易美琴， 陳文文， 徐小洪， 冉茂， 秦平偉，劉安洋， 高天科， 夏慶友， 王根洪， 趙敏

1.西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400715;2.西南大學 前沿交叉學科研究院生物學研究中心，重慶 400715;3.中國煙草總公司重慶市公司 煙草科學研究所，重慶 400715;4.中國煙草總公司重慶市公司 彭水分公司，重慶 彭水 409600

煙葉本身的烘烤難易程度(易烤性)及耐受程度(耐烤性)統(tǒng)稱為煙葉的烘烤特性[1-3]． 烤煙的烘烤特性受到多方面因素的影響[4-8]， 但最重要的影響因素是遺傳基礎也即品種差異[9]， 且不同基因型烤煙烘烤特性差異有統(tǒng)計學意義[10]．

在重慶地區(qū)， 存在“云煙87”和“云煙85”上部煙葉相對易烤且耐烤， 而“K326”和“紅花大金元”難烘烤的現(xiàn)象． 本研究選定不同烘烤特性品種的煙草的上部煙葉， 對其在烘烤過程中煙葉的含水率、 顏色、 質(zhì)體色素、 糖類物質(zhì)、 含氮化合物的動態(tài)變化與葉綠素酶、 多酚氧化酶活性等常規(guī)化學指標的動態(tài)變化規(guī)律進行分析， 旨在為解決不同品種上部煙葉的難烘烤問題提供新的科學思路， 從而減少烘烤帶來的損失， 為改善煙葉烘烤特性， 提高烤后煙葉品質(zhì)提供理論支持．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為“云煙87”(Y87)、 “云煙85”(Y85)、 “紅花大金元”(HD)和“K326”， 種植于中國煙草總公司重慶市公司彭水分公司的潤溪煙站基地． 該基地土壤肥力合適， 田間煙葉管理按照常規(guī)的煙葉生成模式進行種植管理． 煙葉發(fā)育正常， 長勢良好． 供試煙葉為上部適熟煙葉． 4個品種煙葉置于同一烤房中， 采用適用于“云煙87”的三段六步式烘烤工藝進行烘烤， 在此工藝基礎上根據(jù)煙葉狀態(tài)做出適當調(diào)整． 主要設備為密集烤房控制器YJHK-01等．

1.2 試驗設計

試驗主要為烘烤試驗和烤后煙葉生理生化測定．

1) 烘烤試驗： 采收“云煙87”“云煙85”“紅花大金元”和“K326”的上部第四位煙葉于密集烤房中進行烘烤， 試驗采用常規(guī)的掛桿烘烤和三段六步式烘烤工藝(圖1)， 在烘烤過程中對烘烤前RT(Room Temperature)、 變黃期(38 ℃與42 ℃下煙葉8～9成變黃， 葉脈仍為綠色)、 定色期(48 ℃與56 ℃下黃片黃筋， 葉片干燥)、 干筋期(62 ℃下全爐煙葉， 主脈干燥)及烘烤后(68 ℃)5個時期不同時間點， 選取每個溫度對應階段的中間節(jié)點時間進行取樣， 觀察煙葉顏色變化．

2) 煙葉生理生化測定 ： 采取隨機取樣原則， 選取煙葉葉中部位進行測定． 每3片葉為一份樣本， 剪碎混勻并用錫紙包裹放入干冰中， 回到實驗室后放于-80 ℃冰箱保存待用．

圖1 三段六步式烘烤工藝溫濕度設置條件

1.3 測定項目與方法

1.3.1 煙葉含水量測定

煙葉的含水量變化采用殺青烘干法[11]測定， 計算葉片及主葉脈的相對含水率， 公式如下：

W=(G1-G2)/G1×100%

其中：W為相對含水率，G1為濕煙草質(zhì)量，G2為全干煙草質(zhì)量．

1.3.2 化學成分含量測定

葉綠素、 類胡蘿卜素含量的測定參照文獻[12]的方法， 采用乙醇浸提與比色法來檢測．

總氮含量： 采用硫酸-雙氧水消解與凱氏定氮法測定植物全氮含量．

粗蛋白含量： 采用硫酸-催化劑消解與凱氏定氮法測定植物粗蛋白含量．

還原糖、 總糖含量： 分別采用G-CLONE還原糖含量、 總糖含量檢測試劑盒(重慶康坭商貿(mào)有限公司)進行測定． 所用儀器主要為凱氏定氮儀、 梅特勒 ML204型萬分之一天平、 分光光度計(T6-新世紀， 普析)、 Synergy H4全功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)．

