唐明慧 李浩

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)引起的人畜共患病，是全球重要的公共衛(wèi)生問題[1]。我國作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，全國5歲以上人群結(jié)核分枝桿菌潛伏感染率為18.08%[2]。因此，提高結(jié)核病的診斷和治療技術(shù)顯得尤為重要。痰涂片顯微鏡檢查可以通過離心及添加化學(xué)試劑如漂白劑和NaOH等來提高檢測(cè)敏感度。但其對(duì)于不能產(chǎn)生痰液的HIV陽性結(jié)核病患者和兒童結(jié)核病患者存在局限[3-4]。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)和γ-干擾素釋放試驗(yàn)都無法完全區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)[5]。GeneXpert MTB/RIF或Xpert Ultra成本過高，對(duì)于經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)無疑是一種負(fù)擔(dān)[6]。

結(jié)核病理想的診斷技術(shù)是能夠區(qū)分結(jié)核病患者、LTBI者及治愈者[7]。與上述檢測(cè)技術(shù)相比，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)細(xì)胞壁釋放或者細(xì)胞表面的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)作為生物標(biāo)記物在結(jié)核病的診斷中獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，具有區(qū)分LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病的潛在價(jià)值，對(duì)于不能產(chǎn)生痰液的HIV陽性結(jié)核病患者及兒童結(jié)核病患者的檢測(cè)也具有診斷價(jià)值，成本相對(duì)較低，且痰液中的甘露糖帽修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped-lipoarabinomannan，ManLAM)可作為結(jié)核病治療前后細(xì)菌負(fù)荷量的生物標(biāo)志物，評(píng)價(jià)治療效果[7-8]。本文中，筆者將系統(tǒng)介紹LAM的結(jié)構(gòu)、LAM的識(shí)別抗體及其表位特征，以及LAM的檢測(cè)應(yīng)用等，旨在為LAM作為結(jié)核病免疫學(xué)診斷標(biāo)志物的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

一、LAM的結(jié)構(gòu)

(一)分枝桿菌屬細(xì)胞壁、莢膜及質(zhì)膜相關(guān)糖脂

LAM是所有分枝桿菌屬的細(xì)胞壁上的一類重要抗原，具有高度免疫調(diào)節(jié)活性，能夠參與宿主與病原體相互作用[9]。根據(jù)不同分枝桿菌的LAM所修飾的帽不同，MTB、牛分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等慢生長致病性分枝桿菌主要是ManLAM，恥垢分枝桿菌等快生長的非致病性分枝桿菌是磷脂酰肌醇帽修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(phosphatidyl-myo-inositol capped LAM，PILAM)[10-11]。MTB的ManLAM由α-(1→2)-連接的吡喃甘露糖苷(mannopyranose，Manp)單糖、二糖和三糖單元廣泛封端，ManLAM的甘露糖帽介導(dǎo)抑制促炎反應(yīng)[12]。而PILAM的磷脂酰肌醇帽能誘導(dǎo)人類巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子[13]。

MTB的細(xì)胞壁核心主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)組成：特征性長鏈分枝菌酸、高度分支的阿拉伯半乳聚糖多糖 (arabinogalactan，AG)和交聯(lián)的肽聚糖。MTB的細(xì)胞壁上含甘露糖的糖脂有ManLAM、脂甘露聚糖(lipomannan，LM)及甘露糖苷(mannosides，PIM)，其親水部分位于質(zhì)膜空間，并通過其脂質(zhì)部分鑲嵌于質(zhì)膜，外膜也存在這些糖脂，發(fā)揮調(diào)節(jié)蛋白和黏附素的作用[14-15]。MTB最外層莢膜多糖主要由葡聚糖(70%～80%)、阿拉伯甘露聚糖(arabinomannan，AM；10%～20%)和甘露聚糖組成[16]。具體見圖1。

