劉政海，董志剛，李曉梅，譚敏，楊镕兆，賀晉瑜，趙旗峰

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所,山西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,山西 太原, 030031)

葡萄(Vitisvinifera)為多年生藤蔓植物，在我國有著悠久的葡萄種植歷史[1]，近幾年，我國從國外引進(jìn)大量優(yōu)良釀酒品種，但所有的品種，尤其是具有古老起源的品種會出現(xiàn)品種退化的現(xiàn)象，無性系選種是指在無性繁殖的果樹群體中，為了維持、提升品種原先具有的優(yōu)良形狀對優(yōu)良植株進(jìn)行選取、繁育的工作[2]。PAGLARANI等[3]從35株葡萄中根據(jù)產(chǎn)量、串重、果實(shí)重、含糖量等指標(biāo)，鑒定出最具發(fā)展?jié)摿Φ?4株?duì)I養(yǎng)系。以湖南省懷化縣的商品葡萄園4個紅色無性系和2個白色無性系為例，研究發(fā)現(xiàn)高山4號和白葡萄1號無性系中C6和C9揮發(fā)物含量最高[4]。釀酒葡萄品質(zhì)主要取決于葡萄品種及相應(yīng)的生態(tài)條件[5]。營養(yǎng)系選種是品種選育的有效方法，與常規(guī)育種方法相比具有成本低、見效快等優(yōu)點(diǎn)[2]。酚類物質(zhì)是葡萄酒最重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，且具有生物活性功能[6]。果實(shí)的酚類物質(zhì)組成和含量受生長條件、品種和果實(shí)成熟度等多種因素影響，但品種的基因型對其影響超越任何環(huán)境因素[7]。任瑞華等[8]以雷司令和小芒森為材料，發(fā)現(xiàn)高果皮百分比、較小果粒及果實(shí)糖含量高有益于葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)的積存。香氣是衡量葡萄果實(shí)和葡萄酒感官品質(zhì)的重要指標(biāo)，葡萄果實(shí)可揮發(fā)性狀態(tài)的香氣主要包括醛、芳香化合物、萜、酯類等，共同作用下形成葡萄酒最終的香氣。

霞多麗(Chardonnay)別名雪當(dāng)利、莎當(dāng)妮等，歐亞種，原產(chǎn)于法國勃艮第，是世界著名的釀造白葡萄酒的優(yōu)良品種。在許多國家都有栽培，自1979年從法國引進(jìn)中國，近幾年霞多麗在山西、山東、河北、內(nèi)蒙古、新疆等省栽培面積逐漸增加，栽培適宜當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)氣候條件的營養(yǎng)系決定著當(dāng)?shù)仄咸丫频钠焚|(zhì)和風(fēng)格，國內(nèi)外關(guān)于霞多麗葡萄酒品質(zhì)的研究較多[9-10]，對霞多麗不同營養(yǎng)系的成熟果實(shí)香氣以及果實(shí)不同部位在生長發(fā)育階段的酚類物質(zhì)研究甚少。本試驗(yàn)以霞多麗4個營養(yǎng)系果實(shí)為試驗(yàn)材料，對各個營養(yǎng)系的成熟果實(shí)的香氣物質(zhì)的種類、含量、香氣活性值以及不同生長發(fā)育階段的酚類物質(zhì)含量進(jìn)行比較分析，以期選育出適宜黃土高原地區(qū)栽培的最優(yōu)霞多麗葡萄營養(yǎng)系，為釀酒葡萄育種材料選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

以霞多麗4個營養(yǎng)系霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96、霞多麗277為材料，引種于中法莊園，定植于2010年，以株行距0.8 m×2.5 m種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所釀酒葡萄采穗圃[N37.34°，E112.49°，海拔(846±5) m]，常規(guī)栽培管理，該地區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均溫10.6 ℃，160～180 d的無霜期，均為傾斜式單龍蔓“廠”字形立架栽培。霞多麗葡萄果實(shí)分別于盛花后40 d(2020年7月3日)、60 d(2020年7月23日)、80 d(2020年8月12日)、100 d(2020年9月1日)、110 d(達(dá)到生產(chǎn)成熟)進(jìn)行采樣。

