牦牛品種（群體）的母系遺傳多樣性水平較高，有2個(gè)母系起源，且發(fā)現(xiàn)在天祝白牦牛和互助白牦牛中存在普通牛的基因滲入。最近，王興東等[12]對(duì)青海和新疆的5個(gè)牦牛品種（群體）進(jìn)行mtDNA全序列分析，發(fā)現(xiàn)牦牛存在3個(gè)不同的母系支系，且家、野牦牛共享這3個(gè)支系。李廣禎等[13]對(duì)野牦牛及青海4個(gè)地方牦牛品種的mtDNA全序列進(jìn)行綜合分析，表明野牦牛和青海4個(gè)地方牦牛品種間遺傳分化較弱，但其母系遺傳多樣性均較高，也確定了3個(gè)母系支系，推測(cè)牦牛有3個(gè)母系起源。

綜上，雖然研究者已對(duì)我國(guó)多個(gè)牦牛品種（群體）的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探究[3-21]，但尚無對(duì)青海省果洛藏族自治州牦牛群體母系遺傳研究方面的系統(tǒng)報(bào)道。本研究對(duì)青海省果洛州3個(gè)牦牛群體（達(dá)日、瑪沁和崗龍牦牛）進(jìn)行mtDNA D-loop序列綜合分析，以明確其母系遺傳多樣性水平、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分化狀況等問題，以期為青海省牦牛遺傳資源的發(fā)掘、保護(hù)和育種規(guī)劃的制訂奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 采樣與基因組DNA提取

采用分戶隨機(jī)采樣方式，在青海省果洛藏族自治州甘德縣崗龍鄉(xiāng)共采集33頭（15♂，18♀）牦牛血液樣品（ACD抗凝），確保樣品間無親緣關(guān)系且具有代表性。使用由北京艾德萊生物科技有限公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

參照先前野牦牛的研究報(bào)道[14]，合成1對(duì)mtDNA D-loop區(qū)序列引物來擴(kuò)增崗龍牦牛群體的該序列，其中上游引物為5′-GTAAAGAGCCTCACC AGTAT-3′，下游引物為5′-TCCTCTAGCCATTGAC TAT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)采用25 μL體系，包括超純水9.5 μL、基因組DNA 1 μL、2× Premix 12.5 μL和上、下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR純化產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列下載及數(shù)據(jù)分析

從GenBank中下載已報(bào)道的37條達(dá)日縣達(dá)日牦牛的mtDNA D-loop序列（GenBank No.：DQ138998-DQ139034）和32條瑪沁縣瑪沁牦牛的相應(yīng)序列（GenBank No.：DQ139043-DQ139074）。同時(shí)，下載美洲野牛（Bison bison）的相應(yīng)序列（GenBank No.：EU177871）以及牦牛3個(gè)母系支系的代表序列（即支系Ⅰ（GenBank No.：FJ548844）、支系Ⅱ（GenBank No.：FJ548843）和支系Ⅲ（GenBank No.：DQ139202）作為外群和參考序列[14]，結(jié)合本試驗(yàn)測(cè)定的33條甘德縣崗龍牦牛的mtDNA D-loop序列，對(duì)共計(jì)102條序列使用BioEdit 7.2.5軟件開展多序列比對(duì)，后用DnaSP 5.10.01軟件確定3個(gè)牦牛群體的核苷酸序列多態(tài)位點(diǎn)以及單倍型數(shù)目，再使用Arlequin 3.5.2.2軟件計(jì)算群體單倍型多樣度、核苷酸多樣度以及群體間固定分化指數(shù)（Fst）值大小。利用公式Nm=（1-Fst）/（4Fst），計(jì)算群體間基因流(Nm)值大小。采用Mega 5.05軟件基于Fst值構(gòu)建UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)樹，以揭示3個(gè)牦牛群體間的遺傳關(guān)系。以美洲野牛作為外群，基于Mega 5.05軟件的鄰接法(neighbor-joining,NJ)和Network 10.1軟件的網(wǎng)絡(luò)中介圖(median-joining,MJ)構(gòu)建單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而揭示3個(gè)牦牛群體單倍型（組）間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)牦牛群體母系遺傳多樣性分析

