張睿 劉艷萍 錢軍 方強林 楊崇廣

傳統(tǒng)觀念認為，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是一種遺傳同源且相對保守的細菌，其突變率低于大部分細菌，且基本上不存在水平基因轉移事件[1]。但研究發(fā)現(xiàn)，MTB在單一宿主內(nèi)存在著顯著菌群遺傳多態(tài)性[2]。這可能是由于多種不同基因型菌株的多重感染、外源再感染或同一基因型的菌株在宿主內(nèi)微進化所致，從而導致在同一宿主內(nèi)觀察到MTB菌群的異質性。MTB的宿主內(nèi)異質性為結核病的傳播、診斷及治療帶來重大挑戰(zhàn)。筆者主要梳理了MTB遺傳異質性的成因及鑒定方法，并對MTB異質性在臨床上對患者耐藥、治療，以及從人群角度對傳播推斷等影響的研究進展進行綜述。

一、宿主內(nèi)MTB異質性及多重感染的鑒定

MTB多重感染也稱混合感染或多克隆感染，是指同一宿主感染遺傳特征不相關的MTB菌株，導致其體內(nèi)存在不同遺傳類型的菌株(本文統(tǒng)一用多重感染指代這幾類現(xiàn)象)[3]。微進化是指宿主內(nèi)單一遺傳特征菌株在體內(nèi)選擇壓力差異下所發(fā)生的遺傳變異，從而在同一宿主體內(nèi)同時觀測到不同遺傳變異的MTB亞群。一般認為因微進化所產(chǎn)生的可被衡量的遺傳變異較小，而多重感染導致的則可能更顯著[4]。盡管如此，還是難以甄別一些復雜的感染情況，難以辨別所觀測的遺傳異質性到底是何種原因所致，因此，也將這些現(xiàn)象合稱為“復雜感染”[5]。

多重感染是較早期被觀察到的導致宿主內(nèi)異質性的原因，可以通過臨床樣本中是否同時存在不同遺傳特征(如基因型型別)的菌株來進行鑒定。早在1970年代，在噬菌體分型培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了多重感染現(xiàn)象[6-7]，其后主要通過基因型分型方法進行判別。經(jīng)典的基因型分型方法包括：間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(Spoligotyping)[8]、IS6110限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型和分枝桿菌散布重復單位可變數(shù)目串聯(lián)重復(MIRU-VNTR)分型[9]，這些方法都是針對MTB基因組特定或者規(guī)律性基因組元件來進行基因型分型，通過檢測此類基因組中重復元件的拷貝數(shù)目和分布情況來評估體內(nèi)是否存在不同的MTB菌株。這些方法對樣本要求有所不同，IS6110RFLP需要使用同一患者不同的樣品進行檢測，而MIRU-VNTR等通常使用1份樣品即可鑒別[10]。利用不同的分型方法，在不同地區(qū)的MTB多重感染比例不同，且基于這些單一類型基因組元件的分型方法分辨率有限，其準確度比較受限，即只有當復雜感染的菌株在上述基因組元件有差異,或存在的差異達到方法檢測閾值時才能被識別[11]。隨著二代測序(next-generation sequencing，NGS)技術的發(fā)展，對MTB全基因組測序(whole-genome sequencing，WGS)分析顯示了其在耐藥鑒定和演化、傳播模式以及遺傳多態(tài)性分析方面的高分辨率優(yōu)勢[12]。由于NGS構建測序文庫時通過對打散后的微小DNA片段進行擴增和高通量測序，理論上能記錄下樣本包含的MTB種群在基因組每個位點上的變異情況(圖1A)，再通過生物信息學方法識別所需要的變異位點和頻率等信息，為宿主內(nèi)菌群異質性的特征研究提供了準確和高效的研究工具。

圖1A：異質性突變位點鑒定；圖1B：全基因組單核苷酸多態(tài)性頻率分布，除76號樣本外，其他結核分枝桿菌樣本均存在異質性-多重感染或者微進化圖1 二代測序遺傳異質性位點和基因組單核苷酸多態(tài)性位點頻率分布

近幾年，基于測序數(shù)據(jù)，國內(nèi)外學者研發(fā)了多個判別多重感染的生物信息工具或統(tǒng)計算法[13-16]，其鑒別方法大致分為兩類：一是通過對進化路徑的判斷，識別臨床分離樣本中是否存在不同進化路徑(即代表不同基因型)的MTB菌株[15]，如MixPORE(2022)[17]；二是通過分析樣本中存在的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點分布頻率異質性(如測序reads中突變頻率小于30%，圖1B)，繼而利用數(shù)理統(tǒng)計模型判斷是否存在多重感染現(xiàn)象，如QuantTB(2020)、SplitStrains(2021)[13-14, 16]等工具，不過上述工具的應用價值還需要更多的現(xiàn)實多重感染樣本的研究來進一步驗證。