氫氧化鈉、正丁醇、碳酸鈉、氯化鉀、甲醇、醋酸鈉、氯化鋁、乙醇、亞硝酸鈉等，均為分析純；4-甲基-2-戊醇、乙醇、單寧酸、兒茶素，均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)萃取頭(PDMS/CARDVB)，北京華爾博科技有限責(zé)任公司；7890-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱，美國安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 果實(shí)性狀調(diào)查

參照《葡萄種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》對4個營養(yǎng)系成熟果實(shí)基本品質(zhì)性狀的鑒定。

1.3.2 酚類物質(zhì)含量的測定

采用Folin酚法測定總酚、單寧含量，用單寧酸等價表示(mg/g FW)；總類黃酮含量測定采用氯化鋁比色法，根據(jù)兒茶素(0～100 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總類黃酮含量；采用香草醛-鹽酸法測定黃烷醇，結(jié)果以兒茶素等價表示(mg/g FW)[11]。

1.3.3 果實(shí)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定

1.3.3.1 揮發(fā)性香氣物質(zhì)提取

將葡萄果實(shí)放進(jìn)研缽內(nèi)并且加入液氮，用研磨杵輕微敲碎葡萄使葡萄果實(shí)各部分分離，除去種子、果蒂，取50 g果肉并且往里面加1 g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，在液氮作用下，通過冷凍研磨機(jī)將果肉磨成粉末狀，將其裝入50 mL離心管中，靜置在4 ℃冰箱內(nèi)12 h，每個重復(fù)裝2管，離心轉(zhuǎn)速為10 000 r/min條件下進(jìn)行15 min，離心2次得到澄清葡萄汁液。

1.3.3.2 SPME及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph- mass spectrometer，GC-MS)條件

在樣品瓶中放入澄清葡萄汁液5 mL，加入1 g NaCl、磁力轉(zhuǎn)子和10 μL(4-甲基-2-戊醇)內(nèi)標(biāo)后，蓋上樣品蓋子并且立刻將其放到磁力攪拌加熱臺上，在40 ℃ 條件下保持30 min后，將活化好的SPME萃取頭插入樣品瓶上部，在40 ℃下吸附30 min后，立即將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，在250 ℃溫度下解析8 min。

GC-MS條件：毛細(xì)管柱為60 mm×0.25 mm×0.25 μm，高純氦氣為其載氣，流速為1 mL/min，手動進(jìn)樣不分流；程序升溫為50 ℃下1 min后，以3 ℃/min的速度升溫到220 ℃并保持5 min；質(zhì)譜接口溫度為 280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離的方式為EI，電離能為70 eV，掃描范圍為20～350 u。

1.3.3.3 香氣物質(zhì)定性和定量

香氣物質(zhì)定性：根據(jù)GC-MS分離得到的質(zhì)譜全離子掃描圖譜，將與標(biāo)樣一樣的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性。對于沒有標(biāo)樣的香氣物質(zhì)，將其與己有文獻(xiàn)相似圖譜進(jìn)行比對，還可使用計(jì)算機(jī)檢索NIST 11標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)行半定性。

香氣物質(zhì)定量：根據(jù)葡萄的揮發(fā)性香氣濃度高低，用目標(biāo)香氣的標(biāo)準(zhǔn)品制備香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對果實(shí)中相應(yīng)香氣物質(zhì)進(jìn)行定量，如果香氣物質(zhì)沒有標(biāo)樣，可以根據(jù)與香氣化合物碳原子數(shù)接近的或者化學(xué)結(jié)構(gòu)接近的標(biāo)樣進(jìn)行半定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019、SAS 9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 霞多麗葡萄營養(yǎng)系果實(shí)基本品質(zhì)比較

霞多麗葡萄4個營養(yǎng)系成熟果實(shí)基本品質(zhì)如表1所示，霞多麗95平均穗重、果穗長寬均顯著高于霞多麗76(P<0.05)；4個營養(yǎng)系果梗長無顯著差異。霞多麗277可溶性固形物分別比霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96高15.73%(P<0.05)、10.81%(P<0.05)、14.12%(P<0.05)；霞多麗76固酸比、果形指數(shù)顯著高于其他3個營養(yǎng)系；霞多麗277皮肉比為0.23，顯著高于其他3個營養(yǎng)系；霞多麗葡萄4個營養(yǎng)系百粒重為2.45～3.00 g，其中霞多麗76的種子百粒重顯著高于霞多麗95和霞多麗277(P<0.05)；霞多麗96的pH值顯著低于其他3個營養(yǎng)系。