1.3.3 相關酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)、 過氧化物酶(POD)活性： 采用試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、 過氧化物酶(POD)活性(南京陌凡生物科技有限公司)．

淀粉酶的活性： 采用淀粉酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定．

多酚氧化酶(PPO)的活性： 采用多酚氧化酶(PPO)試劑盒(上海索橋生物科技有限公司)．

葉綠素酶活性： 采用植物葉綠素酶ELISA試劑盒(重慶康坭商貿(mào)有限公司)測定．

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用Microsoft Excel進行試驗結(jié)果統(tǒng)計， 運用GraphPad Prism 6， Illustrator進行繪圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過程中質(zhì)體色素含量、 葉綠素酶的活性變化

隨著時間和溫度的增加， 煙葉由黃綠色逐漸變黃， 而煙葉的質(zhì)體色素含量可以反映葉片的顏色變化， 圖2是4個供試品種上部煙葉烘烤過程中的葉綠素a(圖2a)、 類胡蘿卜素(圖2b)相關含量和葉綠素酶活性(圖2c)變化圖．

新鮮煙葉中“紅花大金元”的葉綠素含量最高， 在烘烤過程中各品種煙葉葉綠素含量都呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢， 且在變黃前期(38 ℃前)下降速度較快， 此階段煙葉從葉尖開始變黃， 變黃長度約10 cm， 煙葉總計變黃6～7成； 42 ℃時煙葉總計變黃9～10成， 主葉脈發(fā)軟， 整體呈現(xiàn)為黃片青筋， 與“云煙87”“云煙85”相比， “紅花大金元”“K326”的葉基部位葉片仍為黃青色且葉脈更綠， “云煙87”在42 ℃時葉綠素含量降到最低， 而“紅花大金元”的葉綠素含量依舊高于其他3個品種； “云煙85”“K326”在48 ℃時， 葉綠素含量最低， 之后所有品種的葉綠素含量都有所上升， 這可能是有機試劑提取葉綠素產(chǎn)生的誤差， 但總體上葉綠素含量在烘烤過后是顯著降低的， 并且從變化趨勢上來看， “紅花大金元”和“K326”的葉綠素含量降解速率低于“云煙87”“云煙85”．

由圖2b可以看出， 從烘烤階段開始到定色期前期(48 ℃)， 由葉綠素降解轉(zhuǎn)變?yōu)轭惡}卜素， 且其含量逐漸增高， “紅花大金元”的類胡蘿卜素含量最高． 而從定色期后期到干筋期階段， 類胡蘿卜素含量有所下降， 可能是其進一步生成了芳香類化合物． 在整個烘烤過程中， “紅花大金元”的類胡蘿卜素含量比其他品種高， 但是其葉綠素含量下降相對更慢， 這可能是導致其烘烤后雜色煙占比較大的原因之一．

圖2 烘烤過程中煙葉的質(zhì)體色素含量、 葉綠素酶活性變化

我們重點關注了變黃階段的葉綠素酶活性的變化． 在新鮮葉片中， “云煙87”的葉綠素酶活性最高， “紅花大金元”其次， “云煙85”和“K326”最低， 二者差異不顯著． 在烘烤過程中， “K326”的葉綠素酶活性表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢； “紅花大金元”在42 ℃之前酶活性緩慢下降， 在42 ℃之后略微升高； 在38 ℃時， “云煙87”“云煙85”的葉綠素酶活性較低， 隨后隨著溫度上升而升高， 進入變黃后期(42 ℃)時， “云煙87”“云煙85”的葉綠素酶活性顯著高于“紅花大金元”“K326”， 而“紅花大金元”酶活性最低．

從葉綠素、 類胡蘿卜素含量變化趨勢可知， 在烘烤過程中葉綠素酶活性和煙葉的葉綠素含量成反比， 和葉片變黃程度成正比， 且不同品種間的葉綠素酶活性的高低也可能影響煙葉的變黃難易程度， 進而影響煙葉的易烤性及其烤后煙葉品質(zhì)．

