王超，徐靜，張前熙

（四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院，四川 自貢 643000）

四川自貢被稱為“千年鹽都”，地下鹽鹵資源豐富，尹菲［1］認為自貢地下鹵水中NaCl含量高達2.22? 5.28 mol/L，如此高鹽的極端環(huán)境，在傳統(tǒng)意義上被認為是生命的禁區(qū)［2］。然而近年來的研究顯示，在高鹽的極端環(huán)境下依然生存著一些特殊的微生物類群，它們被稱為嗜鹽微生物（Halophiles）［3］。嗜鹽微生物通常生存于海洋、鹽湖、鹽堿地、曬鹽池等高鹽環(huán)境中［4］，依據(jù)其最適生長鹽濃度，嗜鹽微生物分類見表1。目前嗜鹽微生物的研究已成為熱門領(lǐng)域，其在環(huán)境污染治理方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值。

表1 嗜鹽微生物的分類

李文均等［5，6］在新疆、青海的鹽堿土壤樣品中，分離出40株具有產(chǎn)生抗生素、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和脂肪酶等特性的中度嗜鹽放線菌菌株，為環(huán)境修復(fù)和新藥物的開發(fā)提供微生物材料支持。孫曉瑩等［7］篩選的耐鹽菌油菜假單胞菌（Pseudomonas brassicacearum）可作為鹽堿地改良微生物菌劑的優(yōu)良菌源，提高產(chǎn)量。吳濤等［8］篩選的沙雷氏菌（Serratiasp.）BF40能有效利用原油，在含10 g/L NaCl液體培養(yǎng)基中原油降解率達到56.7%，能明顯促進鹽漬化土壤石油烴、瀝青質(zhì)降解。Khemili-Talbi等［9］從油田高礦化度污水中分離出的極端嗜鹽古菌在NaCl濃度為25%時具有降解苯酚、芘和萘的潛力。廖焰焰等［10］篩選分離出一株畢赤酵母（Pichia caribbica），可用于高鹽醫(yī)藥廢水處理，COD去除率達到73%。曹文玲［11］篩選分離的KB-3菌株，不僅可以處理高鹽抗生素廢水，而且產(chǎn)電能力理想，使微生物燃料電池成為可能。

鉻是重要的戰(zhàn)略資源及經(jīng)濟資源，鉻鹽是化工材料制造的重要基礎(chǔ)原料［12］。鉻礦的開采和冶煉，導(dǎo)致大量含鉻廢物排放到自然環(huán)境中［13］。中國每年有20萬t鉻渣的排放量，已有超過300萬t的鉻渣堆存。鉻渣中含有大量的Cr（Ⅵ），如果這些鉻渣只是簡單地堆積而不被有效處理，Cr（Ⅵ）會隨風(fēng)、雨水進入土壤和地下水，嚴(yán)重威脅人類生存安全和環(huán)境安全，如何處理鉻污染已是一個不容小覷的問題［14］。近年來，人們探索使用微生物法修復(fù)日益嚴(yán)重的重金屬污染問題，相較于傳統(tǒng)的物理、化學(xué)、植物修復(fù)等方法，微生物修復(fù)操作簡單、成本低、環(huán)境友好、可廣泛應(yīng)用，成為環(huán)境修復(fù)研究的熱點。

鑒于嗜鹽微生物具有極大的應(yīng)用價值，且自貢的地下鹵水資源豐富，馮瑋等［15］的研究表明，自貢鹽礦環(huán)境中確有微生物的存在，本研究從自貢市榮縣長山鹽礦地下鹵水及周邊環(huán)境土壤中分離篩選出3種可培養(yǎng)的耐鹽微生物，探究其Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)，以期為高鹽環(huán)境中微生物處理重金屬污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取自貢市榮縣長山鹽礦為取樣點，采集鹽井鹽鹵、土壤樣品，4℃保存?zhèn)溆茫▓D1）。

圖1 樣品采集

1.2 試驗試劑

1.2.1 培養(yǎng)基的制備本研究選取LB培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基。其配方為胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L。篩選培養(yǎng)基為在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為5%、10%、15%、20%。

1.2.2 Cr（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)溶液及定量檢測試劑的配制Cr（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L）：重鉻酸鉀（K2Cr2O7）在110℃下烘2 h，取2.83 g，加去離子水溶解，定容至1 L，搖勻，避光保存。其他濃度Cr（Ⅵ）溶液由此溶液稀釋得到。