表1 霞多麗葡萄4個營養(yǎng)系果實(shí)基本品質(zhì)Table 1 Basic quality of Chardonnay grape fruit from four clones

2.2 霞多麗葡萄營養(yǎng)系果實(shí)酚類物質(zhì)比較

2.2.1 霞多麗葡萄營養(yǎng)系果皮和果肉中單寧含量比較

霞多麗4個營養(yǎng)系盛花后不同時期果皮中單寧含量如圖1-A所示。單寧含量從盛花后40 d至果實(shí)成熟期呈先下降又上升的趨勢，盛花后40 d時，霞多麗96果皮中單寧含量為14.23 mg/g，顯著高于其他3個營養(yǎng)系；霞多麗96果皮中單寧含量在5個發(fā)育期含量均較高，在果實(shí)成熟期霞多麗96果皮中單寧含量顯著高于霞多麗76和霞多麗95。

霞多麗4個營養(yǎng)系果肉中單寧含量如圖1-B所示。4個營養(yǎng)系果肉中單寧含量呈先下降后上升的趨勢，在盛花后40 d時，霞多麗277果肉中單寧含量為5.41 mg/g，顯著高于其他3個營養(yǎng)系，霞多麗277在盛花后60、80 d時下降幅度較大，但在果實(shí)完全成熟時霞多麗277果肉中單寧含量顯著高于霞多麗76和95。霞多麗95在盛花后100 d，果肉單寧含量為2.24 mg/g，分別比霞多麗76、霞多麗96、霞多麗277高33.89%(P<0.05)、204.70%(P<0.05)、48.21%(P<0.05)。霞多麗96果肉中單寧在盛花后60 d、盛花后80 d、果實(shí)成熟期含量分別為5.39、2.62、3.21 mg/g，顯著高于其他3個營養(yǎng)系。

2.2.2 霞多麗葡萄營養(yǎng)系果皮和果肉中總類黃酮含量含量比較

如圖2-A所示，為霞多麗葡萄營養(yǎng)系盛花后不同時期果皮中總類黃酮含量，其中從盛花后40 d起果皮中總類黃酮含量逐漸下降而后又上升的趨勢。霞多麗4個營養(yǎng)系果皮中總類黃酮含量在各時期差異基本一致，其中霞多麗96果皮中總類黃酮含量在盛花后40 d、盛花后60 d、盛花后80 d、盛花后100 d和果實(shí)成熟期的含量均顯著高于其他3個營養(yǎng)系。

由圖2-B中霞多麗4個營養(yǎng)系果肉中總類黃酮含量可知，總類黃酮含量從盛花后40 d至果實(shí)成熟期總體呈下降趨勢。其中霞多麗96果肉中總類黃酮含量在盛花后60 d以及盛花80 d含量分別為0.18、0.13 mg/g，均顯著高于其他3個營養(yǎng)系。在盛花后40 d和果實(shí)成熟期，霞多麗277果肉中總類黃酮含量分別為0.26、0.09 mg/g，均顯著高于其他3個營養(yǎng)系。

2.2.3 霞多麗葡萄營養(yǎng)系果皮和果肉中黃烷醇含量比較

霞多麗4個營養(yǎng)系盛花后不同時期果皮中黃烷醇含量如圖3-A所示，在霞多麗葡萄在成熟的過程中黃烷醇含量先下降后上升，在盛花后60 d，霞多麗96果皮中黃烷醇含量為11.09 mg/g，顯著高于霞多麗95和霞多麗277。霞多麗96果皮中黃烷醇含量在盛花后40、80、100 d及果實(shí)成熟期顯著高于其他3個營養(yǎng)系。

A-果皮；B-果肉圖1 霞多麗葡萄營養(yǎng)系盛花后不同時期果皮和 果肉中單寧含量Fig.1 Skins and flesh tannin content in clones of Chardonnay grape at different periods注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