除了不同的鑒定方法，檢測樣本的選擇也會影響遺傳異質性及多重感染的檢出[18]。如直接檢測的臨床生物樣本比經(jīng)再培養(yǎng)后檢測的樣本有更多的遺傳多態(tài)性，肺切除術中組織的不同部位具有的MTB多樣性也不一樣，且相比于痰液培養(yǎng)樣本具有更多的遺傳異質性[19]。所使用的培養(yǎng)基類型也可能會影響不同菌株的生長，從而影響檢測多重感染的能力[20]。此外，宿主的免疫能力水平也可能會影響多重感染的發(fā)生。在烏干達的一項研究發(fā)現(xiàn)，有至少50%感染HIV的晚期患者感染了多種不同型別的MTB[21]，但是HIV/MTB雙重感染是否對多重感染檢出率的升高有影響還未有定論[16, 22]。

隨著WGS技術的普遍應用，更多的結核病復雜感染被發(fā)現(xiàn)，除了多重感染，同一宿主內(nèi)存在多態(tài)性不一的MTB菌株還可能是同一菌株在宿主內(nèi)的微進化所致。因此，如何有效區(qū)分樣本的異質性來源于多重感染還是因宿主內(nèi)發(fā)生微進化導致的遺傳多態(tài)性是研究的難點之一[23]。其中，關鍵衡量指標包括出現(xiàn)多態(tài)性的基因組差異大小，如MIRU-VNTR差異位點數(shù)量，IS6110RFLP的條帶差異數(shù)以及基因組測序的遺傳距離大小(表1)。以分辨率最高的NGS數(shù)據(jù)為例，已有的研究表明，同一宿主內(nèi)一般存在相差100個SNP距離以上可認為是遺傳特征不同的菌株，作為多重感染的判斷依據(jù)；而相差不大于10個SNP可以認為是同一菌群微進化導致[11]。然而，對于10～100個SNP之間的遺傳差異判定，還未有定論。理論上，微進化和多重感染之間的判定應存在明顯差異，即同一菌株不可能通過微進化演變?yōu)椴煌甑亩嘀馗腥荆坏珜嶋H上有可能存在感染2種及以上遺傳足夠接近的不同菌株，從而造成這兩種現(xiàn)象呈現(xiàn)出沒有明顯的遺傳距離閾值界限的鑒別難題。

表1 鑒定多重感染及微進化方法[3]

二、復雜感染和異質性耐藥

異質性耐藥現(xiàn)象是指患者體內(nèi)同時存在敏感菌和耐藥菌，以及不同耐藥譜的菌群共存。近年來，國內(nèi)外越來越多的報道鑒定了異質性耐藥現(xiàn)象并揭示其可能的產(chǎn)生機制，包括本文論述的多重感染和微進化[38]。

宿主內(nèi)的病原菌產(chǎn)生耐藥相關的遺傳變異是在藥物等壓力下的適應過程。隨著NGS技術的發(fā)展，宿主內(nèi)同一菌群發(fā)生的異質性耐藥現(xiàn)象能得以觀測到。比如單一時間點取樣觀測到敏感和耐藥菌群共存，以及多個取樣時間點觀測到耐藥相關突變此消彼長的動態(tài)過程[39]。由于宿主內(nèi)出現(xiàn)異質性耐藥，從而導致表型與基因型耐藥檢測結果不符并且對治療藥物呈現(xiàn)不同的耐受程度[40]。有研究表明，耐藥位點的突變頻率相比較其他功能位點的突變速率更高，可能是藥物環(huán)境以及宿主體內(nèi)不同病灶的空間異質性導致藥物濃度差異加速了耐藥位點的選擇進程[41]。一開始在體內(nèi)發(fā)生耐藥變化的菌株數(shù)量處于劣勢，其突變頻率非常低，常規(guī)實驗手段都很難捕捉這一現(xiàn)象，直到Zhang等[42]使用PCR等技術對相關基因片段擴增，觀測到了部分耐藥位點存在異質性；Sun等[43]利用二代WGS技術，利用異質性SNP率先描述了MTB宿主內(nèi)耐藥異質性這一動態(tài)現(xiàn)象。

