范春光，劉 佳，侯 麗，劉成虎，李春令，汪曉飛，施燕平，劉 斌

（山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101）

0 引言

醫(yī)療器械中的某些材料及其可瀝濾物在與人體接觸時(shí)可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，所以在相關(guān)醫(yī)療器械上市前須進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)[1-2]，以確保其安全性。皮膚刺激試驗(yàn)是醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)的基礎(chǔ)項(xiàng)目。

目前，醫(yī)療器械皮膚刺激試驗(yàn)共分三大類：人體試驗(yàn)、體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)和體外試驗(yàn)[3]。其中，最常用的是體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)中的家兔Draize皮膚刺激試驗(yàn)。此試驗(yàn)先將醫(yī)療器械浸提液和浸提介質(zhì)對(duì)照分別置于白兔去毛后背部完好的皮膚上，用半封閉或封閉敷料包裹一定時(shí)間后清理試驗(yàn)部位，然后在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)部位的紅斑和水腫情況通過肉眼觀察進(jìn)行記分，將浸提液記分結(jié)果與浸提介質(zhì)對(duì)照的記分結(jié)果進(jìn)行比較和計(jì)算，最后判定反應(yīng)類別。

近年來，隨著人們動(dòng)物保護(hù)意識(shí)的不斷增強(qiáng)，替代、減少和優(yōu)化的3R原則逐漸深入人心，各種體外替代試驗(yàn)發(fā)展起來。體外重建人表皮（reconstructed human epidermis，RhE）刺激試驗(yàn)就是其中的一種。體外RhE模型是采用人正常角蛋白細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的三維皮膚模型，其包括基底層、棘層、顆粒層和有功能的角質(zhì)層，是為檢測(cè)純化學(xué)物皮膚刺激性而研發(fā)的[4-6]。經(jīng)一定的調(diào)整，體外RhE模型也被用于檢測(cè)醫(yī)療器械的皮膚刺激性[5，7-11]。而體外RhE試驗(yàn)是將醫(yī)療器械浸提液和介質(zhì)對(duì)照分別置于體外RhE模型表面孵育一定時(shí)間后清除，再檢測(cè)模型中細(xì)胞的相對(duì)活性，根據(jù)相對(duì)活性判定醫(yī)療器械皮膚刺激性。

本研究選取一種典型的接觸皮膚的醫(yī)療器械及2種濃度的陽性物質(zhì)，分別采用體外RhE試驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)該醫(yī)療器械和陽性物質(zhì)的皮膚刺激性。通過比對(duì)體外、體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，分析2種方法的利弊，探討體外RhE試驗(yàn)應(yīng)用于醫(yī)療器械皮膚刺激檢測(cè)的可行性及其在我國替代動(dòng)物試驗(yàn)的可能性。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)樣品及材料

本研究選用某醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)提供的水膠體敷料作為試驗(yàn)樣品1（記為T1），選用皮膚刺激陽性物質(zhì)乳酸（Fluka，分析純，500 mL，貨號(hào)：69785）作為試驗(yàn)樣品2（記為T2）。27塊SkinEthicTMRHE模型（批號(hào)：20ChRHE060511）購于上海斯安膚諾生物科技有限公司。12只新西蘭白兔[許可證號(hào)：SCXK（魯）20180006]購于濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

本研究使用的儀器設(shè)備主要包括生物安全柜（山東博科，BSC-1100ⅡB2-X）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，Heracell VIOS 160i）、酶標(biāo)儀（Thermo，Multiskan MK3）、水平搖床（上海智誠，ZHWY-100B）、移液器（Eppendorf，3122000.060）和渦旋振蕩器（IKA，MS3）等。