注 LAM：脂阿拉伯甘露聚糖；AM：阿拉伯甘露聚糖；LM：脂甘露聚糖；PIM：甘露糖苷；AG：阿拉伯半乳聚糖多糖；TMM：海藻糖單菌酸鹽；TDM：海藻糖二霉菌酸酯圖1 結(jié)核分枝桿菌莢膜、細(xì)胞壁、質(zhì)膜糖脂相關(guān)成分

(二)LAM的結(jié)構(gòu)及其生物合成

ManLAM是國外研究最為廣泛的結(jié)核病診斷標(biāo)志物，是一種高度支化的脂聚糖[相對(duì)分子質(zhì)量為(17.3±5.0)×1000]，由甘露糖基磷脂酰肌醇錨、甘露糖核心骨架、阿拉伯聚糖結(jié)構(gòu)區(qū)域和甘露糖帽四部分組成，約占細(xì)菌總干重的15%[17]。細(xì)胞膜成分磷脂酰肌醇在一系列酶的作用下甘露糖基化、酰基化形成PIM，異質(zhì)性的PIM常見有PIM2和PIM6。Ac1PIM4和Ac2PIM4是形成糖基化終產(chǎn)物L(fēng)AM和LM的常見中間產(chǎn)物。LAM是在LM中加入55～70個(gè)阿拉伯糖苷產(chǎn)生的[14]。ManLAM比LM多阿拉伯聚糖及帽子結(jié)構(gòu)，它們對(duì)于分枝桿菌細(xì)胞壁的完整性及發(fā)揮致病作用十分重要[9, 18]。PIM和LM不具備單抗親和力或者親和力低[19]。AM是一種中性且異質(zhì)的莢膜多糖，AM被脂化時(shí)形成LAM，是LAM的免疫原性組成部分(圖2)。MTB糖脂PIM、LM、LAM存在共同成分，存在相互競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同適應(yīng)性細(xì)胞和固有細(xì)胞受體，在MTB感染期間產(chǎn)生免疫反應(yīng)[20]。

注 Manp：吡喃甘露糖苷；D-Araf：D-阿拉伯糖苷；MTX-Man2帽：5-甲硫基-D-木呋喃糖-二甘露糖帽；MPI：甘露糖基磷脂酰肌醇；PI：磷脂酰肌醇；LM：脂甘露聚糖；ManLAM：甘露糖帽修飾的脂阿拉伯甘露聚糖；Ac1PIM2：一?；姿峒〈级事短擒?；Ac1PIM4：一?；姿峒〈妓母事短擒眨籑an：甘露糖；Ac：?；籄ra4：四阿拉伯糖苷；Ara6：六阿拉伯糖苷；甘露糖基轉(zhuǎn)移酶：PimA、PimB’、PimC、PimE、MptA和 MptB；阿拉伯呋喃糖基轉(zhuǎn)移酶：EmbC、AftD、ArafT；甘露糖帽合成酶：CapA和 MptC圖2 脂阿拉伯甘露聚糖的結(jié)構(gòu)與生物合成及相關(guān)抗體結(jié)合表位

ManLAM具有一定的異質(zhì)性。體內(nèi)及體外培養(yǎng)、不同結(jié)核病流行地區(qū)的MTB臨床分離株ManLAM的結(jié)構(gòu)也存在差異[21-22]。阿拉伯聚糖結(jié)構(gòu)中有一條線性Ara4和一條支鏈Ara6[9]，是抗體主要識(shí)別的表位區(qū)域。5-甲硫基-D-木呋喃糖(5-methylthio-d-xylofuranose，MTX)-甘露糖帽是MTB的ManLAM特有結(jié)構(gòu)[23]，該表位對(duì)于MTB具有特異性，而麻風(fēng)分枝桿菌和恥垢分枝桿菌缺少[24]。