二苯碳酰二肼顯色液（DPC）：取DPC 0.2 g，加入到50 mL丙酮中，加去離子水溶解，定容至100 mL，搖勻，避光，4℃保存。

1∶1硫酸：將濃硫酸與去離子水按體積比1∶1混勻。

1∶1磷酸：將濃磷酸與去離子水按體積比1∶1混勻。

1.3 菌株的分離純化與鑒定

土樣：取樣品1 g，置于20 mL去離子水中，放入搖床中30℃、200 r/min振蕩30 min，靜置2 h后取上清液1 mL，加入到20 mL LB液體培養(yǎng)基中混勻，置于搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

水樣：取50 mL樣品，放入搖床30℃、200 r/min振蕩30 min。取1 mL樣品加入20 mL LB液體培養(yǎng)基中混勻，置于搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

取菌懸液稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，各取200 μL稀釋液涂布于LB固體篩選培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)72 h后，挑取單菌落純化培養(yǎng)，觀察菌落生長狀況。采用16S rDNA技術(shù)對菌株進行鑒定。

1.4 鹽濃度對菌株生長的影響

分別制備NaCl濃度為5%、10%、15%和20%的LB培養(yǎng)基。挑取單菌落，LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)18 h后，用LB培養(yǎng)基稀釋菌液OD600nm至0.8。按10%的接種量接種于上述含有不同濃度NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，總體積為100 mL，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)。分別在0、12、24、36、48、60、72 h時取樣，在600、540 nm波長處測定其菌體吸光值，以O(shè)D600nm-Na表征菌株耐鹽程度。

1.5 Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)

Cr（Ⅵ）的測定采用國際標(biāo)準(zhǔn)的二苯碳酰二肼（DPC）法，將液體培養(yǎng)基在8 000 r/min下離心5 min后取上清1 mL，用去離子水定容至50 mL后分別加入磷酸（1∶1）、硫酸（1∶1）各0.5 mL，再加入2 mL DPC顯色劑，搖勻后靜止10 min于540 nm測定吸光度，以去離子水作為對照。

挑取單菌落，LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)18 h后，用LB培養(yǎng)基稀釋菌液OD600nm至0.8。按10%的接種量，接種到含有Cr（Ⅵ）濃度為40 mg/L、NaCl濃度為10%的LB液體培養(yǎng)基中，總體積為100 mL，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)。分別在0、12、24、36、48、60、72 h時取樣，測定其菌體濃度OD600nm及培養(yǎng)基中剩余Cr（Ⅵ）的含量。對照組為含同濃度Cr（Ⅵ）的培養(yǎng)基（不加菌），每組3個重復(fù)。以菌液OD600nm-Cr表征菌株的生長狀況，以Cr（Ⅵ）去除率表征菌株的去除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化與鑒定

將樣本進行分離純化培養(yǎng)，根據(jù)菌落大小、形狀、顏色、隆起程度、表面光澤、透明程度、邊緣形狀和在高鹽濃度下生長情況等差別，最終分離出3株優(yōu)勢菌落，分別命名N1、N2、N3。提取菌株基因組DNA，經(jīng)16S通用引物擴增，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)其16S rDNA長度均在1 500 bp左右。成像結(jié)果見圖2。

圖2 16S rDNA PCR產(chǎn)物

16S測序序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，并構(gòu)建菌株發(fā)育樹，結(jié)果見圖3，N1為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），N2為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），N3為希瓦氏菌（Shewanellasp.）。菌株鑒定結(jié)果見表2。

表2 N1、N2、N3菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

圖3 N1、N2、N3菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)進化分析

2.2 NaCl濃度對菌株生長的影響

將N1、N2、N3菌株活化后接種于NaCl濃度為5%、10%、15%和20%的LB液體篩選培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)，其生長曲線如圖4所示。由菌株生長曲線可以看出，在NaCl濃度達10%時，N1、N2、N3菌株都能正常生長，生長的適應(yīng)期（0?12 h）、對數(shù)期（12? 36 h）、穩(wěn)定期（36?60 h）、衰亡期（60 h后）基本不受NaCl濃度的影響。N1、N2、N3菌株均表現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的特性，但每株菌對NaCl的耐受性有差異。N1菌株對NaCl的耐受性較強，在NaCl濃度達到15%時，其最大菌株濃度略高于對照組，但是當(dāng)NaCl濃度達到20%時，菌體最大生長濃度僅為對照組的75.68%，菌體生長受到明顯抑制。N2菌株對NaCl的耐受性優(yōu)于N3菌株，在NaCl濃度達到10%時，其菌體濃度大于對照組，N3菌株生長已受到輕微抑制，其最大菌體濃度下降10%；當(dāng)NaCl濃度達到15%時，N2、N3菌株菌體濃度明顯下降，僅為對照組的77.14%、38.89%，菌體生長受到抑制。3株菌株耐鹽能力表現(xiàn)為N1＞N2＞N3。