2.2 烘烤過程中糖類物質(zhì)的含量及淀粉酶活性變化

糖類物質(zhì)是煙草光合產(chǎn)生的重要化學物質(zhì)， 在煙草的干重中占比25%～50%[13]， 按結(jié)構可分為單糖、 低聚糖和多糖[14]． 煙草在生長過程中會積累多糖， 包括淀粉、 纖維素、 果膠等， 在煙葉收割后的調(diào)制發(fā)酵、 烘烤過程中， 會降解為單糖， 如葡萄糖、 果糖等還原糖． 煙葉中的糖含量顯著影響煙葉的氣味和品質(zhì)[15]．

在鮮煙葉中， “紅花大金元”的還原糖(圖3a)含量最低， 烘烤開始后， “紅花大金元”和“云煙85”的還原糖含量在38 ℃前呈顯著升高的趨勢， 隨著溫度的變化， 兩個品種的還原糖開始降解， “紅花大金元”一直處于降低的變化過程， 而“云煙85”在48～56 ℃間又再一次發(fā)生了較為顯著的上升隨后急劇下降直到烘烤結(jié)束； “K326”煙葉中的還原糖含量在42 ℃前呈現(xiàn)出較為平緩的變化， 42～48 ℃間急劇增加， 隨后還原糖含量隨溫度的升高而降低； “云煙87”的還原糖含量在整個烘烤階段都處于略微降低或略為升高的變化中， 僅在62～68 ℃間呈明顯下降趨勢．

總糖(圖3b)即還原性的葡萄糖， 包括果糖、 乳糖、 戊糖、 蔗糖、 麥芽糖以及能部分水解的淀粉等， 它們能在特定條件下被水解成還原性單糖[16]． 從圖3b中可以發(fā)現(xiàn)， 4個品種新鮮煙葉的總糖含量由高到低依次為“云煙85”“云煙87”“K326”“紅花大金元”． 烘烤過程中煙葉總糖的變化趨勢表現(xiàn)為先下降后上升． 在42℃變黃階段之前， 總糖含量整體處于250 mg/g以下， “云煙87”“云煙85”的總糖含量要顯著高于“紅花大金元”和“K326”． 到了定色期后， 由于淀粉等大分子糖類物質(zhì)經(jīng)過高溫降解， 總糖含量逐漸增大， 而“紅花大金元”的總糖含量總體上最低， 這可能是淀粉等大分子糖類分解不充分所致， 而其他3個品種的總糖含量差異不顯著．

淀粉酶作用于α-1，4-糖苷鍵和α-1，6-糖苷鍵， 降解產(chǎn)物以麥芽糖為主， 還有少量的麥芽三糖、 葡萄糖、 α-極限糊精等[17]．

從整體上看， 如圖3c， 在烘烤過程中， 除38℃時“紅花大金元”的總淀粉酶活性略微升高外， 其他3個品種的總淀粉酶活性均有所降低． 48 ℃后的酶活性表現(xiàn)從高到低依次為“紅花大金元”“云煙85”“K326”“云煙87”． 淀粉酶將淀粉降解為單糖， 煙葉中的還原糖、 總糖含量升高． 烤后煙葉中“紅花大金元”的糖含量最低． 淀粉等大分子糖類物質(zhì)可能是影響煙葉烘烤特性的關鍵因素．

圖3 烘烤過程中煙葉的糖類物質(zhì)含量及淀粉酶活性變化

2.3 烘烤過程中粗蛋白、 總氮、 煙堿的含量變化

煙草中具有多種含氮類化合物， 包括蛋白質(zhì)、 生物堿、 游離氨基酸、 硝酸鹽等， 其含量會影響煙葉烘烤特性， 同時也影響煙葉的品質(zhì)及吸煙者的健康[18]．

根據(jù)烤煙化學指標評價標準， 烤后煙葉的總氮含量范圍在1.5%～3.5%之間并且總氮含量小于1.5%時吃味平淡， 大于3.5%則燃燒時產(chǎn)生濃烈辛辣的煙氣， 刺激性較大， 最適值為2.5%[19]． 品質(zhì)良好的煙葉粗蛋白含量應小于10%， 含量在10%～15%之間的煙葉品質(zhì)會變差， 如果大于15%的話， 煙葉品質(zhì)會更差[20]． 煙堿含量范圍宜在1.5%～3.5%之間， 在2%左右最好， 含量過低則吃味平淡勁頭不足， 過高則勁頭過強， 煙味發(fā)苦[21]．