除了微進化導致的異質性耐藥，早期臨床研究還發(fā)現(xiàn)宿主內(nèi)發(fā)生耐藥株和敏感株的多重感染，導致臨床診治呈現(xiàn)復雜現(xiàn)象，包括治療過程中耐藥表型的改變、療程和結局改變等，這種復雜感染的情況可能與臨床的不良結局相關[44]。有學者提出多重感染引發(fā)的異質性耐藥和臨床不良治療結局之間可能存在一定關系，但目前發(fā)表的研究對此有不同結論。Shin等[22]對inhA啟動子、katG基因和rpoB基因深度靶向測序鑒定異質性耐藥，發(fā)現(xiàn)多重感染與不良治療結局相關，但是與異質性耐藥無關。Chen等[45]采用深度測序，發(fā)現(xiàn)新發(fā)結核病患者的分離株中均未發(fā)現(xiàn)頻率>0.5%的異質性耐藥，在復治藥物敏感結核病患者中出現(xiàn)0.5%～1%的異質性耐藥，而這種低水平的異質性耐藥與不良治療結局之間沒有相關性。因此，對于多重感染與不良治療結局之間的關系是否與異質性耐藥的產(chǎn)生有關仍需要進一步研究。發(fā)生多重感染的感染者體內(nèi)還可能同時存在有不同耐藥基因型的菌群[46]。隨著治療的進行，體內(nèi)的耐藥譜會發(fā)生改變，產(chǎn)生的異質性耐藥難以通過傳統(tǒng)的方法進行檢測或解釋[43, 47]。此外，由于體內(nèi)同時存在耐藥菌和敏感菌，難以確保有效用藥，使用二線抗結核藥物可能會導致對敏感菌株殺滅不徹底[48-49]。多重感染導致的耐藥異質性和耐藥譜的變化也凸顯了在臨床治療過程中進行耐藥監(jiān)測的必要性。

為了檢測早期出現(xiàn)的低頻的耐藥相關基因突變，可以通過不斷提高測序深度來提高低頻SNP的發(fā)現(xiàn)率。有研究表明，如果需要得到1%頻率的等位基因，在測序上至少提供400倍的片段覆蓋率[50]，不同的研究目的需要使用不同的測序深度。近幾年還出現(xiàn)了深度靶向測序技術，相比于WGS，既可以節(jié)省成本加快檢測速度，同時還具備對痰樣本直接檢測的能力，從而減少因培養(yǎng)導致的遺傳多態(tài)性的失真，Deeplex Myc-TB靶向深度測序可以直接對痰樣本檢測13種抗結核藥物的耐藥性[51]，從而快速準確得到宿主內(nèi)耐藥譜以及異質性耐藥的情況?；贜GS甚至是三代測序開發(fā)的這些工具，有望進一步提高對異質性耐藥的檢測效果，具備指導臨床精確治療的應用價值。

此外，在診斷應用方面，一項對同一MTB感染者的耐藥變化的9年研究發(fā)現(xiàn)，使用二代WGS可以先于藥物敏感性試驗了解患者的耐藥情況[52]，使其在治療上具有藥物選擇前瞻性。另外一項持續(xù)27年的研究發(fā)現(xiàn)，異質性耐藥復雜情況會導致不良治療結局，需要對耐藥譜進行快速檢驗并據(jù)此制定有效的治療方案[53]。在治療上，患者體內(nèi)異質性呈動態(tài)變化并且有部分患者不斷出現(xiàn)新的耐藥相關變異，在一定程度上影響治療效果[54]。對于僅存在不同敏感菌株的多重感染對治療結局影響的研究較少，這可能和宿主本身的特征(如免疫功能等)有關，目前還未有定論。面對宿主內(nèi)存在復雜的MTB亞群，會使得不同病灶對抗生素治療產(chǎn)生不同反應[55]。但是也有研究認為，異質性與疾病嚴重程度有關，但與治療或耐藥表型無關[56]。因此，異質性耐藥是疾病加重的表現(xiàn)，但對不良結局的影響還需要進一步研究。

三、宿主內(nèi)菌株異質性和傳播

MTB傳播是基于人群的研究，主要目的是找到成簇的菌株，用來指代是否發(fā)生屬于同一傳播鏈的感染事件；而宿主內(nèi)異質性變化主要針對個體研究。因此，如何同時觀測群體與個體遺傳多態(tài)性是主要挑戰(zhàn)。相較而言，多重感染對傳播的影響可能比較容易觀察到，有研究曾在不太可能發(fā)生體內(nèi)微進化的兒童感染群體中觀察到多重感染[57]，但是由于多重感染導致體內(nèi)存在多個基因型，無法通過SNP閾值來鑒定傳播簇和傳播關聯(lián)，所以，大多數(shù)基于基因組測序數(shù)據(jù)的傳播研究會舍去被認定為多重感染的菌株樣本[58]。