通過對(duì)達(dá)日、瑪沁和崗龍3個(gè)牦牛群體638 bp mtDNA D-loop序列比對(duì)分析，排除22處插入（缺失）位點(diǎn)后，共檢測(cè)到42處多態(tài)位點(diǎn)（圖1），包括35處簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和7處單一多態(tài)位點(diǎn)。研究共確定了32種單倍型，其中達(dá)日、瑪沁和崗龍牦牛分別檢測(cè)到17、13和18種單倍型，各自擁有特有單倍型8、6和8種。3個(gè)牦牛群體共享的單倍型有6種，包括H1、H3、H10、H11、H12和H13，而達(dá)日牦牛和崗龍牦牛共享3種單倍型（H9、H15和H17），瑪沁牦牛和崗龍牦牛只共享H19單倍型。遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示，達(dá)日、瑪沁和崗龍牦牛的單倍型多樣度分別為0.901±0.034、0.887±0.033和0.951±0.019，核苷酸多樣度分別為0.016±0.008、0.012±0.006和0.029±0.015。3個(gè)牦牛群體總的單倍型多樣度為0.921±0.014，核苷酸多樣度為0.020±0.010。

圖1 青海省3個(gè)牦牛群體32種mtDNA D-loop序列單倍型核苷酸變異、頻率大小及單倍型組類型Figure 1 Nucleotide variations,frequencies and haplogroup types of 32 haplotypes based on mtDNA D-loop sequence variations of three Qinghai yak populations

此外，將3個(gè)牦牛群體與已報(bào)道的我國(guó)其他18個(gè)牦牛品種（群體）遺傳多樣性指數(shù)值進(jìn)行比較分析（表1），結(jié)果表明青海省果洛藏族自治州的這3個(gè)牦牛群體遺傳多樣性指數(shù)值仍都較高，表明其母系遺傳多樣性相對(duì)豐富。

表1 青海省3個(gè)牦牛群體與我國(guó)18個(gè)牦牛品種（群體）母系遺傳多樣性指數(shù)值比較Table 1 Comparisons of genetic diversity indexes among three yak populations in this study and other 18 Chinese yak breeds/populations

2.2 3個(gè)牦牛群體間遺傳分化及聚類分析

為揭示3個(gè)牦牛群體間的分化程度及基因交流情況，對(duì)群體間固定分化指數(shù)（Fst）值和基因流（Nm）值大小進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明（表2），崗龍牦牛與達(dá)日、瑪沁牦牛間的Fst值分別為0.118和0.129，Nm值分別為1.869和1.688，而達(dá)日牦牛和瑪沁牦牛間的Fst值僅為0.021，Nm值為11.655。利用群體間Fst值構(gòu)建UPGMA樹（圖2），結(jié)果顯示達(dá)日牦牛與瑪沁牦牛先聚為一類，而后與崗龍牦牛再聚為一大類。

表2 青海省3個(gè)牦牛群體間Fst值（下三角）及Nm值（上三角）大小Table 2 Fstvalue(lower triangle)and Nmvalue(upper triangle)among three Qinghai yak populations

圖2 基于UPGMA法構(gòu)建的青海省3個(gè)牦牛群體間聚類關(guān)系Figure 2 Clustering relationships among three Qinghai yak populations based on UPGMA method

2.3 3個(gè)牦牛群體系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)3個(gè)牦牛群體中確定的32種單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果顯示，32種單倍型明顯地分為2個(gè)大的分支（支系），其中Ⅰ支系包括25種單倍型，隸屬A、B和E單倍型組，占比為78.13%；Ⅱ支系包括7種單倍型，屬C和D單倍型組，占比為21.87%。從單倍型組構(gòu)成來看，A、B、C、D和E 5種單倍型組分別占59.38%、15.62%、9.38%、12.5%和3.12%，其中A單倍型組包括H3、H4、H6、H7、H8、H10、H12、H14、H15、H18、H19、H20、H22、H26、H27、H28、H29、H30和H32共19種單倍型，B單倍型組包括H2、H13、H17、H24和H25單倍型，C單倍型組包括H5、H9和H31單倍型，D單倍型組包括H1、H16、H21和H23單倍型，而E單倍型組僅包括H11單倍型。此外，達(dá)日牦牛單倍型個(gè)體隸屬于A、B、C、D和E 5種單倍型組，占比分別為52.94%、17.64%、11.77%、11.77%和5.88%；瑪沁牦牛單倍型個(gè)體只隸屬于A、B、D和E 4種單倍型組，所占比例分別為53.85%、15.38%、23.08%和7.69%；而崗龍牦牛單倍型個(gè)體也隸屬于A、B、C、D和E 5種單倍型組，分別占 61.11%、16.66%、11.11%、5.56% 和5.56%。

圖3 青海省3個(gè)牦牛群體母系單倍型（組）間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Figure 3 Phylogenetic relationships among haplotypes/haplogroups of three Qinghai yak populations

