劉銳鋒， 盛倩倩， 張 悅， 趙慧強(qiáng)

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050）

冠狀動(dòng)脈（冠脈）擴(kuò)張（coronary artery ectasia,CAE）定義為冠脈直徑超過(guò)正?；蛘呦噜弰?dòng)脈段直徑的1.5倍以上[1]。大多數(shù)CAE病例是通過(guò)冠脈造影等影像學(xué)檢查診斷。接受冠脈造影評(píng)估的患者有1.2%～7.4%被診斷為CAE[2]。超過(guò)90%的CAE患者合并有冠心病（coronary heart disease，CHD），表現(xiàn)為冠脈粥樣硬化改變，包括斑塊負(fù)荷、脂質(zhì)沉積和冠脈中層膽固醇結(jié)晶[1,3]。CAE的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為CAE是一種炎癥性疾病，因?yàn)镃AE患者表現(xiàn)為外周血細(xì)胞炎癥因子失衡和冠脈壁大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[3-5]。此外CAE患者冠脈中間層的平滑肌和彈性纖維層有明顯的破壞，這種改變與免疫系統(tǒng)紊亂相關(guān)血管炎的病理變化相似[1]。因此，了解CAE是否伴隨免疫系統(tǒng)紊亂很重要，關(guān)系到CAE患者的病因探討和是否可能應(yīng)用免疫相關(guān)治療。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)CAE患者的外周淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞亞型來(lái)初步回答，CAE是否同時(shí)存在炎癥和免疫系統(tǒng)異常。外周血淋巴細(xì)胞分為以下亞型：T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD19+）和自然殺傷（natural killer，NK）淋巴細(xì)胞（CD3-CD16+和CD56+或CD56+）；T細(xì)胞進(jìn)一步分為輔助性T細(xì)胞2群（CD3+CD4+）和輔助性T細(xì)胞1群（CD3+CD8+）[6]。根據(jù)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）共受體（CD14）和FcγRⅢ受體（CD16）的表達(dá)，單核細(xì)胞被分為經(jīng)典型（CD14++CD16-）、中間型（CD14++CD16+）和非經(jīng)典型（CD14+CD16++）3種亞型[7]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)進(jìn)行檢測(cè)和分類。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

2017年1月至2018年1月，共有2 506例患者在北京友誼醫(yī)院心導(dǎo)管中心接受冠脈造影檢查，56例（2.23%）確診患有CAE。連續(xù)12個(gè)月，按照每例CAE患者接受冠脈造影和確診的日期，采用抽簽法隨機(jī)選擇在同一日期內(nèi)接受冠脈造影的CHD患者和冠脈相對(duì)正常的受試者（對(duì)照），保持年齡、性別、高血壓、吸煙史、血脂、飲酒、肝功能、腎功能等基線資料基本平衡。本研究根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)初步納入其中34例CAE患者，同日期與之匹配的有30例CHD患者和32例對(duì)照人群。冠脈造影結(jié)束后，立即采集外周血液并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。該研究經(jīng)北京友誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》進(jìn)行，已獲得了所有參與者的知情同意。對(duì)CAE、CHD和對(duì)照組之間的基線數(shù)據(jù)、關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和冠脈造影特征進(jìn)行全面的比較和分析。

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：CAE被定義為冠脈直徑超過(guò)相鄰的正常冠脈段的1.5倍[1]。根據(jù)目前的共識(shí)，CHD被定義為1個(gè)或多個(gè)主要冠脈存在≥50%狹窄，將狹窄≤20%且無(wú)其他冠脈異常的受試者作為對(duì)照[8]。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：懷孕或患有急性冠脈綜合征、心肌病、心肌炎、瓣膜心臟病、心力衰竭、其他血管動(dòng)脈瘤、此前確診為膠原組織疾病和血管炎疾病、梅毒、明確診斷的肺栓塞和主動(dòng)脈夾層、嚴(yán)重的肝功能或腎功能障礙、凝血功能障礙、活動(dòng)性出血、惡性腫瘤、傳染病、既往感染史（＜3個(gè)月）及其他炎癥性疾病或治療遵從性較差者。

