樊世萌，劉浩，歐陽敬禹，2，劉戀，尤祥宇，2，蘇江濤，2，肖紅衛(wèi)

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，武漢 430068；2.襄陽湖北工業(yè)大學產(chǎn)業(yè)研究院，湖北 襄陽 441100；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430072）

青稞是一種禾本科大麥屬的禾谷類作物，廣泛種植于中國青藏高原地區(qū)。青稞具有很高的淀粉含量，適用于釀酒，因此每年都會產(chǎn)生大量青稞酒糟。青稞酒糟中含蛋白質、氨基酸等大量營養(yǎng)成分，可加以利用，避免資源浪費［1］。目前對酒糟的利用主要是用作動物飼料［2］、作物肥料［3-5］、提取有效成分［6］、栽培食用菌［7］等方面。青稞酒糟中的蛋白質以醇溶蛋白所占比例最高。醇溶蛋白是谷物中的一種貯藏蛋白［8］，具有很好的耐水性、耐熱性，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、精細飼料等［9-11］領域。對青稞酒糟中蛋白質的提取，有利于拓展青稞酒糟的應用，提高其附加值。

目前，提取醇溶蛋白最有效的方法是醇堿法，但是除了選取適合的溶劑外，浸提液醇堿比、固液比、浸提時間和浸提溫度都會顯著影響提取效率。雖然關于酒糟中蛋白質的提取已有報道，但是關于青稞酒糟中蛋白質的提取工藝報道很少。近年來青稞酒糟的產(chǎn)量越來越大，因此探究青稞酒糟蛋白質的最佳提取工藝，對綜合利用青稞酒糟具有十分重要的意義。本試驗在單因素試驗的基礎上，選取了浸提液醇堿比、固液比、浸提時間和浸提溫度為影響因子，采用4因素3水平的正交試驗，以蛋白質提取率作為指標，確定了青稞酒糟蛋白質的最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

材料與試劑：青稞酒糟，來源于湖北工業(yè)大學釀酒基地；氫氧化鈉、鹽酸、95%乙醇等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水均為實驗室自制去離子水配制。

儀器：FE20型pH計，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；H1850R型臺式高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；DYZ-20型低溫恒溫搖床，常州市金壇博科實驗設備公司；SKD-1000型全自動凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；UPT-I-10T型超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理新鮮青稞酒糟在電熱鼓風干燥箱中90℃烘干，粉碎，過40目篩，得到試驗原料。

1.2.2 青稞酒糟中蛋白提取工藝步驟試驗原料→95%乙醇和0.5 mol/L氫氧化鈉混合提取劑→攪拌浸提→7 000 r/min、4℃離心10 min→上清液→酸沉→冷凍離心→沉淀→干燥→粉碎→青稞酒糟蛋白粉。

1.2.3 青稞酒糟中蛋白質含量的測定采用凱式定氮法測定青稞酒糟中的蛋白質含量。

1.2.4 青稞酒糟中蛋白質沉淀最適pH的測定利用蛋白質在其等電點下溶液中溶解度最低的特點，測定青稞酒糟中蛋白質的等電點即為青稞酒糟沉淀蛋白質的最適pH。

稱取1 g試驗原料，加入28 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液和14 mL 95%乙醇，30℃下浸提90 min，控溫搖床轉速設置為30 r/min，浸提結束后，離心分離取上清液備用，上清液平均分成10份（每份40 mL），分別用鹽酸調節(jié)浸提液pH至5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6，調酸后浸提液體積均略有增加，各取40 mL，7 000 r/min、4℃離心10 min后棄去上清液，將沉淀物置于90℃烘箱內(nèi)干燥4 h，稱重干燥物。按照上述條件重復3次，將干燥物重量與沉降pH關系繪制成曲線圖，干燥物重量最大時的沉降pH即為青稞酒糟沉淀蛋白質的最適pH。

1.2.5 青稞酒糟中蛋白質提取工藝優(yōu)化首先利用單因素試驗對影響青稞酒糟蛋白質提取率的固液比、浸提液醇堿比、浸提時間、浸提溫度4個主要因素進行考察分析，再進行4因素3水平的正交試驗進行優(yōu)化。

1.2.6 青稞酒糟蛋白質提取率的計算蛋白質純度指凱式定氮法測得的干燥物中蛋白質含量占干燥物的百分比，蛋白質提取率指凱式定氮法測得的干燥物中蛋白質含量占投料的試驗原料中蛋白質理論含量的百分比。

2 結果與分析

2.1 沉淀青稞酒糟蛋白質的最適pH

經(jīng)過凱式定氮法測定，干燥的青稞酒糟中蛋白質含量占比19.1%，蛋白質含量比例很高，說明青稞酒糟具有很大的利用潛力。通過查閱文獻了解到，沉降酒糟蛋白質的最適pH大多數(shù)在4.5?5.5，因此本試驗設置pH梯度為4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5。圖1為在不同沉降pH下得到干燥物的量，由圖1可知，青稞酒糟沉淀蛋白質pH為4.9時，干燥物質量最大。因此，在后續(xù)的單因素試驗中，沉淀青稞酒糟蛋白質的pH設置為4.9。