圖4 不同NaCl濃度下N1、N2、N3菌株的生長曲線

2.3 N1菌株的Cr（Ⅵ）去除效應(yīng)

研究選取對NaCl耐受性最佳的N1菌株作為供試菌株，探究耐鹽微生物對Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)。N1菌株在NaCl濃度為10%、Cr（Ⅵ）濃度為40 mg/L的LB培養(yǎng)基中的生長曲線及培養(yǎng)基Cr（Ⅵ）的剩余量曲線如圖5所示。對照組Cr（Ⅵ）濃度為0 mg/L。以O(shè)D600nm為對照組，以O(shè)D540nm表征培養(yǎng)基中剩余Cr（Ⅵ）濃度。相對于對照組，N1菌株的最大菌體濃度有所下降，為對照組的92.68%，但N1菌株對Cr（Ⅵ）的耐受性較強，其生長未受到明顯的抑制。同時培養(yǎng)基中Cr（Ⅵ）含量隨菌體的生長逐漸降低，72 h時，Cr（Ⅵ）的剩余量為18.8%，快速去除時間為36? 60 h。Cr（Ⅵ）的去除與菌體濃度呈正相關(guān)，菌體生長進入穩(wěn)定期后，Cr（Ⅵ）的去除速率達到峰值，培養(yǎng)72 h后，去除率達到81.2%。

圖5 N1菌株的Cr（Ⅵ）去除效應(yīng)

3 小結(jié)與討論

本研究以四川自貢長山鹽礦地下鹵水及周邊環(huán)境土壤為研究材料，利用LB培養(yǎng)基篩選出3株耐鹽優(yōu)勢菌株，分別為N1（Bacillus cereus）、N2（Bacillus altitudinis）、N3（Shewanellasp.），在NaCl濃度為10%時，菌株均可正常生長。以N1菌株為試驗材料探究Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)，72 h后去除率達到81.2%，為高鹽環(huán)境中處理Cr（Ⅵ）污染提供了理論支持。

作為一種古老的人造鹽生態(tài)系統(tǒng)，鹽井中分布著大量的嗜鹽微生物，蘊藏著無法估量的微生物資源和基因資源［16］。據(jù)報道，目前可分離培養(yǎng)的微生物僅占環(huán)境微生物的1%?10%，大量的微生物不能培養(yǎng)或現(xiàn)階段難于培養(yǎng)。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組測序的微生物組研究已滲透到海洋、土壤、人、動物以及環(huán)境等各領(lǐng)域。苑楠楠［17］利用宏基因組學(xué)方法解析不同季節(jié)酸性礦山廢水中微生物群落功能的變化規(guī)律，分析了不同性質(zhì)酸性礦山廢水中微生物群落的變化規(guī)律以及它們與環(huán)境因子之間的關(guān)系。梁華忠等［18］利用宏基因組技術(shù)篩選自貢大公古鹽井中嗜鹽微生物的Na+/H+離子逆轉(zhuǎn)運蛋白基因，并分析結(jié)構(gòu)和編碼蛋白，對探究微生物的嗜鹽機理、開發(fā)利用古鹽井中的基因資源、尋找新的耐鹽基因具有重要意義。宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)及應(yīng)用，對挖掘環(huán)境中的微生物與基因資源、評估環(huán)境微生物安全具有重要意義。

極端微生物在適應(yīng)極端生存條件的演化過程中，產(chǎn)生了有別于非環(huán)境來源的微生物的代謝特點，如可分泌一些特殊功能的酶類和（或）產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異的代謝產(chǎn)物以應(yīng)對環(huán)境對其自身生長的限制。Goto等［19］從德國西部的堿性土壤中分離得到一株具有強烈抗負離子能力的Bacillus屬菌株，對化工企業(yè)生產(chǎn)中污染物的生物處理工藝研究具有重要的借鑒價值。Guazzaroni等［20］和Pessoa-Filho等［21］對Tinto河流樣本中微生物及功能分析發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)多數(shù)微生物具有與三氧化二砷等酸性物質(zhì)抗性相關(guān)的功能基因，這些微生物可能具有對該類污染物的降解能力。Berlemont等［22］從南極的土壤中分離到42株嗜冷產(chǎn)酶菌株，可分泌嗜冷酯酶、淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶等多種酶類，在寒帶海域海洋污染物的生物治理中具有巨大的應(yīng)用潛力。對極端微生物的研究不僅可以揭示生命的起源和演化，同時還為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的生物防治、環(huán)境治理以及藥物的篩選等提供重要的參考依據(jù)。