二、方法

1.基本的臨床特征：研究對(duì)象的醫(yī)療記錄和冠脈造影數(shù)據(jù)資料完整而詳細(xì)。大多數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)自病歷和導(dǎo)管室數(shù)據(jù)庫(kù)，包括人口學(xué)數(shù)據(jù)（如年齡和性別）、既往病史（如高血壓和糖尿病）、家族史和個(gè)人史（如吸煙、飲酒）。體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）=體重/身高的平方（kg/m2）。

2.生化指標(biāo)：患者入院后次日上午行靜脈采血。北京友誼醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)所有受試者的血樣進(jìn)行分析，包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油 （triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、高敏C反 應(yīng) 蛋 白 （high-sensitivity C-reaction protein,hs-CRP）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、總膽紅素和間接膽紅素（據(jù)報(bào)道可以作為抗氧化因子參與炎癥反應(yīng)過(guò)程[9-10]）。

3.淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞亞型的流式細(xì)胞學(xué)分析：以下抗人單克隆抗體（monoclonal antibody，MoAb）（購(gòu)自美國(guó)加州圣地亞哥BioLegend公司）用于流式細(xì)胞學(xué)分析。PE抗人CD3抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）抗人CD4抗體、PerCP抗人CD8α抗體、PerCPCy55抗 人CD16抗體、抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）抗人CD19抗體和FITC抗人CD14抗體。冠脈造影后立即用肝素鈉抗凝血?jiǎng)┎杉庵苎?，并在采集? h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞分析：將100 μL的全血樣本與用上述抗體在室溫中染色30 min。加入2 mL 1×熒光激活細(xì)胞分選儀（fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）溶解液（BD生物科學(xué)公司），將混合物輕輕旋轉(zhuǎn)，然后在黑暗中孵化10 min，使紅細(xì)胞溶解。將白細(xì)胞離心分離，并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌，然后懸浮在500 μL PBS中進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。用FACS Jazz細(xì)胞計(jì)對(duì)樣本進(jìn)行分析（BD生物科學(xué)），使用FACS軟件（BD生物科學(xué)）操作。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群根據(jù)向前和側(cè)散射特性進(jìn)行門控，使用FlowJo軟件（美國(guó)）對(duì)流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[7,11]。

4.冠脈成像特征：通過(guò)穿刺橈動(dòng)脈或者股動(dòng)脈行冠脈造影，不使用腺苷或鈣通道阻滯劑。冠脈主要分為：左主干、左前降冠脈、左回旋支，右冠脈。冠脈血流情況[心肌梗死溶栓治療（thrombolysis in myocardial infarction，TIMI）幀數(shù)計(jì)數(shù)（TIMI frame count,TFC）][12]，狹窄程度（Genisi評(píng)分確定）[13]，以及擴(kuò)張程度，由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的心臟專家閱片確定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS 25.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)最初都通過(guò)科爾莫戈羅夫-斯米爾諾夫測(cè)試進(jìn)行分析，以評(píng)估其正態(tài)性。連續(xù)數(shù)據(jù)顯示為正態(tài)分布時(shí)的x±s，以及非高斯分布時(shí)的中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（Q1,Q3）]，通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis法分析連續(xù)性數(shù)據(jù)。最小顯著性差異法或Nemenyi檢驗(yàn)用于2組之間的多次比較。非參數(shù)數(shù)據(jù)按百分比（%）進(jìn)行評(píng)估，并使用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行比較。通過(guò)后退法對(duì)非經(jīng)典單核細(xì)胞進(jìn)行多元線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況

3組研究對(duì)象在年齡、性別、高血壓發(fā)病率、血壓、血脂、肝功能、腎功能等基線數(shù)據(jù)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。CAE組和CHD組患糖尿病的比例大于對(duì)照組（P＜0.05），但3組之間糖化血紅蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 研究對(duì)象的基線特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