1.3 試劑及耗材

本研究使用的試劑及耗材主要包括組織培養(yǎng)基（上海斯安膚諾，批號(hào)：20ChRHE060511）、杜氏磷酸鹽緩沖溶液（Gibco，1×，1 000 mL，貨號(hào)：2085604）、0.9%氯化鈉注射液（山東辰欣，500 mL，貨號(hào)：190823 2162）、芝麻油（ACROS，250 mL，貨號(hào)：A0409661）、20%十二烷基硫酸鈉水溶液（Sigma，500 mL，貨號(hào)：BCBZ7807）、噻唑蘭（Sigma，1 g，貨號(hào)：M5655）、異丙醇（上海滬試，500 mL，貨號(hào)：20180530）、吸水紙、棉棒等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

2.1.1 試驗(yàn)樣品的制備

T1：取30 cm2水膠體敷料（雙面），按1 cm×1 cm大小進(jìn)行裁剪，置于玻璃瓶中，按照3 cm2/mL的比例加入10 mL極性浸提介質(zhì)（0.9%氯化鈉注射液），額外加入5.5 mL吸收量（預(yù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)得在下述樣品制備條件下30 cm2雙面水膠體敷料可吸收5.5 mL 0.9%氯化鈉注射液），確保極性浸提介質(zhì)完全覆蓋樣品，于（37±1）℃、60 r/min的振蕩條件下浸提（72±2）h制備極性浸提液[12]，記為T1a；另取30 cm2水膠體敷料（雙面），按1 cm×1 cm大小進(jìn)行裁剪，加入10 mL芝麻油，在相同條件下制備非極性浸提液，記為T1b。

T2：取30μL乳酸母液與1 970μL 0.9%氯化鈉注射液經(jīng)渦旋振蕩充分混勻配制體積分?jǐn)?shù)為1.5%的乳酸溶液，記為T2a；另取80μL乳酸母液與1 920μL 0.9%氯化鈉注射液經(jīng)渦旋振蕩充分混勻配制體積分?jǐn)?shù)為4%的乳酸溶液，記為T2b。

2.1.2 對(duì)照樣品的制備

介質(zhì)對(duì)照（VC）樣品：將0.9%氯化鈉注射液置于浸提容器中，并與試驗(yàn)材料同時(shí)進(jìn)行相同的浸提過程制備介質(zhì)對(duì)照樣品，記為VCa；采用相同的方法制備芝麻油介質(zhì)對(duì)照樣品，記為VCb。

陰性對(duì)照（NC）樣品：杜氏磷酸鹽緩沖溶液不作處理，作為陰性對(duì)照，記為NC。

陽性對(duì)照（PC）樣品：取500μL 20%十二烷基硫酸鈉水溶液與9.5 mL 0.9%氯化鈉注射液渦旋振蕩充分混勻，制備體積分?jǐn)?shù)為1%的十二烷基硫酸鈉水溶液極性陽性對(duì)照樣品，記為PCa；使用芝麻油在相同方法下制備體積分?jǐn)?shù)為1%的非極性陽性對(duì)照樣品，記為PCb。

2.2 體外RhE試驗(yàn)方法

2.2.1 體外RhE模型預(yù)孵育

樣品制備完成前1 d，接收體外RhE模型。在無菌條件下，取出盛有表皮組織的小室，用吸水紙小心除去黏附在小室外側(cè)緣的殘留瓊脂，將小室置于預(yù)先加入1 mL配套培養(yǎng)基的6孔板中，再將6孔板置于（37±1）℃、（5±1）%CO2、相對(duì)濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。

2.2.2 加樣

將孵育后的小室轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入1 mL培養(yǎng)基的6孔板中，吸取100μL試驗(yàn)樣品或?qū)φ諛悠犯采w小室中表皮組織表面（每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)），確保完全接觸。加樣完成后，將6孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育（24±2）h。

2.2.3 沖洗

孵育后，使用無菌杜氏磷酸鹽緩沖溶液沖洗小室內(nèi)的表皮組織25次，去除殘留樣品。沖洗后排干小室內(nèi)水分，轉(zhuǎn)移小室至預(yù)先加入培養(yǎng)基的24孔板（0.3 mL/孔）中，準(zhǔn)備進(jìn)行噻唑蘭孵育。

