王瑤 李佳璐 馬煥 李鹍 王洪波 丁瑩瑩 陶海波 李梅

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，是導(dǎo)致青少年因癌癥死亡的第二大因素[1-2]。骨肉瘤好發(fā)于股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端，惡性程度高，轉(zhuǎn)移率達(dá)20%[3]。自新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）+廣泛切除+術(shù)后化療三階段結(jié)合的綜合治療方法廣泛應(yīng)用以來，患者保肢率和5 年生存率均有較大提高，但仍有20%～30%的患者因?qū)σ痪€化療方案不敏感而預(yù)后不佳，因此NAC 療效已成為影響骨肉瘤患者手術(shù)方式選擇和預(yù)后的重要因素[1-4]。腫瘤壞死率（tumor necrosis rate，TNR）是目前評價骨肉瘤NAC 療效的病理學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)，但因取材要求嚴(yán)格、操作繁瑣且僅適用于行根治性手術(shù)的腫瘤，致使評估具有一定的滯后性[2,4-5]。動態(tài)增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI) 是一項腫瘤灌注成像技術(shù)，可有效評估腫瘤微血管生成情況，為腫瘤療效評估和轉(zhuǎn)歸預(yù)測提供有效信息。目前該技術(shù)已在腦膠質(zhì)瘤[6]、乳腺癌[7-9]、結(jié)直腸癌[10]、下咽癌[11]、宮頸癌[12]、前列腺癌[13-14]、軟組織肉瘤[15]等諸多惡性腫瘤的療效評價研究中得到驗證，但應(yīng)用在骨肉瘤NAC 腫瘤壞死率評估中的報道極少。本研究旨在探討DCE-MRI 評估骨肉瘤NAC 腫瘤壞死率的價值，以期盡早發(fā)現(xiàn)對治療無反應(yīng)或反應(yīng)差的骨肉瘤病例，為臨床治療方案制定及調(diào)整提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2019 年1 月至2020 年6 月于昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院行手術(shù)病理證實的原發(fā)性骨肉瘤患者11 例，其中男性9 例，女性2 例，中位年齡17（11～32）歲；發(fā)生在股骨遠(yuǎn)端5 例，脛骨近端6 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次MRI 檢查前均未行病理活檢及相關(guān)治療；無MRI 檢查禁忌證，無化療及手術(shù)禁忌證；按期完成NAC 并行第2 次MRI 檢查，后行擴(kuò)大根治術(shù)?；煼桨笧锳P、MTX+VCR、IFO 序貫化療（AP=阿霉素（ADM）+順鉑（DDP）；MTX+VCR=甲氨蝶呤+長春新堿；IFO=異環(huán)磷酰胺）。MRI 影像資料均滿足數(shù)據(jù)測量要求。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選患者均簽署知情同意書。

1.2 影像學(xué)檢查方法

所有患者在NAC 前及術(shù)前行2 次MRI 檢查，采用Philips Ingenia 3.0T 磁共振儀（購自荷蘭飛利浦公司）掃描，包括常規(guī)平掃及增強(qiáng)、DCE-MRI。DCEMRI 先采用擾相梯度回波序列（GRE）矢狀位T1WI行兩期反轉(zhuǎn)角掃描，再使用擾相GRE 序列快速3D DYNAMIC 行矢狀位T1WI 動態(tài)增強(qiáng)掃描。掃描參數(shù)：反轉(zhuǎn)角度分別為5°、15°，TE 2.0 ms、TR 4.0 ms、層厚3.5 mm、間距0、FOV 250 mm×250 mm。對比劑注入前先掃描5 期，第5 期結(jié)束后團(tuán)注對比劑（Gd-DTPA 0.1 mmol/kg，2.5 mL/s），共掃描80 期，采集1920 幅圖像，總時間為6 m23 s。

1.3 病理組織定位取材及TNR 評估

患者完成NAC 并行第2 次MRI 檢查后2 周內(nèi)經(jīng)手術(shù)取得完整瘤段，分別以髁間窩和髁間嵴中心為界，將瘤段沿正中矢狀面剖開，選擇一側(cè)剖面切厚度為5 mm 的組織，將其分割為大小為1 cm×1 cm 若干組織塊，組織塊即為病理樣本個體，依次進(jìn)行編號、制備蠟塊、HE 染色（圖1A，圖1B，圖2A）。由1 名具有10 年以上工作經(jīng)驗的骨腫瘤病理醫(yī)師獨立判讀HE 染色切片（圖2C）。在100 倍鏡下選取“熱點”區(qū)域，400 倍鏡下計數(shù)視野內(nèi)TNR，選取5 個視野計數(shù)，最終結(jié)果取平均值。根據(jù)Huvos 分級標(biāo)準(zhǔn)分級所得樣本TNR[5]。

