隋志遠(yuǎn)，張繼虎，李慶瑾，張志帥，張永杰，邢 鳳

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

初情期為雌性動(dòng)物初次發(fā)情并發(fā)生排卵的時(shí)期，與下丘腦－垂體－性腺軸的調(diào)控，環(huán)境和遺傳因素對(duì)黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的協(xié)調(diào)功能的相互作用有關(guān)[1-5]。初情期在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中占據(jù)極為重要的地位，是動(dòng)物獲得繁殖能力的一個(gè)重要的標(biāo)志，其出現(xiàn)的時(shí)間與動(dòng)物繁殖力有直接的關(guān)系[6]。初情期受多種因素的影響，其中包括遺傳機(jī)制、營(yíng)養(yǎng)水平和光照時(shí)間等均會(huì)影響初情期的時(shí)間[7-9]。研究表明，下丘腦中的神經(jīng)肽Y和瘦素系統(tǒng)[10]、神經(jīng)激素B系統(tǒng)[11]、γ-氨基丁酸系統(tǒng)[12]和Lin28系統(tǒng)[13]等在初情期的啟動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用。Lin28是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中，是調(diào)節(jié)線蟲發(fā)育時(shí)間（從幼蟲到成蟲的轉(zhuǎn)變過程）的異時(shí)基因[14]。在線蟲中，只有一種Lin28，而在哺乳動(dòng)物中，存在Lin28A和Lin28B兩種同源基因。Lin28A和Lin28B都含有兩個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：一個(gè)冷休克結(jié)構(gòu)域（Cold Shock Domain,CSD）和一對(duì)CCHC鋅指結(jié)構(gòu)域，Lin28A和Lin28B具有相同的功能，呈現(xiàn)不同的細(xì)胞類型分布[15]。Lin28B基因首先在人肝細(xì)胞癌中克隆出來，位于6號(hào)染色體上，其mRNA具有非常長(zhǎng)的3′UTR，有l(wèi)et-7miRNA的互補(bǔ)位點(diǎn)[15]。Lin28B基因位于綿羊的8號(hào)染色體，邢鳳等通過克隆測(cè)序獲得了多浪羊Lin28BmRNA序列的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本具有不同的編碼區(qū)和5′UTR。其中轉(zhuǎn)錄本1為6 630 bp，包含1 396 bp的5′UTR、744 bp的整個(gè)編碼區(qū)和4 490 bp的3′UTR；轉(zhuǎn)錄本2為5 271 bp，包含13 bp的5′UTR、768 bp的整個(gè)編碼區(qū)和4 490 bp的3′UTR[16]。

啟動(dòng)子通常位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游，是RNA聚合酶識(shí)別并特異性結(jié)合模板DNA上的一段核苷酸序列，保證轉(zhuǎn)錄起始的精準(zhǔn)性[17]。目前，國(guó)內(nèi)外還未有與綿羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)的相關(guān)研究，為初步探究啟動(dòng)子區(qū)域?qū)in28B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要意義，本研究將通過PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序技術(shù)，獲得和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)序列，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)該序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，從而為深入研究Lin28B基因在綿羊初情期啟動(dòng)中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取新疆維吾爾自治區(qū)和田市和田惠民畜牧科技有限公司雌性6月齡的和田羊34只，頸靜脈采血10 mL，EDTA-K抗凝處理（血液與EDTA-K為5:1（V/V））,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（DP304）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker、2× EasyTaq PCR SuperMix(+dye)、DH5α均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD19-T vector購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

參照DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）說明書對(duì)和田羊血液基因組DNA進(jìn)行提取，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)含量。將檢測(cè)合格的DNA統(tǒng)一濃度為200 ng/μL，各取5 μL進(jìn)行DNA混池構(gòu)建，放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

在 Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）上查找Lin28B的基因組參考序列（ID:ENSOARG00000011404），以 5′UTR 上游序列約3 000 bp為模板，所有引物均使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)（表1）并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。