(三)ManLAM來源、分布及應(yīng)用

LAM可以在體外培養(yǎng)的分枝桿菌中提取，?；腖AM具有極性，且溶于水[21, 25]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過熱滅活的分枝桿菌其表面的LAM會(huì)減少[26]。據(jù)推測(cè)，LAM是分枝桿菌有機(jī)體活性代謝或者降解釋放的產(chǎn)物。巨噬細(xì)胞吞噬菌體主動(dòng)分泌LAM，后者以凋亡小體的形式傳遞到抗原提呈細(xì)胞，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，還能抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生、吞噬溶酶體成熟、巨噬細(xì)胞的凋亡和自噬，促進(jìn)白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)表達(dá)從而延緩機(jī)體對(duì)MTB的清除[27]。LAM在血液中以單體形式不穩(wěn)定，便在血清中與高密度脂蛋白等載體分子結(jié)合，經(jīng)過血液循環(huán)，流經(jīng)腎臟。LAM具有抗原性，導(dǎo)致不能直接通過腎小球，以免疫復(fù)合物的形式通過腎臟過濾進(jìn)入尿液，因此，尿液中的LAM濃度高于血清[28-29]。很多研究都證實(shí)了結(jié)核病患者的尿液[17]、唾液[8, 30]、血液[31]中存在LAM，結(jié)核病病牛的牛奶也可以檢測(cè)出LAM[32]。LAM化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，比較耐熱[33]，耐蛋白酶，無論新鮮尿液還是凍存尿液都不影響其檢測(cè)[34]。這也增加了LAM在臨床適用的靶向性。

ManLAM能被人類CD1b限制性T細(xì)胞識(shí)別并激活。利用這個(gè)特點(diǎn)，相關(guān)糖蛋白疫苗不斷誕生[35]。AM抗體可以用于合并HIV感染的結(jié)核病患者的診斷[36]，但是由于接種卡介苗也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，且檢測(cè)不穩(wěn)定，世界衛(wèi)生組織不建議抗ManLAM抗體用于血清學(xué)診斷[7]。接種卡介苗的牛產(chǎn)生的抗LAM的抗體主要為IgG2和IgG1，且能通過胎盤屏障進(jìn)入初乳[37]。針對(duì)分枝桿菌細(xì)胞壁成分的抗體具有免疫保護(hù)作用，抗ManLAM或AM抗體在MTB感染期間和卡介苗接種后均被誘導(dǎo)，LTBI者或者接種卡介苗的健康人體內(nèi)的抗AM的IgG具有保護(hù)作用，有調(diào)理吞噬作用的活性[38-40]，而活動(dòng)性結(jié)核病患者體內(nèi)的抗體往往不具有保護(hù)作用，其相關(guān)ManLAM抗體親和力低且IgG/IgM比值低[41]。

二、ManLAM相關(guān)單克隆抗體

針對(duì)ManLAM的單克隆抗體有很多，一般來說人源性抗體不適用于診斷人類結(jié)核病，因?yàn)檫@些抗體在用于人體標(biāo)本檢測(cè)時(shí)會(huì)產(chǎn)生較深的背景染色[42]。相比之下，其他類型的抗體用于人體標(biāo)本的檢測(cè)更占優(yōu)勢(shì)。此外，抗體的亞型也影響著LAM的檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，體外純化的LAM更傾向于與IgG2結(jié)合[43]。但檢測(cè)樣本抗體的亞型往往是IgG1和IgG3，導(dǎo)致這類現(xiàn)象的原因可能是感染MTB后不同時(shí)期階段分泌的抗體有所差異，也有可能是機(jī)體內(nèi)外的LAM表位有所差異。

電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)評(píng)估了各種針對(duì)LAM表位的單克隆抗體，結(jié)果顯示，雖然許多抗體能夠與純化的LAM發(fā)生特異性結(jié)合，但是應(yīng)用于臨床標(biāo)本時(shí)，檢出率偏低。這更加證實(shí)了高度異質(zhì)性的LAM的結(jié)構(gòu)及不同抗體針對(duì)的表位存在明顯差異[24]。 針對(duì)ManLAM的抗體有很多，具體見表1。