1.4 DCE-MRI 影像處理分析

DCE-MRI 數(shù)據(jù)使用GE Healthcare 血流動力學(xué)Omni Kinetics（O.K.）軟件進(jìn)行測量及圖像后處理。影像處理步驟：1）AIF 勾畫：O.K.軟件中手動勾畫動脈輸入函數(shù)（arterial input function，AIF），以掃描范圍內(nèi)股動脈為參考血管，勾畫與血管截面大小相近的圓形ROI，勾畫3～5 個ROI，獲得多個AIF 并融合為最終AIF，保存該結(jié)果。2）ROI 勾畫：選擇瘤段切片對應(yīng)的矢狀位影像層面（圖1C，圖1D，圖2B），計算定量DCE-MRI 結(jié)果，依次保存容量轉(zhuǎn)移常數(shù)（volume transfer constant，Ktrans）、速率常數(shù)（rate constant，Kep）、血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)（volume fraction，Ve）、血漿容積分?jǐn)?shù)（plasma volume fraction，Vp）并生成參數(shù)偽彩圖（圖2D），按照瘤段分割出的組織塊樣本定位并等比例勾畫大小為1 cm×1 cm 的ROI，測量各ROI內(nèi)NAC 前、后2 次Ktrans、Kep、Ve、Vp值，同一個AIF 重復(fù)測量3 次后取平均值。

圖1 病理取材及DCE-MRI 影像-病理匹配過程

圖2 組織樣本影像及病理表現(xiàn)

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗樣本的正態(tài)性及方差齊性。不滿足正態(tài)分布的參數(shù)采用Mann-WhitneyU檢驗，用中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示。以TNR 評估腫瘤樣本緩解視為陽性，繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic,ROC），評估不同參數(shù)的診斷效能，尋找最佳臨界值，并計算其診斷敏感度和特異度。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤病理樣本TNR 評估

11 例瘤段共取得病理樣本357 個，排除H&E 染色證實非腫瘤及完全壞死樣本53 個，共304 個病理樣本納入分析。根據(jù)Huvos 分級標(biāo)準(zhǔn)[5]，TNR Ⅰ級212 個（68.9%）；Ⅱ級37 個（12%），Ⅲ級31 個（10%），Ⅳ級28 個（9.1%）。緩解組TNR≥90%（Ⅲ級+Ⅳ級）共59 個，占總樣本量19.4%；未緩解組TNR＜90%者（Ⅰ級+Ⅱ級）共245 個，占總樣本量80.6%。

2.2 腫瘤病理樣本NAC 前后，緩解組及未緩解組Ktrans、Kep、Ve、Vp 比較

NAC 前參數(shù)以pre-Ktrans、pre-Kep、pre-Ve、pre-Vp表示，化療后以post-Ktrans、post-Kep、post-Ve、post-Vp表示，化療前后參數(shù)差值以ΔKtrans、ΔKep、ΔVe、ΔVp表示。NAC 后，兩組Ktrans、Ve、Vp均明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；緩解組Kep化療后明顯降低（P＜0.05），但未緩解組Kep較化療前略有升高（P＞0.05），見表1。

表1 腫瘤病理樣本緩解組及未緩解組NAC 前后參數(shù)比較

2.3 腫瘤病理樣本NAC 后，緩解組與未緩解組Ktrans、Kep、Ve、Vp 比較

NAC 后，緩解組post-Ktrans、post-Kep、post-Ve、post-Vp 均明顯低于未緩解組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間化療前后參數(shù)差值ΔKtrans、ΔVe、ΔVp差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但緩解組ΔKep明顯低于未緩解組（P＜0.05）（表2）。

表2 腫瘤病理樣本NAC 后，緩解組與未緩解組參數(shù)比較

2.4 DCE-MRI 定量參數(shù)診斷腫瘤壞死率的效能比較

分別以NAC 后定量參數(shù)和化療前-后參數(shù)差值繪制ROC 曲線（圖3）。結(jié)果表明，化療后參數(shù)評估效能優(yōu)于化療前-后參數(shù)差值，post-Ktrans、post-Kep、post-Ve、post-Vp以及ΔKep可以有效區(qū)分腫瘤病理樣本緩解和未緩解，其中post-Ktrans具有最高的診斷效能，最佳臨界值為0.663/min，AUC 為0.745，其靈敏度為89.83%，特異性為52.24%。以上結(jié)果說明，反映即時骨肉瘤TNR 情況，同一時間點DCE-MRI 參數(shù)比化療間期參數(shù)變化量更有參考價值。

圖3 ROC 曲線

3 討論

骨肉瘤化療一線藥物多為細(xì)胞毒性藥物，NAC 后骨肉瘤細(xì)胞壞死增多，并新生大量骨化成分，腫瘤組織內(nèi)微血管減少，細(xì)胞外間隙增大，微循環(huán)速度減慢，因此DCE-MRI 對比劑藥代動力學(xué)情況隨之改變[16-19]。DCE-MRI 具有實時、無創(chuàng)、可重復(fù)的優(yōu)點，能夠有效反映腫瘤血管的通透性和腫瘤組織的血液灌注并進(jìn)行定量評估，在腫瘤療效評價方面已有諸多報道[6-15]。當(dāng)化療有效時，腫瘤組織內(nèi)微血管生成減少，成熟度增加，瘤細(xì)胞壞死增多，細(xì)胞外間隙增大，故Ktrans、Ve、Vp值降低，Kep值相應(yīng)升高，本研究結(jié)果與既往研究一致[16-18]。