3 討論

遺傳多樣性研究有助于人們更清晰地認(rèn)識(shí)家畜的起源和進(jìn)化歷史，進(jìn)而為其遺傳資源的保護(hù)、育種策略制定和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。本研究首次對(duì)青海省果洛藏族自治州的3個(gè)牦牛群體（即達(dá)日、瑪沁和崗龍牦牛）進(jìn)行了母系遺傳多樣性分析，在確定的32種單倍型中，發(fā)現(xiàn)達(dá)日、崗龍牦牛均擁有特有單倍型8種，瑪沁牦牛也擁有特有單倍型6種，說明這3個(gè)牦牛群體均擁有特殊的母系遺傳信息。在遺傳多樣性指數(shù)分析中，與野牦牛及國(guó)內(nèi)其他家牦牛品種相比[3-21]，3個(gè)牦牛群體總的單倍型多樣度值較高（0.921±0.014），其中崗龍、達(dá)日牦牛群體的單倍型多樣度均較高（0.951±0.019和0.901±0.034），而瑪沁牦牛的單倍型多樣度相對(duì)較低（0.887±0.033），說明這3個(gè)牦牛群體總的母系遺傳多樣性水平較高，但崗龍牦牛和達(dá)日牦牛群體的母系遺傳多樣性相比瑪沁牦牛更為豐富。究其原因，可能與各群體間選擇強(qiáng)度、遺傳漂變、群體結(jié)構(gòu)組成及近交程度等因素存在差異有關(guān)。

群體間的遺傳分化程度可根據(jù)其Fst值大小來評(píng)估，其值越大則群體間分化程度越大。而基因流作為反映群體間基因交流程度大小的指標(biāo)，與Fst值大小正好相反。正所謂Nm值越大，F(xiàn)st值就越小，提示群體間的基因交流就越頻繁，分化程度就越弱，反之亦然。根據(jù)S.Wright[22]的研究，當(dāng)群體間Fst值在0～0.05、0.05～0.15和0.15～0.25范圍，則說明群體間遺傳分化程度分別為很弱、中等及較大，而Fst值大于0.25則說明群體間遺傳分化程度極大。本研究中，崗龍牦牛與達(dá)日、瑪沁牦牛間的Fst值分別為0.118和0.129，Nm值分別為1.869和1.688，而達(dá)日牦牛和瑪沁牦牛間的Fst值僅為0.021，Nm值為11.655，說明崗龍牦牛與達(dá)日、瑪沁牦牛間分化程度均呈中等遺傳分化水平（0.05＜Fst＜0.15），基因交流相對(duì)貧乏，而達(dá)日和瑪沁牦牛之間分化程度較弱（0＜Fst＜0.05），群體間基因交流相對(duì)頻繁。

在3個(gè)牦牛群體的聚類分析中，達(dá)日牦牛首先與瑪沁牦牛聚為一類，而后與崗龍牦牛再聚為1大類，表明達(dá)日牦牛和瑪沁牦牛間親緣關(guān)系較近，而它們各自與崗龍牦牛間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，該結(jié)果與上述群體間分化程度、基因流大小的研究結(jié)果一致。

牦牛的系統(tǒng)發(fā)育研究可以明確其遺傳背景，對(duì)其遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)利用具有重要指導(dǎo)作用。先前大量牦牛母系系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果顯示：牦牛由2個(gè)母系支系組成，推測(cè)其有2個(gè)母系起源[3-4,6-11,15-20]。然而，Wang Z.F.[5]、王興東等[12]、李廣禎等[13]、Ma Z.J.等[14]和白詩(shī)睿等[21]基于線粒體基因組及其D-loop區(qū)、蛋白編碼序列的研究發(fā)現(xiàn)家、野牦牛均擁有3個(gè)母系支系，其中大量家、野牦牛個(gè)體共享第Ⅰ、Ⅱ支系，而第Ⅲ支系中只檢測(cè)到少量野牦牛、雪多牦牛和格爾木牦牛個(gè)體，推測(cè)牦?？赡苡?個(gè)母系起源。本研究結(jié)果表明，青海省果洛州的達(dá)日、瑪沁和崗龍牦牛3個(gè)牦牛群體均由2個(gè)母系支系（Ⅰ和Ⅱ）組成，推測(cè)其均存在2個(gè)母系起源，這與先前報(bào)道中對(duì)我國(guó)大多數(shù)家牦牛品種（群體）的研究結(jié)果[3-13,15-20]吻合。

4 結(jié)論

青海省果洛州3個(gè)牦牛群體均擁有特有的母系遺傳信息，崗龍、達(dá)日牦牛群體相比瑪沁牦牛具有更豐富的母系遺傳多樣性；崗龍牦牛與達(dá)日、瑪沁牦牛群體間遺傳分化程度較高，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，而達(dá)日牦牛和瑪沁牦牛間分化水平較低，遺傳關(guān)系較近；各群體均由2個(gè)母系遺傳分支組成，推測(cè)其均有2個(gè)母系起源。