表1 啟動(dòng)子擴(kuò)增引物Table 1 Primers for amplification of promoter

1.2.3 和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)的PCR擴(kuò)增和克隆

以和田羊血液基因組DNA為模板，對(duì)Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：基因組DNA 1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，無菌去離子水(ddH2O）9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，使用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，連接到pMD19-T Vector載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-Lin28B，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)過夜，經(jīng)藍(lán)白斑篩選之后挑取白色陽性克隆子，經(jīng)菌液PCR鑒定成功后將5個(gè)陽性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用DNAMAN 6.0軟件和NCBI Blast對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定序列的正確性。

1.2.4Lin28B啟動(dòng)子區(qū)的序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

測(cè)序獲得的Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)序列的峰圖用分子生物學(xué)軟件Chromas進(jìn)行校對(duì)，用DNAMAN 6.0進(jìn)行序列拼接。利用在線軟件Neural Network Promoter Prediction（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測(cè)Lin28B啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；利用LASAGNA-Search 2.0（https://biogrid-lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/）對(duì)Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)所有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用在線軟件FPROM（http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=fpro-m&group=programs&subgroup=promoter）預(yù)測(cè)TATA-box 和 CAAT-box；利 用 Methprimer（http://www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi）和 EMBOSS Cpgplot（http://emboss.bioinformatics.nl/cgibin/emboss/cpgplot）兩個(gè)在線軟件對(duì)Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行CpG島預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)序列的擴(kuò)增和克隆

利用設(shè)計(jì)好的特異性引物，以1 μL的34只和田羊DNA混池為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1），并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。

圖1 和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 The PCR amplification result of Hetian sheep Lin28B promoter

通過DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，測(cè)序結(jié)果不存在多態(tài)性，目的片段大小分別為887、1 117和1 200 bp，去除重疊序列，獲得和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)2 993 bp（圖2）。和田羊Lin28B啟動(dòng)區(qū)序列堿基構(gòu)成為A 834 bp、占27.87%，T 987 bp、占32.98%，C 589 bp、占19.68%，G 583 bp、占19.47%。在整個(gè)序列中，AT含量相對(duì)較高，占60.67%，CG含量占39.33%，相差約21%。

2.2 和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)序列生物信息學(xué)分析

通過在線軟件Neural Network Promoter Prediction進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)存在7個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（圖2）。通過啟動(dòng)子在線軟件LASAGNA-Search 2.0預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，所獲的和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作用元件，如Oct-1、p53、Pax-4、STAT3、TGIF等識(shí)別位點(diǎn)，總計(jì)57個(gè)，其中，STAT3結(jié)合位點(diǎn)頻率較高（表2）。通過FPROM在線軟件分析可知，和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)具有典型的真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)元件和序列特征，含有2個(gè)TATA-box（圖2）。通過Methprimer（預(yù)測(cè)條件：CpG島長(zhǎng)度＞100 bp、GC含量＞50%、ObsCpG/ExpCpG＞0.6）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)有2個(gè)CpG島（圖3）分別位于-752～-604 bp和-244～-142 bp。通過EMBOSS Cpgplot（預(yù)測(cè)條件：CpG島長(zhǎng)度＞100 bp、GC含量＞50%、ObsCpG/ExpCpG＞0.6）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)有2個(gè)CpG島（圖4）分別位于-752～-604 bp和-244～-142 bp。兩個(gè)在線軟件對(duì)于Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的預(yù)測(cè)結(jié)果完全一致。

圖2 和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子序列與結(jié)構(gòu)Figure 2 Sequence and structure in the promoter region of Hetian sheep Lin28B gene

圖3 CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果（Methprimer）Figure 3 CpG island predicitions results Lin28B gene(Methprimer)

圖4 CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果（EMBOSS Cpgplot）Figure 4 CpG island predicitions results Lin28B gene(EMBOSS Cpgplot)