本課題組前期研究結(jié)果也顯示，DCE-MRI 可以較好預(yù)測骨肉瘤NAC 的療效，化療后Ktrans值對化療反應(yīng)的預(yù)測能力最高，AUC 為0.943，敏感性、特異度分別達(dá)到了80.0% 和100%，證明DCE-MRI 對預(yù)測骨肉瘤NAC 療效有一定價值[20]。Guo 等[21]針對69例接受NAC 的骨肉瘤患者的研究表明，Ktrans、Vp、kep值在有反應(yīng)組和無反應(yīng)組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，化療后有反應(yīng)組Ktrans、Kep、Ve、Vp值均明顯降低（TNR≥90%），說明DCE-MRI 參數(shù)可以反映病灶組織學(xué)改變。同時采用Kaplan-Meier 模型預(yù)測患者無事件生存期，發(fā)現(xiàn)化療前低Ktrans和低Ve值患者的無事件生存期更長，其中Ve值具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02），此外化療前Ve值與總生存天數(shù)也有明顯相關(guān)性（P=0.03），為預(yù)測NAC 反應(yīng)良好組無事件生存期和總生存天數(shù)提供依據(jù)。該團(tuán)隊曾報道采用DCE-MRI 評估貝伐單抗治療骨肉瘤療效的研究，發(fā)現(xiàn)用藥后Ktrans及Vp隨時間延長動態(tài)下降，低Ktrans和Vp值與更長的無事件生存期具有相關(guān)性（P=0.034）[22]。

雖然DCE-MRI 評估腫瘤療效及判斷預(yù)后效能較高，但DCE-MRI 大量的數(shù)據(jù)測量涉及ROI 的選取，上述大部分研究采用在腫瘤最大層面選取整個病灶作為感興趣區(qū)，而骨肉瘤異質(zhì)性明顯，難以將壞死、囊變、鈣化、出血及肉眼可見瘤血管等區(qū)域剔除，大范圍ROI 所得到參數(shù)為平均值，并不能真實反映各區(qū)域腫瘤組織信息，均會影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性[16-18，20-22]。因此，本研究依據(jù)骨肉瘤TNR 評估標(biāo)準(zhǔn)和方法，采用影像-病理位置匹配的方法，確定與瘤段切片最為接近的DCE-MRI 矢狀位影像層面，將病灶劃分成大小為1 cm×1 cm 的ROI，嚴(yán)格進(jìn)行化療前、化療后影像ROI 與病理樣本匹配，能夠更細(xì)致反映每個組織塊的壞死率與定量參數(shù)之間的關(guān)系[5]。結(jié)合ROC 曲線效能評價，發(fā)現(xiàn)與手術(shù)切除的腫瘤TNR 結(jié)果對照，NAC后DCE-MRI 參數(shù)較NAC 前后參數(shù)差值評價TNR效果更佳，其中化療后Ktrans的評價效能最高。故應(yīng)用DCE-MRI 評價即時腫瘤壞死情況有一定臨床價值。

本研究結(jié)果表明，與獲取腫瘤病理檢測結(jié)果時間點最相近的全程N(yùn)AC 后術(shù)前定量DCE-MRI 參數(shù)能夠更準(zhǔn)確地評估療效。說明近乎同一時間點的影像—病理對照具有更好的可比性。有研究表明腫瘤NAC療程間期DCE-MRI 參數(shù)改變與療效評估和生存期預(yù)測具有相關(guān)性，但是NAC 間期無法通過有創(chuàng)手術(shù)取材檢測TNR[20-22]。本研究結(jié)果或可打破這一局限，DCE-MRI 具有即時無創(chuàng)評估骨肉瘤腫瘤壞死情況的應(yīng)用潛力，有助于及時調(diào)整化療方案，制定個體化治療決策。

本研究的局限性：1）納入分析的病例數(shù)相對較少，病理組織樣本分布不均，可能會對分析結(jié)果有一定程度的影響，因此還需要擴(kuò)大病例數(shù)及病理組織樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究；2）骨肉瘤異質(zhì)性明顯，NAC 后病理改變更復(fù)雜，骨肉瘤新輔助化療后定量DCE-MRI 參數(shù)與腫瘤亞型、化療方案、治療時間等的關(guān)系有待更深入的研究。

綜上所述，DCE-MRI 通過對Ktrans、Kep、Ve、Vp值的測量來監(jiān)測骨肉瘤對NAC 的療效，提供常規(guī)MRI 不能提供的信息，毋庸置疑是骨肉瘤非常有潛力的療效監(jiān)測手段，但是其實施、參數(shù)設(shè)置及數(shù)據(jù)分析尚未得到統(tǒng)一，需進(jìn)一步研究。