2.2.4 噻唑蘭測(cè)定組織活性

用培養(yǎng)基將5 mg/mL的噻唑蘭母液稀釋至1 mg/mL。取24孔板，每孔加入300μL的噻唑蘭工作液。從24孔板中移出小室，拭干小室底部，然后轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入噻唑蘭的24孔板中，再將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h±5 min。孵育后，吸干小室內(nèi)及底部殘留的噻唑蘭溶液，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入750μL異丙醇的24孔板中，并密封24孔板防止蒸發(fā)。用水平搖床于120 r/min、室溫條件下輕輕振蕩萃取甲臜2 h±5 min。孵育后，充分混勻萃取液，取200μL萃取液至平底96孔板中（設(shè)3個(gè)復(fù)孔）。將異丙醇溶液作為空白對(duì)照，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀選擇570 nm波長濾光片讀取光密度（optical density，OD）。

2.2.5 數(shù)據(jù)計(jì)算

計(jì)算6個(gè)空白對(duì)照孔OD的均值，其余各孔OD均扣除空白均值得到修正OD值，計(jì)算每塊組織3個(gè)修正OD的均值。將NC樣品接觸的3塊組織的均值設(shè)為100%活性，每塊組織修正OD的均值除以3塊組織OD的均值可以得到每塊組織的相對(duì)活性，計(jì)算各樣品接觸的3塊組織的相對(duì)活性均值作為各樣品接觸的組織的相對(duì)活性。

2.2.6 試驗(yàn)接受準(zhǔn)則

NC樣品和VC樣品：3塊組織OD的均值≥0.8～＜2.8；3塊組織相對(duì)活性的標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）≤20%；VC樣品接觸的組織的相對(duì)活性為80%～120%。PC樣品：相對(duì)活性＜40%；3塊組織相對(duì)活性的SD≤20%。試驗(yàn)樣品：3塊組織相對(duì)活性的SD≤20%。

2.2.7 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

試驗(yàn)樣品接觸的組織相對(duì)活性≤50%即表示刺激反應(yīng)陽性。醫(yī)療器械/材料的2種浸提液中至少一種顯示陽性結(jié)果（相對(duì)活性≤50%且SD≤20%），則認(rèn)為此醫(yī)療器械/材料有皮膚刺激性（陽性）。

2.3 體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)

2.3.1 動(dòng)物準(zhǔn)備

試驗(yàn)前24 h，除去新西蘭白兔背部脊柱兩側(cè)被毛（約10 cm×15 cm的區(qū)域），用作試驗(yàn)和觀察部位。每個(gè)試驗(yàn)樣品、每種介質(zhì)浸提液使用3只動(dòng)物。本動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.3.2 試驗(yàn)樣品的應(yīng)用

將500μL試驗(yàn)樣品或相應(yīng)介質(zhì)對(duì)照樣品滴到2.5 cm×2.5 cm紗布?jí)K上。在動(dòng)物背部左上和右下部位放置試驗(yàn)樣品紗布，右上和左下部位放置對(duì)照樣品紗布。用繃帶覆蓋敷貼部位至少4 h。接觸期結(jié)束后取下紗布，用溫水清洗除去殘留試驗(yàn)樣品或?qū)φ諛悠凡⑿⌒氖酶?，同時(shí)標(biāo)記接觸部位。

2.3.3 結(jié)果觀察

在除去敷貼片后（1±0.1）、（24±2）、（48±2）和（72±2）h，根據(jù)皮膚反應(yīng)記分系統(tǒng)記分，詳見表1。

表1 皮膚反應(yīng)記分系統(tǒng)記分細(xì)則

2.3.4 結(jié)果評(píng)價(jià)