表1 針對(duì)ManLAM的單克隆抗體

(一)鼠源性抗體

CS-35是將粗糖免疫小鼠后通過麻風(fēng)分枝桿菌的LAM提取的乙醇沉淀物來篩選的針對(duì)麻風(fēng)分枝桿菌的鼠源性抗體[44]。CS-35是廣譜單克隆抗體，對(duì)LAM、AG及AM都識(shí)別，對(duì)分支Ara6表位具有優(yōu)先親和力，還與線性Ara4和Ara5結(jié)合[45]。CS-35的反應(yīng)性對(duì)是否存在甘露糖帽完全不敏感。CS-40是針對(duì)MTB的Erdman株的ManLAM產(chǎn)生的鼠源性抗體，識(shí)別LAM和AM，與未加帽的Ara4表位結(jié)合較弱，但優(yōu)先識(shí)別以單個(gè)Manp殘基和MTX 衍生物為帽的Ara4和Ara6結(jié)構(gòu)[46-47]。CS-40識(shí)別ManLAM的同時(shí)也識(shí)別PILAM，PILAM雖然沒有任何甘露糖帽修飾的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致交叉反應(yīng)性可能是CS-40與未修飾的Ara4聚糖的反應(yīng)性介導(dǎo)的[46]。FIND家族抗體只識(shí)別Ara6，不識(shí)別Ara4，對(duì)Manp殘基不敏感[46]。鼠源性抗體面臨的問題是抗體產(chǎn)量低，并且溶解性低導(dǎo)致無法純化。

(二)人源性抗體

A194是從1例接受抗生素治療的活動(dòng)性肺結(jié)核患者記憶B細(xì)胞得到的抗體[46]。A194主要針對(duì)ManLAM的阿拉伯聚糖的Ara4和Ara6表位，以及對(duì)甘露糖帽結(jié)構(gòu)的一個(gè)子集[24]。與其他抗體不同的是，A194的表位基本上存在于所有ManLAM分子。除了CS-40，A194不與其他單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)表位結(jié)合[46]。使用MTB的AM作為探針篩選來自未感染或者暴露人群的高抗AM IgG，可產(chǎn)生針對(duì)AM 聚糖表位且無交叉反應(yīng)性的單克隆抗體，例如T1AM04和T1AM09[48]。My2F12是從人類非免疫Fab-Ab噬菌體展示文庫中分離出來組成的人鼠嵌合抗體。該單克隆抗體具有接近親本的親和力，與PILAM無交叉反應(yīng)[42]。

(三)兔源性抗體

MoAb1通過噬菌體展示技術(shù)從用卡介苗免疫兔產(chǎn)生的scFv文庫分離得到重組單克隆抗體[26]，主要識(shí)別ManLAM的MTX帽[22]。雖然MTX是MTB ManLAM的特有部位，但是MTX封端殘基以低豐度存在，通常每個(gè)ManLAM分子只有1個(gè)MTX殘基，所以，這有可能導(dǎo)致檢測(cè)的敏感度降低[23]。BJRbL01和BJRbL03是用MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv細(xì)胞壁免疫兔子，再通過噬菌體展示技術(shù)篩選出針對(duì)ManLAM 的抗體[49]，能區(qū)分慢生長的MTBC和快速生長的非結(jié)核分枝桿菌。S4-20和FIND28均能檢測(cè)HIV陰性結(jié)核病患者的ManLAM，且能很好排除環(huán)境中潛在的非結(jié)核分枝桿菌的干擾[8, 24]。

