包玲鳳，楊群輝，張 慶，施竹鳳，楊明英，楊濟達，朱紅業(yè)，何永宏，楊佩文

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明 650201； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205)

【研究意義】草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemarie)是姜科(Zingiberaceae)豆蔻屬(Amomum)多年生草本植物，主要分布在云南省、廣西省、貴州省等熱帶和亞熱帶高海拔陰暗潮濕地區(qū)[1-2]。云南是草果主產(chǎn)區(qū)之一，其種植面積占全國總面積的95%以上[3-4]。草果不僅是一味常用的可食用香料，還可用于治療瘧疾、消化不良、腹痛惡心等病癥，具有生物和藥理活性，其揮發(fā)油具有開發(fā)植物源殺菌劑的潛力[5-6]。由于草果生長環(huán)境條件的特殊性和局限性，以及劇增的市場需求量，使得野生草果種質(zhì)資源急劇減少，目前主要依賴人工林下栽培種植。在草果種植業(yè)的發(fā)展中，由于受自然氣候條件的影響，以及種植管理模式等方面的不足，導致草果各類病蟲害的問題日益凸顯?！厩叭搜芯窟M展】已有研究表明，云南省藥用植物栽培區(qū)的草果病害種類主要有線蟲、葉斑病[7]、葉瘟病[8]、疫病[9]和萎蔫病[10]等。2013年，林麗飛等[11]首次報道了寄生于云南草果根際土壤的2種環(huán)科線蟲。目前，國內(nèi)外關于草果真菌性葉部病害的研究報道還較少。2005年，張云霞等[7]首次報道了由姜葉點霉(Phyllostictazingiberi)引起云南省紅河州屏邊縣草果葉斑病，并對病原物的形態(tài)結構作了詳細描述，隨后研究者們又針對該病害提出了科學有效的化學防治措施[12]。草果葉斑病與姜葉斑病在癥狀上十分相似，僅在病原菌分生孢子大小上稍有區(qū)別。2013年，章一鳴等[8]首次發(fā)現(xiàn)了綠春縣草果種植區(qū)內(nèi)由變異梨孢(PyriculariavariabilisBus-saban)引起的一種侵染性病害，并將其命名為葉瘟病。【本研究切入點】目前，國內(nèi)外尚未有關于炭疽屬(Colletotrichumsimmondsii)對草果危害的研究報道，雖有變異梨孢(P.variabilisBus-saban)侵染草果引起葉瘟病、姜葉點霉(P.zingiberiHori)侵染草果引起葉斑病的研究報道，但研究者們僅對該病害的癥狀、病原物形態(tài)及發(fā)生危害情況作了描述，并未對病原物的詳細分類信息和生物學特性進行系統(tǒng)鑒定分析?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過對草果真菌性葉斑病3種病原菌進行單孢分離培養(yǎng)、致病性測定、形態(tài)學觀察、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析以及測定其生物學特性，明確3種病原物的組成及其詳細分類，探索病害發(fā)生過程和流行的環(huán)境因子，為草果葉部病害的進一步研究和防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從云南省怒江傈僳族自治州福貢縣草果種植基地(98°80′76″E、27°04′67″N)采集典型病樣，保存至冰盒內(nèi)帶回實驗室。通過組織分離法獲得單孢菌株CG-N01、CG-N02、CG-N03，菌株保存于云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所。試驗儀器包括一次性培養(yǎng)皿、無菌操作臺、酒精燈、手術刀、鑷子、Nikon Eclipse E200熒光生物顯微鏡等。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病性測定 據(jù)柯赫氏法則，選擇草果健康新鮮的葉片，通過無傷接種法接種帶菌菌餅，無菌水處理作為空白對照，于恒溫培養(yǎng)箱中(25 ℃)保濕培養(yǎng)，定期觀察并記錄草果葉片發(fā)病情況，每個處理4次重復。培養(yǎng)至病癥顯現(xiàn)，再次采用組織分離法分離發(fā)病部位病斑上的病原物。

1.2.2 形態(tài)特征觀察 在無菌條件下，取純化后的單孢菌餅(5 mm)接種至PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫避光培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待菌落形成，觀察并記錄。菌株產(chǎn)孢后，在Nikon Eclipse E200熒光生物顯微鏡下觀察病原菌的產(chǎn)孢結構和分生孢子的形態(tài)，并測量大小。

1.2.3 多基因系統(tǒng)發(fā)育分析 DNA提取參照試劑盒進行，采用真菌通用引物擴增rDNA-ITS[13]、β-tubulin(tub2)[14]、LSU[15]、tef-1α[16]片段。PCR反應體系(30 μL)：10 mmol/L 10×PCR buffer 3.0 μL、2 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μLTaq酶0.5 μL、10 mmol/L正向引物和反向引物各1.0 μL、DNA模板1.5 μL，ddH2O 21.0 μL。rDNA-ITS反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保溫。LSU反應程序：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。tub2反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保溫。tef-1α反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火55 s，72 ℃延伸90 s，10個循環(huán)；94 ℃變性30 s，53 ℃退火55 s，72 ℃延伸90 s，36個循環(huán)，72 ℃ 延伸7 min，4 ℃保溫。所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，并在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察，回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比較分析，選擇參比菌株，通過軟件MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 生物學特性測定 以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別測定不同溫度、光照、pH對病原菌生長的影響。溫度共設置9個梯度：5、10、15、20、25、28、30、32、35 ℃； pH設置8個梯度：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0；光照設置：25 ℃ 24 h全暗、12 h光照/12 h黑暗、24 h光照。在無菌條件下，將純化后的單孢菌餅(5 mm)接種至平板中央，培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑，培養(yǎng)15 d后計數(shù)各處理的孢子數(shù)，每個處理重復4次。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