分別將每只動(dòng)物試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品接觸部位在（24±2）、（48±2）和（72±2）h的全部紅斑和水腫情況的記分相加，將記分之和除以6（2個(gè)試驗(yàn)/觀察部位，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)），計(jì)算出某一動(dòng)物的原發(fā)性刺激記分。將3只動(dòng)物原發(fā)性刺激記分相加后除以3得出試驗(yàn)樣品或?qū)φ諛悠返脑l(fā)性刺激記分。將試驗(yàn)樣品原發(fā)性刺激記分減去對(duì)照樣品原發(fā)性刺激記分，即得出試驗(yàn)樣品原發(fā)性刺激指數(shù)。刺激指數(shù)為0～0.4，反應(yīng)分級(jí)為極輕微；刺激指數(shù)為0.5～1.9，反應(yīng)分級(jí)為輕度；刺激指數(shù)為2.0～4.9，反應(yīng)分級(jí)為中度；刺激指數(shù)為5.0～8.0，反應(yīng)分級(jí)為重度。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外RhE試驗(yàn)

NC樣品和VC樣品接觸的3塊組織OD的均值≥0.8～＜2.8；VCa樣品和VCb樣品接觸的組織相對(duì)活性為80%～120%；PCa和PCb樣品接觸的組織相對(duì)活性＜40%；陰、陽性對(duì)照樣品及試驗(yàn)樣品接觸的3塊組織相對(duì)活性的SD均＜20%。數(shù)據(jù)符合試驗(yàn)接受準(zhǔn)則，試驗(yàn)成立。T1a、T1b和T2a接觸的組織相對(duì)活性均＞50%，表明均無皮膚刺激性（陰性）；T2b接觸的組織相對(duì)活性＜50%，表明有皮膚刺激性（陽性）。體外RhE試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 體外RhE試驗(yàn)結(jié)果

3.2 體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)

每只動(dòng)物試驗(yàn)樣品位點(diǎn)在（24±2）、（48±2）和（72±2）h的紅斑和水腫情況記分均為0，每只動(dòng)物對(duì)照位點(diǎn)在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的紅斑和水腫情況記分也均為0，可計(jì)算出各試驗(yàn)樣品原發(fā)性刺激指數(shù)均為0，對(duì)應(yīng)反應(yīng)分級(jí)均為極輕微（陰性），詳見表2。去除敷貼片（24±2）h后各樣品試驗(yàn)位點(diǎn)及相應(yīng)對(duì)照位點(diǎn)皮膚表現(xiàn)如圖2所示。

表2 體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

圖2 去除敷貼片（24±2）h后各樣品試驗(yàn)位點(diǎn)及相應(yīng)對(duì)照位點(diǎn)皮膚表現(xiàn)

4 討論

本研究分別采用體外RhE試驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)一種典型醫(yī)療器械及一種陽性物質(zhì)的皮膚刺激反應(yīng)，探討體外RhE試驗(yàn)應(yīng)用于醫(yī)療器械皮膚刺激性檢測(cè)的可行性。體外RhE試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)樣品T1a、T1b和T2a均無皮膚刺激性（陰性），而T2b有皮膚刺激性（陽性）。體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，各試驗(yàn)樣品的皮膚刺激性均為陰性（極輕微）。這表明體外RhE試驗(yàn)相較于體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)更敏感。以往研究結(jié)果顯示，4%的乳酸溶液在人體斑貼試驗(yàn)中顯示為皮膚刺激物[6，13-14]，與本研究中體外RhE試驗(yàn)結(jié)果是一致的。眾所周知，人體試驗(yàn)的結(jié)果最為客觀，2種試驗(yàn)方法結(jié)果的一致性表明體外RhE試驗(yàn)?zāi)軌蚋訙?zhǔn)確地反映試驗(yàn)樣品對(duì)人體皮膚產(chǎn)生的刺激性。