三、ManLAM檢測(cè)方法的研發(fā)和應(yīng)用

尿液LAM檢測(cè)可以作為一個(gè)重要的診斷工具，抗原LAM具有反映分枝桿菌負(fù)荷量的潛在優(yōu)勢(shì)，且尿液與痰液相比，前者在實(shí)驗(yàn)室處理比較安全[3, 50]，見表2。研究表明，尿液LAM檢測(cè)有可能提高合并HIV感染的結(jié)核病患者的診斷率[51]。世界衛(wèi)生組織2016年建議的側(cè)流尿脂阿拉伯甘露聚糖測(cè)定法(lateral flow lipoarabinomannan assay，LF-LAM)測(cè)定LAM適用于CD4+T淋巴細(xì)胞≤100 個(gè)/μl的HIV陽性結(jié)核病患者[52]，該檢測(cè)方法敏感度較低[53]。全球大部分結(jié)核病患者是HIV陰性，找到適用于此類人群檢測(cè)的方法十分重要。相比之下，日本的FujiLAM(Fujifilm SILVAMP TB LAM)使用了針對(duì)主要MTB特異性LAM表位的高親和力單克隆抗體，并增加了銀擴(kuò)增步驟。該檢測(cè)在成人中檢測(cè)結(jié)核病的敏感度為75%，檢測(cè)兒童結(jié)核病的敏感度為64%。該試劑盒適用于HIV陽性結(jié)核病患者的臨床診斷，對(duì)于身體狀況較差的兒童結(jié)核病患者也具有診斷價(jià)值，可以彌補(bǔ)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)遺漏的結(jié)核病患者[34, 54-56]。

表2 結(jié)核分枝桿菌ManLAM的相關(guān)檢測(cè)

CD4+T淋巴細(xì)胞≤100個(gè)/μl的HIV陽性結(jié)核病患者尿液LAM的濃度大于10 ng/ml，而CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)高的HIV陽性結(jié)核病患者尿液LAM的濃度約為10～1000 pg/ml[24]。A194及S4-20單克隆抗體能檢測(cè)絕大多數(shù)HIV陰性結(jié)核病患者[24]。關(guān)于HIV陰性結(jié)核病患者尿液的LAM檢出率低的原因，大概有3種推測(cè)：一是標(biāo)本中的蛋白與LAM絡(luò)合在空間上阻礙了LAM抗原與抗體的特異性結(jié)合，循環(huán)中的抗LAM抗體也影響血清中LAM的檢測(cè)[57]。二是當(dāng)MTB感染腎臟或者腎功能不全時(shí)，LAM抗原才可以直接從感染組織進(jìn)入尿液中[58-59]。三是LAM具有高度異質(zhì)性，大部分抗體針對(duì)的是從培養(yǎng)基中提取的LAM，但臨床樣本與培養(yǎng)基中LAM所呈現(xiàn)的表位不同，這便導(dǎo)致了檢測(cè)敏感度的降低[21]。如果檢測(cè)技術(shù)的敏感度足夠高，測(cè)定HIV陰性結(jié)核病患者的血清和尿液中的LAM是完全可行的[60]。電化學(xué)發(fā)光測(cè)量尿液中的LAM比血清的準(zhǔn)確性更高[33]。除了與LAM結(jié)合的免疫復(fù)合物，基質(zhì)組分如氨基酸、多肽、脂質(zhì)、代謝終產(chǎn)物等也會(huì)掩蓋或者改變LAM表位。有研究者即使用蛋白酶或者酸來破壞樣本中大分子物質(zhì)，從而提高診斷敏感度和準(zhǔn)確性[42, 61-62]。去?；腖AM和保留Ara6豐度也能提高檢測(cè)敏感度[21]。

HIV陰性結(jié)核病患者細(xì)菌負(fù)荷量相對(duì)HIV陽性結(jié)核病患者低，導(dǎo)致前者尿液LAM濃度偏低。結(jié)核病的發(fā)展階段、合并癥、器官菌載量、感染情況等可能會(huì)導(dǎo)致患者機(jī)體的LAM分布發(fā)生變化。例如，抗體糖表位類別對(duì)糖尿病與結(jié)核病共病患者尿液中的LAM具有不同的敏感度，也就使得不同抗體對(duì)于糖尿病與結(jié)核病共病患者檢測(cè)敏感度有所不同[22]。