表2 和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)主要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（分?jǐn)?shù)≥10）Table 2 Putative main transcription factor binding sites in the promoter region of Hetian sheep Lin28B gene(score≥10)

3 討論與小結(jié)

初情期是動(dòng)物繁殖能力開始的時(shí)期，同時(shí)初情期的早晚也與動(dòng)物的繁殖能力相關(guān)[16]。初情期早的動(dòng)物，繁殖能力較高，終身繁殖的后代數(shù)較多。人們研究證實(shí)，Lin28B和家畜的初情期的mRNA表達(dá)具有一定的相關(guān)性。Sangiao-Alvarellos等研究發(fā)現(xiàn)Lin28B基因mRNA在新生雌、雄大鼠下丘腦中大量表達(dá)，在幼年期到初情期的過渡中，Lin28B基因表達(dá)急劇下降[18]。雌性恒河猴下丘腦Lin28B基因在從幼年期到達(dá)初情期的發(fā)育過程中表達(dá)顯著下降。邢鳳等[19]研究表明Lin28BmRNA在和田羊下丘腦、垂體、卵巢組織中均有表達(dá)。很多轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件位于基因啟動(dòng)子區(qū)，這些元件與基因的轉(zhuǎn)錄有著密切的聯(lián)系。

真核生物的啟動(dòng)子常包含TATA-box、CAAT-box和GC-box等作用元件。為了探究和田羊Lin28B基因與初情期性狀相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本試驗(yàn)克隆所得和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)序列長(zhǎng)2 993 bp，在此序列中發(fā)現(xiàn)2個(gè)TATA-box、2個(gè)CpG島。其中，第二個(gè)TATA-box位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25～30 bp[20]，且與第二個(gè)CpG島的區(qū)域相一致，但未發(fā)現(xiàn)CAAT-box。

研究表明，轉(zhuǎn)錄水平上的基因調(diào)控是通過TFBS DNA序列結(jié)合，使得啟動(dòng)子與TFs之間相互作用[21]。因此，本試驗(yàn)通過LASAGNA-Search 2.0在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，和田羊Lin28B啟動(dòng)區(qū)序列包含57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，Oct-1、p53、Pax-4、STAT3、TGIF等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)頻率較高。除此之外，該序列還包含結(jié)合頻率較低的MEIS1、STAT5B轉(zhuǎn)錄因子。相關(guān)研究表明，p53[22]家族包括3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子p53，p63和p73。在大鼠中，p53過表達(dá)可能部分通過c-Myc/Lin28/let-7系統(tǒng)加速下丘腦-垂體-性腺軸的激活來影響大鼠初情期來臨的時(shí)間[23]。STAT家族包括STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6[24]。而STAT6、STAT5轉(zhuǎn)錄因子對(duì)小鼠和牛的初情期發(fā)育時(shí)間和生長(zhǎng)的調(diào)控有影響[25-26]。GPR54是調(diào)節(jié)初情期開始的重要因子，而牛的EGR1通過ATC啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)誘導(dǎo)GPR54轉(zhuǎn)錄[25-26]。MEIS1可能在支持細(xì)胞介導(dǎo)的男性青春期及青春期后精子發(fā)生調(diào)控中發(fā)揮重要作用[28]。所以推測(cè)，結(jié)合位點(diǎn)頻率較高的p53、STAT3和結(jié)合頻率較低的MEIS1、STAT5B可能與初情期的調(diào)控有一定的關(guān)系。

綜上，本研究成功克隆了和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子區(qū)序列，其序列長(zhǎng)度為2 993 bp,包含1個(gè)TATA-box和2個(gè)CpG島。通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該序列還包括57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中p53、STAT3、MEIS1和STAT5B可能與初情期的調(diào)控有一定的關(guān)系。通過對(duì)和田羊Lin28B基因啟動(dòng)子序列的初步分析，為L(zhǎng)in28B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。