綜合試驗(yàn)過程與結(jié)果，與體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)相比，采用體外RhE試驗(yàn)檢測(cè)醫(yī)療器械皮膚刺激性具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）不使用家兔等動(dòng)物，符合替代、減少、優(yōu)化的3R原則；（2）體外RhE模型是人源三維皮膚模型，與人無種屬差異，而且具有皮膚組織結(jié)構(gòu)，能最大程度地模擬人體反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果能更準(zhǔn)確客觀地反映人體實(shí)際情況；（3）體外RhE模型間差異小，與動(dòng)物個(gè)體差異較大不同，其結(jié)果更穩(wěn)定；（4）對(duì)試驗(yàn)設(shè)施及設(shè)備要求不高，易于滿足，相較于體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，省去了動(dòng)物房設(shè)施運(yùn)行及動(dòng)物飼喂等人力、物力等資源的消耗；（5）試驗(yàn)步驟操作簡便、易于掌握，適用于醫(yī)療器械浸提液的檢測(cè)；（6）為半定量試驗(yàn)，結(jié)果顯示為數(shù)值，相較于體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)通過肉眼觀察進(jìn)行記分判斷更為客觀和準(zhǔn)確。

經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織試驗(yàn)導(dǎo)則439（Organization for Economic Cooperation and Development Test Guideline 439，OECD TG 439）中收錄了6種體外RhE模型，這些模型均已通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明其能夠有效區(qū)分多種已知的典型刺激及非刺激化學(xué)物。近年來，經(jīng)驗(yàn)證與調(diào)整，這類模型也被用來檢測(cè)醫(yī)療器械的皮膚刺激性[5，7-11]。其中，EpiDermTM（EPI-200）和SkinEthicTMRHE 2種模型已被列入最新發(fā)布的ISO 10993-23：2021醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)刺激試驗(yàn)中。這2種模型分別是美國MatTek公司和法國EpiSkin公司研發(fā)的同類產(chǎn)品。在一項(xiàng)大型國際比對(duì)試驗(yàn)中，使用醫(yī)療器械浸提液對(duì)EpiDermTM（EPI-200）模型和SkinEthicTMRHE模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明2種模型均能正確識(shí)別幾乎所有的刺激聚合物樣品，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異性及實(shí)驗(yàn)室間變異性均等同[7]。因此，根據(jù)逐步評(píng)價(jià)的基本原則，最新國際標(biāo)準(zhǔn)中要求首先采用化學(xué)表征、文獻(xiàn)檢索的方法對(duì)試驗(yàn)材料的刺激性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。若無法實(shí)現(xiàn)，則采用體外RhE試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估[3]。當(dāng)不能采用以上方法獲取的信息進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，才考慮進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)[3]，這就為體外RhE試驗(yàn)替代體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)奠定了標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)。隨著相關(guān)條件的不斷成熟，此國際標(biāo)準(zhǔn)未來將被轉(zhuǎn)化為我國的國家標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用的SkinEthicTMRHE模型產(chǎn)地在上海，采用保溫措施通過郵寄可在1～2 d內(nèi)送達(dá)國內(nèi)大多數(shù)城市，該模型易于獲取且運(yùn)輸過程不會(huì)對(duì)模型質(zhì)量產(chǎn)生影響。據(jù)了解，國內(nèi)也有多家企業(yè)正在或已經(jīng)研發(fā)出此類體外RhE模型，在通過相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)后[3-4，15]，也可用于醫(yī)療器械皮膚刺激性檢測(cè)。

本研究尚存在以下不足：研究僅限于現(xiàn)象描述，未涉及機(jī)制研究，下一步將深入探討醫(yī)療器械體外RhE試驗(yàn)皮膚刺激反應(yīng)的分子機(jī)制。

總之，本研究表明體外RhE試驗(yàn)?zāi)軕?yīng)用于醫(yī)療器械皮膚刺激性檢測(cè)，且相較于體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)有更多優(yōu)勢(shì)。隨著國內(nèi)相關(guān)條件的不斷成熟，體外RhE試驗(yàn)有望在不遠(yuǎn)的將來替代體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)。