圖1 青稞酒糟蛋白質最佳沉淀pH的確定

2.2 單因素試驗

2.2.1 固液比對蛋白質提取率的影響稱取青稞酒糟原料7份，每份1 g，置于標號1—7的錐形燒杯中，分 別 按 照 固 液 比1∶20、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶60，加入浸提液（95%乙醇∶0.5 mol/L氫氧化鈉溶液=1∶2），在30℃下浸提90 min，探討固液比對蛋白質提取率的影響。由圖2可知，青稞酒糟蛋白質提取量隨著浸提液體積的增大而增加，當固液比為1∶45時，蛋白質提取率最高，為46.93%；但是當繼續(xù)增加浸提液體積，蛋白質提取率不升反降。說明過量的浸提液反而會影響后續(xù)蛋白質的沉淀，導致蛋白質提取率下降。因此使用醇堿法提取青稞酒糟蛋白時，最佳固液比為1∶45。

圖2 固液比對蛋白質提取率的影響

2.2.2 浸提液醇堿比對蛋白質提取率的影響將浸提液醇堿比（95%乙醇∶0.5 mol/L氫氧化鈉溶液）分別設置為1∶1、2∶3、1∶2、1∶3、1∶4；稱取青稞酒糟原料5份，每份1 g，置于標號1—5的錐形燒杯中，各加入45 mL上述浸提液，30℃下浸提90 min，探討浸提液醇堿比對蛋白質提取率的影響。由圖3可知，青稞酒糟蛋白質提取率隨著浸提液中堿液比例的增加而增加，當醇堿比為1∶3時，蛋白質提取率最大，為49.82%；但是當繼續(xù)增加浸提液中堿液比例，蛋白質提取率降低。可能的原因是，雖然進一步增加浸提液中堿液比例，可使析出物增加，但是析出物顏色加深，說明析出物中不僅含有蛋白質，還可能含有纖維素等成分，對蛋白質的純度產(chǎn)生了影響，降低了蛋白質的提取率。因此使用醇堿法提取青稞酒糟蛋白質時，提取液最佳醇堿比為1∶3。

圖3 浸提液醇堿比對蛋白質提取率的影響

2.2.3 浸提溫度對蛋白質提取率的影響稱取青稞酒糟原料4份，每份1 g，置于標號1—4的錐形燒杯中，在固液比1∶45，醇堿比1∶2，浸提時間90 min的條件下，浸提溫度分別設置為4、30、37、45℃，探討浸提溫度對蛋白質提取率的影響。由圖4可知，浸提溫度為30℃時的蛋白質提取率顯著高于浸提溫度為4℃時的蛋白質提取率；而當浸提溫度超過30℃，蛋白質提取率并沒有顯著的增加。分析原因可能是，隨著溫度的提升，分子運動速度加快，更容易從試驗原料中析出；但是溫度過高也可能導致其他雜質的析出增加，還可能導致蛋白質變性，影響蛋白質的純度；同時過高的溫度會增加能耗成本。因此在提取工藝中，最佳的浸提溫度為30℃。

圖4 浸提溫度對蛋白質提取率的影響

2.2.4 浸提時間對蛋白質提取率的影響稱取青稞酒糟原料5份，每份1 g，置于標號1—5的錐形燒杯中，在料液比1∶45，醇堿比1∶2，浸提溫度30℃的條件下，浸提時間分別設置為30、60、90、120、180 min，探討浸提時間對蛋白質提取率的影響。由圖5可知，隨著浸提時間的增加，蛋白質提取率逐步提高，當浸提時間為90 min時，提取率最大，為46.85%；但是進一步延長浸提時間，提取率下降。分析其原因可能是，浸提時間過短，蛋白質析出不充分；而浸提時間過長可使部分蛋白質發(fā)生變性后的絮凝作用，導致提取率下降。因此，在提取工藝中，最佳浸提時間為90 min。

圖5 浸提時間對蛋白質提取率的影響

2.3 正交試驗

在4個單因素試驗的基礎上，再進行正交試驗的設計，試驗設計見表1，具體的正交試驗結果見表2。

表1 青稞酒糟蛋白質提取的正交試驗因素與水平

由表2可知，各因素對青稞酒糟蛋白質提取率的影響強弱為固液比＞醇堿比＞浸提溫度＞浸提時間。以青稞酒糟蛋白質的提取率為主要的參考指標進行極差分析后，確定理論最優(yōu)組合為A2B1C3D2，但考慮到實際生產(chǎn)條件與經(jīng)濟成本，確定實際最優(yōu)組合為A2B1C2D3。因此，青稞酒糟的最佳提取條件為固液比1∶45，醇堿比1∶3，浸提溫度30℃，浸提時間90 min，青稞酒糟蛋白質提取率為50.24%，干燥物中蛋白質純度為29.4%。

表2 青稞酒糟蛋白質提取的正交試驗結果

3 小結

本試驗采用醇堿溶解、酸沉的提取工藝對青稞酒糟蛋白質進行提取，所得到的青稞酒糟干燥物磨成粉后，顏色為淺黃色，粉末顆粒均勻，影響青稞酒糟蛋白質提取率的因素順序為固液比＞醇堿比＞浸提溫度＞浸提時間，最佳提取條件為固液比1∶45，醇堿比1∶3，浸提溫度30℃，浸提時間90 min，所得青稞酒糟蛋白質提取率為50.24%，干燥物中蛋白質純度為29.4%。本試驗驗證了使用醇堿法提取青稞酒糟蛋白質的可行性，蛋白質提取率較高，雖純度有待進一步提升，但提取條件溫和、簡易，為在工業(yè)上大規(guī)模提取青稞酒糟的蛋白質提供了參考，對青稞酒糟的綜合利用具有一定參考意義。