表1 研究對(duì)象的基線特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

CHD：冠心病（coronary heart disease）；CAE：冠脈擴(kuò)張（coronary artery ectasia）；TC：總膽固醇（total cholesterol）；TG：三酰甘油（triglycerides）；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol）；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol）；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase）；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase）。

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二、患者炎癥指標(biāo)和冠脈造影特征

3組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞（neutrophil lymphocyte，NL）比值、ESR、hs-CRP、總膽紅素或直接總膽紅素等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。CAE患者和CHD患者的冠脈狹窄范圍（冠脈各分支受累概率）和狹窄程度（Gensini積分）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CAE患者冠脈各分支的血流慢于CHD患者[LAD 39.50（33.00,48.25）比28.00（22.00,39.00），LCX 37.50（28.75,52.25）比25.00（19.00,37.00），RCA 30.00（24.00,44.00）比21.00（18.00,31.00）]。CAE患者中，右冠脈擴(kuò)張受累的比例最高（76.5%）；Markis分型Ⅰ型9例（26.5%）、Ⅱ型3例（8.8%）、Ⅲ型15例（44.1%）和Ⅳ型7例（20.6%）（見(jiàn)表2）。

表2 3組患者炎癥指標(biāo)和冠脈造影特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

表2 3組患者炎癥指標(biāo)和冠脈造影特征[n（%）/±s/M（Q1，Q3）]

CHD：冠心?。╟oronary heart disease）；CAE：冠脈擴(kuò)張（coronary artery ectasia）；NL比值：中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio）；hs-CRP：超敏C反應(yīng)蛋白（high sensitivity C-reactive protein）；ESR：紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate）；TFC：心肌梗死溶栓治療冠脈血流幀數(shù)計(jì)數(shù)[thrombolysis in myocardial infarction（TIMI）frame count]。

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三、淋巴細(xì)胞亞群和單核細(xì)胞亞群分析

CAE組和CHD組之間的淋巴細(xì)胞亞型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。然而，與CHD和對(duì)照組相比，CAE組的非經(jīng)典單核細(xì)胞比例顯著增加、經(jīng)典型單核細(xì)胞比例顯著下降（均P＜0.05）（見(jiàn)表3、圖1）。

圖1 外周血單核細(xì)胞亞群分析

表3 淋巴細(xì)胞亞群和單核細(xì)胞亞群分析[M（Q1，Q3），%]

四、多元線性回歸分析

非經(jīng)典單核細(xì)胞的百分比值被設(shè)定為因變量，自變量包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙史、飲酒、BMI、hs-CRP、ESR、TC、TG、HDL-C、LDL-C、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、NL比值、總膽紅素、直接膽紅素、ALT、AST、尿素氮、肌酐和Gensini評(píng)分。設(shè)定CAE、CHD和對(duì)照組分別為1、2和3，多元重線性回歸分析結(jié)果見(jiàn)表4：非經(jīng)典單核細(xì)胞的百分比值與組別和高血壓負(fù)相關(guān)，和炎癥指標(biāo)（中性粒細(xì)胞、ESR）正相關(guān)。

表4 以非經(jīng)典型單核細(xì)胞為因變量進(jìn)行多重線性回歸

討 論

CAE是一種少見(jiàn)疾病，其病因尚不清楚。超過(guò)90%的CAE患者并發(fā)CHD，而其他患者則并發(fā)系統(tǒng)性血管炎（包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和白塞?。?、感染（如川崎病和肺炎衣原體感染）和遺傳性疾病[2,14-15]。目前認(rèn)為大多數(shù)冠脈出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的CAE是一種炎癥性疾病，但是其典型的病理變化是冠脈中層的破壞甚至缺如，其表現(xiàn)類似于免疫異常參與血管炎的病理改變。因此，確定這些CAE患者是否合并免疫異常，對(duì)CAE的病因探討和治療有重要的臨床意義。本研究將CHD患者和冠脈相對(duì)正常的受試者作為對(duì)照，采集各組患者的新鮮外周血樣，提取其中的白細(xì)胞，然后用多種熒光抗體標(biāo)記白細(xì)胞表面的抗原成分，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)探測(cè)熒光抗體的信號(hào)差異，從而間接分析外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例和亞型分布。