A-果皮；B-果肉圖2 霞多麗葡萄營養(yǎng)系盛花后不同時期果皮和 果肉中總類黃酮含量Fig.2 Skins and flesh total flavonoids content in clones of Chardonnay grape at different periods

霞多麗4個營養(yǎng)系不同時期果肉中黃烷醇含量如圖3-B所示，霞多麗4個營養(yǎng)系在盛花后40 d時，果肉中黃烷醇含量較高，在盛花后80～100 d時果肉中黃烷醇含量降到最低，在果實(shí)成熟期，霞多麗277果肉中黃烷醇含量為0.26 mg/g，分別比霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96高73.83%(P<0.05)、171.47%(P<0.05)、35.38%(P<0.05)。

A-果皮；B-果肉圖3 霞多麗葡萄營養(yǎng)系不同時期果皮、果肉中黃烷醇含量Fig.3 Skins and flesh flavanols content in clones of Chardonnay grape at different periods

2.3 霞多麗葡萄營養(yǎng)系果實(shí)中香氣比較

2.3.1 霞多麗葡萄營養(yǎng)系成熟果實(shí)中香氣物質(zhì)種類

霞多麗葡萄營養(yǎng)系成熟期果實(shí)中香氣種類數(shù)如表2所示，霞多麗4個營養(yǎng)系共檢測到96種香氣化合物，其中在霞多麗76果實(shí)中檢測到香氣種類最多，為95種。酯類物質(zhì)主要是呈現(xiàn)果香味，具有使葡萄酒中各種香氣物質(zhì)的平衡、融洽、協(xié)調(diào)的狀態(tài)的功能，酯類香氣物質(zhì)在4個營養(yǎng)系果實(shí)中香氣種類最多，其中霞多麗76果實(shí)中酯類香氣種類最多為35種。萜烯類和降異戊二烯類大多具有怡人的果香、花香，是葡萄酒中品種香的主要組分，其對葡萄酒的香氣有著很大的奉獻(xiàn)，霞多麗76果實(shí)中萜烯及降異戊二烯類物質(zhì)物質(zhì)有17種。

表2 霞多麗葡萄營養(yǎng)系成熟期果實(shí)中香氣種類數(shù)Table 2 Number of aroma species in grape clones of Chardonnay at mature stage

2.3.2 霞多麗營養(yǎng)系成熟期果實(shí)不同香型香氣活力值(ordor active values，OAVs)比較

圖4所示為霞多麗4個營養(yǎng)系果實(shí)中各香氣類別的OAVs，OAV是香氣成分含量與嗅覺閾值的比值，霞多麗76水果香OAVs為10.72，分別比霞多麗95、霞多麗96和霞多麗277高78.71%(P<0.05)、74.04%(P<0.05)、76.56%(P<0.05)。霞多麗76果實(shí)中花香值OAVs為28.39，顯著高于其他3個營養(yǎng)系果實(shí)中花香OAVs(P<0.05)。霞多麗4個營養(yǎng)系果實(shí)中植物香和脂肪香差異不顯著，4個營養(yǎng)系植物香OAVs值均在26以上，而4個營養(yǎng)系脂肪香OAVs均低于2。

A-果皮；B-果肉圖4 霞多麗營養(yǎng)系成熟期果實(shí)中不同香氣類型香氣活力值Fig.4 Odor active values of different aroma types in Chardonnay clones at mature stage