多重感染的發(fā)生和人群的感染風險密切相關。對于一些人群聚集性較高且結核病傳播風險較高的特殊場所，如監(jiān)獄、醫(yī)院等，更有可能檢測到多重感染現(xiàn)象，甚至觀測到涉及多重感染的傳播事件。秘魯?shù)囊豁楆P于監(jiān)獄結核病傳播規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，兩種流行的耐多藥菌株同時存在并且發(fā)生傳播，使得該地頻繁發(fā)生多重感染[29]。近期一項在英國開展的長期基因組流行病學研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)有至少9%以上的傳播菌株可能發(fā)生了多重感染，且與傳播事件明顯相關聯(lián)；并且這些多重感染相關的基因型在后續(xù)社區(qū)中被再次發(fā)現(xiàn)，為揭示多重感染促進結核病的傳播提供了參考[17]。多重感染的風險和宿主易感程度以及人群中的感染風險壓力呈比例，因此，在一般人群中，多重感染的高發(fā)可能代表當?shù)氐腗TB傳播較為嚴重，但能否作為當?shù)貍鞑グl(fā)生風險的衡量指標有待進一步探索。

大量關于MTB傳播的研究是將基因分型技術與傳統(tǒng)的流行病學調查結合作為研究手段，并依據(jù)SNP差值來量化遺傳距離并結合流行病學調查來推斷個體之間的傳播方向。宿主內(nèi)微進化所產(chǎn)生的遺傳異質性會增加傳播路徑的推斷難度。當前基于WGS技術推斷傳播的遺傳距離值大多選擇5～12個SNP[59]，但是可能需要隨著不同研究人群和研究目的而有所改變，尤其在傳播過程中存在遺傳異質性并不適用恒定的SNP閾值[60]。遺傳異質性還可以隨著傳播鏈直接傳遞。美國的一項研究發(fā)現(xiàn)宿主內(nèi)異質性可以直接傳播給繼發(fā)病例[61]，這表明繼發(fā)病例所感染的菌株已經(jīng)累積了源病例體內(nèi)的部分遺傳異質性。但是微進化導致的異質性能夠多大程度上在不同宿主間傳播，以及這種傳播是否遵循特定的模式，還需進一步研究。此外，傳播促進了MTB整個種群遺傳多樣性的發(fā)展[60]，傳播過程中異質性涉及的基因是否存在選擇偏好性，有待進一步研究。

一項檢測異質等位基因(heterogeneous alleles，hSNP)的研究發(fā)現(xiàn)，宿主間hSNP相似性與流行病學數(shù)據(jù)證實的傳播之間具有一致性，表明檢測hSNP可能增加了推斷傳播網(wǎng)絡的分辨率[62]。此外，基于基因測序數(shù)據(jù)構建的傳播推斷模型也將宿主內(nèi)異質性納入考慮，如TransPhylo[63]傳播推斷軟件包，在推斷傳播事件時考慮每個傳播環(huán)節(jié)都在不同的個體宿主中進化，并模擬宿主內(nèi)的遺傳異質性在傳播時丟失的情況，最終推斷傳播節(jié)點及判斷是否存在未發(fā)現(xiàn)的繼發(fā)病例。

四、總結與展望

多重感染和微進化導致的宿主內(nèi)MTB異質性使得患者體內(nèi)MTB的感染情況變得復雜，可能促進了耐藥異質性的產(chǎn)生；同時，宿主內(nèi)MTB異質性使得治療過程中耐藥診斷和治療復雜化，還提高了傳播規(guī)律研究的難度。目前，對于多重感染和異質性的研究還存在許多難點。例如，多重感染的準確鑒定以及在人群中的真實發(fā)生率有待準確估算；所導致的體內(nèi)異質性又將如何影響傳播研究的SNP閾值的確定；通過痰樣本培養(yǎng)來獲得臨床菌株樣本和藥物敏感性試驗，本身就導致遺傳多樣性的缺失，對準確鑒定耐藥表型帶來一定挑戰(zhàn)。因此，在臨床治療上是否參考測序數(shù)據(jù)制定治療方案會更加準確，值得進一步研究。最后，能否通過體內(nèi)異質性變化來預測耐藥發(fā)展趨勢或者疾病療程和效果也是一個值得關注的研究方向。未來還需要更多的研究來準確鑒定宿主內(nèi)異質性的發(fā)生及其對流行傳播規(guī)律研究和臨床診療效果的影響，為結核病防控工作提供更多新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻張睿：課題設計、查閱文獻、撰寫論文；劉艷萍：查閱文獻、修改文章；錢軍和方強林：文章修改；楊崇廣：文章修改、審核，并最后定稿