本研究數(shù)據(jù)顯示，3組研究對(duì)象的基線數(shù)據(jù)具有可比性。CAE患者和CHD患者的冠脈狹窄范圍（冠脈各分支受累概率）和狹窄程度（Gensini積分）無(wú)明顯差異，提示在冠脈粥樣硬化病變程度上2組無(wú)明顯差異。關(guān)于炎癥指標(biāo)，如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、ESR、hs-CRP等，CAE和CHD組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示2組之間炎癥水平相當(dāng)或因?yàn)闃颖玖康脑蛭茨茱@示出差異。關(guān)于淋巴細(xì)胞亞群的分布，CAE組與CHD組無(wú)明顯差異，提示CAE組可能并不涉及額外的免疫反應(yīng)過(guò)程。關(guān)于單核細(xì)胞亞群，與CHD和對(duì)照組相比，CAE組的非經(jīng)典單核細(xì)胞水平顯著升高，經(jīng)典單核細(xì)胞水平顯著降低，隨后的多重線性回歸分析進(jìn)一步證實(shí)了高非經(jīng)典型單核細(xì)胞比例與CAE相關(guān)，提示CAE患者處于一種炎癥狀態(tài)。

非經(jīng)典單核細(xì)胞表達(dá)高水平的促炎因子，如腫瘤壞死因子和白介素1-β，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用。經(jīng)典型單核細(xì)胞修復(fù)組織和調(diào)節(jié)免疫功能，中間型單核細(xì)胞參與抗原的呈遞和血管生成。在炎癥條件下，經(jīng)典型單核細(xì)胞可發(fā)育為中間型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞[7,11]。因此本研究中單核細(xì)胞表型的變化提示CAE存在炎癥反應(yīng)狀態(tài)。以往研究提示CAE為一種炎癥性疾病：在CAE的冠脈血管壁中浸潤(rùn)了大量炎癥細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞[16]，同時(shí)CAE患者的外周血數(shù)種炎癥細(xì)胞因子增加等[17-19]。因此總體上，CAE是一種炎癥性疾病，與CHD相比，單核細(xì)胞可能更多地參與CAE的病理過(guò)程。

CAE典型的病理學(xué)特征是嚴(yán)重的血管中層損傷，甚至完全沒(méi)有血管中層，蛋白酶降解可能在CAE患者細(xì)胞外基質(zhì)的異常代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20-23]。炎癥、免疫紊亂、感染、遺傳變異或其他機(jī)制可能會(huì)影響血管中層的損傷。本研究表明，與CHD組比較，免疫系統(tǒng)紊亂可能并沒(méi)有參與CAE的病理過(guò)程，因?yàn)镃AE患者的淋巴細(xì)胞亞型與CHD患者沒(méi)有顯著差異；同時(shí)其他研究也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CAE患者抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）和抗中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）（包括抗蛋白酶3ANCA和抗骨髓過(guò)氧化物酶ANCA）等與對(duì)照人群的差異[24]。因此，本研究推斷，CAE潛在發(fā)病機(jī)制更多的可能是炎癥過(guò)程，而不是免疫異常。未來(lái)需要更多研究來(lái)闡明CAE患者的炎癥狀態(tài)和病理變化的關(guān)系。

總結(jié)本研究，大多數(shù)于冠脈造影中發(fā)現(xiàn)的伴隨CHD的CAE患者更可能是一種炎癥性疾病，而不是一種免疫性疾病。本研究存在一些不足和局限性，為單中心研究、樣本量有限、未提供參與者的后續(xù)隨訪數(shù)據(jù)。進(jìn)一步的研究應(yīng)包括更大的樣本量和詳細(xì)的隨訪，以獲得更多有用的臨床信息。