Crawford等[57]將金納米顆粒(AuNP)標(biāo)記抗體做夾心法ELISA，利用表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)檢測(cè)血清中的ManLAM，放大了檢測(cè)信號(hào)。藍(lán)藻凝集素與ManLAM的甘露糖有較高親和性，藍(lán)藻凝集素功能化磁珠的ELISA檢測(cè)尿液中ManLAM效果較好[63]。Paris等[64]設(shè)計(jì)水凝膠納米籠，應(yīng)用高親和力銅絡(luò)合物染料捕獲ManLAM，排除其他物質(zhì)的干擾，大大提高了檢測(cè)敏感度。Wood等[65]將等離子體光柵與抗LAM捕獲抗體結(jié)合，一同與患者尿液樣本和生物素化檢測(cè)抗體孵育，該檢測(cè)結(jié)果滿足世界衛(wèi)生組織所建議的檢測(cè)敏感度(>65%)和特異度(>98%)要求，為針對(duì)LAM抗體的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。Broger等[33]利用電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)試測(cè)量HIV陽性和陰性結(jié)核病患者尿液和血清中LAM，敏感度分別可達(dá)到93%和55%。Divagar等[66]利用等離子體光纖吸光度生物傳感器檢測(cè)ManLAM，在U型彎曲光纖探針上進(jìn)行等離子體夾心免疫測(cè)定，在緩沖液和合成尿液中ManLAM的檢測(cè)限分別低至 1 fg/ml和10 fg/ml。

核酸適體與抗體類似，具有易修飾、高親和力、高特異性等優(yōu)點(diǎn)。Tang等[67]通過指數(shù)富集方法從北京基因型MTB菌株中制備一種針對(duì)MTB的ManLAM特異的單鏈 DNA 適體(T9)“抗體”，T9對(duì)血清或痰液中的ManLAM具有較高的親和力，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)可使檢測(cè)敏感度明顯提高[68]。

四、結(jié)語

ManLAM具有免疫調(diào)節(jié)的功能，作為結(jié)核病的診斷標(biāo)記物獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。但是國內(nèi)目前使用相關(guān)診斷標(biāo)記的方法較少。在檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病患者M(jìn)anLAM時(shí)，為了提高檢測(cè)敏感度，可以從三方面入手：一是解決從大容量樣本中獲取低濃度的ManLAM或者克服基質(zhì)反應(yīng)的問題。因HIV陰性結(jié)核病患者細(xì)菌負(fù)荷量較低，導(dǎo)致體內(nèi)ManLAM濃度低，需要將夾心ELISA或者免疫層析法與其他技術(shù)聯(lián)用來放大檢測(cè)信號(hào)，從而提高檢測(cè)敏感度和特異度。樣本中存在免疫復(fù)合物、大分子蛋白、反應(yīng)抑制劑等，采用適當(dāng)?shù)臉颖绢A(yù)處理技術(shù)可以進(jìn)一步提高檢出率。二是獲得高質(zhì)量的單克隆抗體。由于ManLAM具有高度異質(zhì)性，獲取具有高特異性、高親和力，且針對(duì)單一表位的抗體是有難度的。體外提取的ManLAM和內(nèi)源性ManLAM抗體表位存在一定差異，而市面上大多抗體都是針對(duì)體外提取的ManLAM，采用B淋巴細(xì)胞篩選技術(shù)從患者體內(nèi)獲取的抗體來檢測(cè)ManLAM 效果可能會(huì)更佳。另外，尋找抗體的代替品例如核酸適配體來檢測(cè)ManLAM也是不錯(cuò)的選擇。第三是增加MTB新型標(biāo)記物。診斷試劑盒的開發(fā)除了利用ManLAM外，還可以利用MTB分泌的早期分泌抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白10輔助檢測(cè)，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)唐明慧：起草文章初稿，初稿修改，文獻(xiàn)查閱及校對(duì)；李浩：內(nèi)容審核及校對(duì)