3 討論

釀酒葡萄果實(shí)的基本品質(zhì)、酚類物質(zhì)、香氣物質(zhì)等指標(biāo)決定釀造葡萄酒的好壞。魏烈權(quán)等[12]通過測定葡萄果實(shí)中可溶性糖含量、可滴定酸含量、總酚含量、單寧含量等9項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)評價嘉峪關(guān)10個釀酒葡萄品種，測出黑比諾、佳美、美樂這3個品種在嘉峪關(guān)地區(qū)品質(zhì)優(yōu)于其他品種。譚偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)白色品種小白玫瑰455在果實(shí)中種果皮的單寧含量高于果肉的單寧含量，這與霞多麗4個營養(yǎng)系在果皮中酚類物質(zhì)高于果肉中酚類物質(zhì)含量結(jié)論相符。不同發(fā)育時期，果實(shí)中單寧含量差異明顯[14]，霞多麗4個營養(yǎng)系果皮和果肉中單寧含量呈先下降后升高的趨勢，在后期形成更多的縮合單寧，霞多麗96和霞多麗277在果實(shí)完全成熟時單寧含量最高，含有不同聚體的單寧分子多，使得釀造的葡萄酒苦澀感更豐富。釀酒葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)含量受品種、環(huán)境等因素影響，品種是其影響果實(shí)中酚類物質(zhì)的主要內(nèi)在因素[15]。張娟等[6]以多種紅色釀酒品種為試材分析了酚類物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)不同品種間果實(shí)中酚類物質(zhì)含量差異顯著，其中葡萄皮中總酚含量為12～125 mg/100g，果肉中總酚含量為1.24～3.24 mg/100g。本研究表明霞多麗4個營養(yǎng)系果實(shí)酚類物質(zhì)含量存在顯著差異。代紅軍等[16]研究水楊酸對赤霞珠葡萄白藜蘆醇、總類黃酮含量影響，研究表明，赤霞珠葡萄果皮中總類黃酮含量在幼果期和完熟期較高。本研究中霞多麗4個營養(yǎng)系果皮中總類黃酮含量在盛花后40 d和果實(shí)成熟期含量較高結(jié)論相似。胡麗等[17]在歐亞種和山歐雜種中檢測到12種黃酮醇物質(zhì)，在雙豐葡萄中只檢測到4種黃酮醇物質(zhì)，不同品種品系間黃酮醇種類和含量有明顯差異，霞多麗96果皮中和霞多麗277果肉中總類黃酮含量顯著最高，可能存在黃酮種類高于其他2個營養(yǎng)系。溫鵬飛等[18]以赤霞珠為試材研究土壤干旱對釀酒葡萄果肉中黃烷醇類多酚含量的影響，研究發(fā)現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育過程中果肉中黃烷醇類多酚的積累模式并未受土壤干旱的影響而改變，并且在果實(shí)發(fā)育過程中黃烷醇類多酚的積累為幼果期含量最高，隨著果實(shí)的發(fā)育而逐漸下降，在果實(shí)成熟期時略有回升。這與本實(shí)驗(yàn)霞多麗葡萄4個營養(yǎng)系在盛花后果肉中黃烷醇含量逐漸下降又有回升的研究結(jié)果基本一致。

同一產(chǎn)地釀酒葡萄品種不同，香氣組成的種類、含量及比例均存在明顯差異。秦歡等[19]以重慶3個白葡萄品種成熟果實(shí)研究材料，研究發(fā)現(xiàn)不同品種白葡萄果實(shí)香氣成分及含量、種類差異明顯。ROCHA等[20]以4種白葡萄品種為試材通過檢測分析，發(fā)現(xiàn)不同品種間關(guān)于香氣物質(zhì)的濃度和種類有顯著差異。香氣物質(zhì)的濃度和種類不同使得霞多麗4個營養(yǎng)系同一類香氣OAV不同，從而導(dǎo)致其香氣特征的差異。以意大利釀酒葡萄品種果實(shí)為材料，分析果實(shí)酚類物質(zhì)含量和揮發(fā)性香氣成分，研究發(fā)現(xiàn)7個品種果實(shí)干果香、脂肪味/奶油味、烘烤味、橡木味和香料味OAV均低于1[21]，這與本實(shí)驗(yàn)中霞多麗4個營養(yǎng)系脂肪香含量較低研究結(jié)果相似。

在果實(shí)成熟期，霞多麗96在果皮中單寧、總類黃酮、黃烷醇的含量優(yōu)于其他營養(yǎng)系。霞多麗96果肉中單寧優(yōu)于其他營養(yǎng)系。在霞多麗葡萄4個營養(yǎng)系中共測得96種揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類，其中霞多麗76醇類物質(zhì)種類最多，且是檢測到的香氣種類最為豐富的營養(yǎng)系。霞多麗76營養(yǎng)系的水果香、花香OAVs均顯著高于其他3個營養(yǎng)系。在黃土高區(qū)產(chǎn)區(qū)，霞多麗96和霞多麗277可作為高酚類物質(zhì)含量的霞多麗營養(yǎng)系，霞多麗76可作為具有豐富香氣物質(zhì)種類和含量的營養(yǎng)系進(jìn)行栽培。