圖4是煙葉烘烤過程中粗蛋白(圖4a)、 總氮(圖4b)、 煙堿(圖4c)的含量變化示意圖， 在烘烤前及烘烤整個過程中， 難烘烤品種“K326”和“紅花大金元”的粗蛋白含量均整體高于易烘烤品種“云煙87”和“云煙85”． 新鮮煙葉中“紅花大金元”和“K326”的總氮含量處于1.5%以上， 顯著高于“云煙85”和“云煙87”． 在整個烘烤階段， 4個品種的總氮含量以不同的變化趨勢升高， 其中“K326”“紅花大金元”的總氮含量高于“云煙87”“云煙85”． 圖4c結(jié)果顯示， 烤前4個品種的煙堿含量在1.5%～2%之間， 在烘烤過程中含量均逐漸增加， 烤后含量處于2%～2.5%之間， 整體上差異不顯著．

圖4 烘烤過程中煙葉的粗蛋白、 總氮、 煙堿含量變化

2.4 烘烤過程中煙葉的含水量變化

供試4個品種的煙葉在烘烤前葉片、 主葉脈含水率相當， 烘烤過程中呈逐漸降低的趨勢． 38℃變黃階段前期， “紅花大金元”的葉片含水率下降趨勢最快， “云煙87”“云煙85”其次， “K326”最慢； “紅花大金元”的主葉脈含水率下降也最快， 其他3個品種下降趨勢相似． 38～42 ℃變黃中期， “紅花大金元”葉片含水率雖然低但下降趨勢與其他3個品種相比較為平緩； 42～48 ℃變黃中后期以及定色前期， “云煙87”“云煙85”葉片含水率下降更快； 而在42～48 ℃期間， 4個品種的主葉脈含水率又一次急速下降， 但“云煙87”“云煙85”下降趨勢更快． 42～56 ℃定色期， 煙葉呈現(xiàn)出黃片黃筋的狀態(tài)， 葉片勾尖卷邊， 48 ℃之后葉片及主葉脈含水率下降速率開始降低， 4個品種的葉片含水率都處于20%以下， 而葉脈含水率在56 ℃時才下降到20%， 這個現(xiàn)象也正好對應了56℃之后的干筋期階段， 煙葉的主葉脈逐步干燥、 變黃， 溫度到達68℃時全爐煙葉主脈干燥(圖5)．

圖5 烘烤過程中煙葉的含水量變化

結(jié)合先前的葉綠素含量變化來看， 上部煙葉烘烤過程中煙葉失水主要集中在變黃后期至定色期之間， 而“紅花大金元”色素含量高， 葉片失水速率過快， 主葉脈失水速率低， 葉片和主葉脈的失水和變黃速度協(xié)調(diào)性差， 這也是其上部煙葉易烤性差， 烘烤后的煙葉青煙率和雜色煙率較高的原因．

2.5 烘烤過程中煙葉的抗氧化特性變化

在烘烤后期， “紅花大金元”“K326”的葉片發(fā)生了褐變反應[22]， 煙葉整體色澤呈現(xiàn)出黑褐色并且部分煙葉有糊片、 黑糟的現(xiàn)象， 這也是烘烤中常出現(xiàn)的現(xiàn)象． 而多酚氧化酶作為催化酶類， 催化產(chǎn)生酚類物質(zhì)， 是煙葉轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣⑦M一步褐變的主要原因[23]． 過氧化物酶是生物體內(nèi)重要的清除劑， 用于降解酚類、 甲醛等[24]． 超氧化物歧化酶也是抗氧化酶之一， 是生物體內(nèi)清除自由基和有害物質(zhì)的重要酶類[25]．

圖6是上部煙葉烘烤過程中的多酚氧化酶PPO(圖6a)、 過氧化物酶POD(圖6b)、 超氧化物歧化酶SOD(圖6c)活性變化示意圖． 從烤前到42 ℃的變黃階段中， “云煙87”“云煙85”的多酚氧化酶活性顯著低于“紅花大金元”， 而到了定色前期48～56 ℃， “紅花大金元”“K326”的活性有所下降， “云煙87”“云煙85”的多酚氧化酶活性卻顯著升高． 4個品種鮮煙葉中的過氧化物酶活性無太大差異， 但隨著烘烤時間的延續(xù)， 過氧化物酶的活性均逐漸增強， 但品種間具有顯著差異， 表現(xiàn)為“云煙87”和“云煙85”高于“紅花大金元”和“K326”． 烘烤前“云煙87”“云煙85”的超氧化物歧化酶活性相較于“紅花大金元”“K326”更高一些， 隨著烘烤時間及溫度的變化， 酶活性逐漸增強． 4個品種的SOD平均活性表現(xiàn)為“云煙85”最高， “云煙87”次之， “紅花大金元”相對于“K326”最低． 中高溫脅迫導致煙葉PPO活性升高， 隨之增加細胞內(nèi)自由基和酚類等物質(zhì)含量， 而這些物質(zhì)的積累又會引起植物的褐變反應， 不過細胞內(nèi)抗氧化酶活性也會隨溫度增強， 清除細胞體內(nèi)的自由基和酚類等小分子物質(zhì)[26]． 綜合來看， 雖然在定色階段“云煙87”“云煙85”的PPO活性要高于“K326”“紅花大金元”， 但由于其POD與SOD活性遠遠高于“K326”“紅花大金元”， 其細胞清除自由基和酚類等小分子物質(zhì)的作用更強， 細胞環(huán)境變化較為穩(wěn)定． 而隨著溫度增加， 細胞膜系統(tǒng)受損可能會進一步增加多酚類物質(zhì)的釋放， 而酶活性均逐漸降低， “紅花大金元”“K326”產(chǎn)生的酚類物質(zhì)更多， 從而產(chǎn)生棕色化反應及酶促褐變， 出現(xiàn)深淺不一的雜色煙、 黑糟等現(xiàn)象．

圖6 烘烤過程中煙葉的抗氧化特性變化

3 結(jié)論

本試驗采用三段六步式烘烤工藝對易烤品種“云煙87”“云煙85”和難烤品種“紅花大金元”“K326”的上部煙葉進行烘烤． 選取烘烤前、 變黃期(38 ℃，42 ℃)、 定色期(48 ℃，56 ℃)、 干筋期(62 ℃)及烘烤后(68 ℃)5個時期不同時間點的煙葉樣品， 探究了烘烤過程中變黃、 失水特性、 質(zhì)體色素降解、 碳代謝、 氮代謝及相關酶活性等理化性質(zhì)的變化規(guī)律．

研究表明， 烘烤過程中煙葉的顏色變化與葉片含水率及糖含量等化學成分變化密切相關． 在變黃期間， 煙葉顏色從綠色變?yōu)闇\黃色， 煙葉葉片含水率由70%左右下降至58%左右， 此階段葉綠素酶活性顯著升高， 葉綠素含量大幅度降低， 還原糖、 總糖含量升高； 定色階段， 煙葉黃色逐漸加深， 呈現(xiàn)出深橘黃色， 煙葉含水率由 58%左右降至10%左右， 多酚氧化酶及抗氧化酶活性增強．

在烘烤過程中“紅花大金元”煙葉變黃速度較慢， 變黃期葉片失水速率又較快， 這與文獻[27-28]的研究結(jié)果一致． 大分子糖類物質(zhì)降解不充分導致總糖含量低， 到排濕定色階段時， 其失水速率有所下降， PPO酶活性升高， 導致酚類物質(zhì)積累， 而抗氧化的POD和SOD酶活性相對較低， 對煙葉變黃與定色不利， 難于烘烤且定色期易發(fā)生褐變， 不耐烤． 烤后煙葉粗蛋白含量大于12%， 黑糟、 糊片雜色煙率大， 品質(zhì)較差． “K326”煙葉變黃速度稍快， 失水速率適中， 雖然其多酚氧化酶活性偏低， 但其定色期抗氧化酶活性較低， 清除體內(nèi)自由基及酚類物質(zhì)的能力較差， 煙葉易發(fā)生褐變， 耐烤性較差． 而“云煙87”“云煙85”在變黃期變黃速度適中， 葉片失水速率較快， 變黃與失水特性協(xié)調(diào)， 大分子糖類物質(zhì)降解充分， 總糖含量累積多， 在定色期間雖然多酚氧化酶活性高， 但其POD和SOD酶活性相對更高， 清除細胞體內(nèi)的自由基、 酚類物質(zhì)的能力更強， 烤后煙葉粗蛋白含量10%左右， 煙堿、 總氮含量相對適中， 煙葉品質(zhì)較好．

本研究系統(tǒng)分析了重慶煙區(qū)不同烘烤難易品種的上部煙葉物質(zhì)變化規(guī)律， 研究結(jié)果初步表明煙葉變黃與失水的協(xié)調(diào)性、 粗蛋白含量及抗氧化酶活性差異是導致不同品種上部煙葉烘烤難易程度不同的主要因素， 研究工作為下一步通過基因工程手段改良煙草烘烤特性奠定了堅實的基礎．