使用軟件Excel 2021整理數(shù)據(jù)；軟件SPSS 18進行方差分析，Duncan進行差異顯著性檢驗，P<0.05為顯著性差異；采用Sigma Plot 12.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀與致病性測定

采用單孢培養(yǎng)法分離培養(yǎng)采集到的11份草果葉部病害樣品，最終獲得純化單孢菌株3株，分別將其編號為CG-N01、CG-N02、CG-N03。致病性測定試驗結果表明， 3株病原菌均能侵染草果，并引起健康草果植株發(fā)病，且病害癥狀與田間病狀相一致。據(jù)柯赫氏法則，菌株CG-N01被確定為草果葉瘟病致病菌(圖1-A，1-D)，菌株CG-N02被確定為草果葉斑病致病菌(圖1-B，1-E)。草果健康葉片接種CG-N03菌株并感病后，發(fā)病初期葉片出現(xiàn)近似圓形或不規(guī)則的病斑，中央呈白色、凹陷，邊緣褐色，發(fā)病后期較嚴重時，病斑有穿孔，葉片逐漸褪色且邊緣枯黃萎縮；當培養(yǎng)環(huán)境相對潮濕時，病斑表面橙黃色小點逐漸變?yōu)楹谏↑c，即病原菌的分生孢子堆。這與田間發(fā)病癥狀一致(圖1-F)，從接種發(fā)病部位可再分離得到先前的接種菌，空白對照見圖1-G。根據(jù)以上結果，可初步將純化單孢菌株CG-N03確定為草果炭疽病致病菌。

2.2 病原菌鑒定結果

2.2.1 形態(tài)特征觀察 由圖2可知，菌株CG-N03于25 ℃避光培養(yǎng)5 d后，病原菌落呈圓形，菌落中心呈橙黃色，周圍呈灰色，邊緣淺褐色，氣生菌絲濃密呈絨毛狀，具明顯輪紋；背面中心處呈橙黃色，周圍呈淺褐色，邊緣深褐色，菌落直徑4.75～5.45 cm(圖2-I，2-J)；培養(yǎng)15 d后，菌落表面形成少量橙黃色小點(分生孢子堆)，呈不規(guī)則排列，無特殊氣味；菌株CG-N03的成熟分生孢子呈無色透明梭形，分生孢子內(nèi)有油滴3～5個，大小(8.37～14.14)μm ×(4.19～5.60)μm，孢子平均大小為11.04 μm×4.25 μm；分生孢子梗單生，不分枝，越靠近頂端顏色越淺，基部呈褐色；草果葉片接種病原菌并發(fā)病時，菌株CG-N03在葉表面產(chǎn)生黑色小點(分生孢子)，其形態(tài)大小與純化菌株培養(yǎng)結果一致(圖2-K，2-M)。綜上，可將單孢菌株CG-N03初步確定為炭疽屬(C.simmondsii)。

2.2.2 分子生物學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進化樹 菌株CG-N01的rDNA-ITS、LSU和tef-1α的目的基因片段分別為489 bp(登錄號：MN596209)、901 bp(登錄號：MN689811)和475 bp(登錄號：MN696687)，菌株CG-N02的rDNA-ITS、LSU和tef-1α的目的基因片段分別為517 bp(登錄號：MN596212)、997 bp(登錄號：MN650644)和529 bp(登錄號：MN696686)，菌株CG-N03的rDNA-ITS、LSU和tef-1α的目的基因片段分別為560 bp(登錄號：MN596210)、926 bp(登錄號：MN650645)和738 bp(登錄號：MN696688)。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫中相關種屬基因序列比較分析后，菌株CG-N01、CG-N02和CG-N03分別與梨孢屬(Pyriculariacostina)、莖點霉屬(Phomamatteuciicola)和炭疽屬(C.simmondsii)具較高同源性，挑選親緣性較高的菌株作為參比菌株，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖3～5)。

菌株CG-N01-ITS(Accession No. MN596209)、CG-N01-LSU(Accession No. MN689811)、CG-N01-EF1(Accession No. MN696687)分別與參比菌株PyriculariacostinaCMUZP0003(Accession No. AY265329)、PyriculariaoccidentalisCBS 365.90(Accession No. MH873902)、PyriculariaborealisCBS 461.65(Accession No. KM009198)的相似性達98.77%、99.33%、96.83%；結合形態(tài)特征鑒定結果，可將單孢菌株CG-N01鑒定為梨孢屬(P.costina)。菌株CG-N02-ITS(Accession No. MN596212)、CG-N02-LSU(Accession No. MN650644)、CG-N02-EF1(Accession No. MN696686)分別與參比標準菌株PhomamatteuciicolaWYJYKDS239(Accession No. MH368529)、PhomamatteuciicolaWYJYK03(Accession No. MK287844)、Phomasp. FJ-2(Accession No. KJ669188)的相似性達99.80%、99.78%、99.43%；結合形態(tài)特征鑒定結果，可將單孢菌株CG-N02鑒定為莖點霉屬(P.matteuciicola)。菌株CG-N03-ITS(Accession No. MN596210)、CG-N03-LSU(Accession No. MN650645)、CG-N03-BT(Accession No. MN696688)分別與參比標準菌株ColletotrichumsimmondsiiBRIP 28519(Accession No. GU183354)、ColletotrichumsimmondsiiCBS 122122(Accession No. MH874724)、ColletotrichumsimmondsiiBRIP 28519(Accession No. GU183289)的相似性達99.82%、99.78%、97.29%；結合形態(tài)特征鑒定結果，可將單孢菌株CG-N03鑒定為炭疽屬(C.simmondsii)。

2.3 菌株生物學特性測定

2.3.1 溫度對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 由圖6可知，當溫度在10～35 ℃時，CG-N01、CG-N02和CG-N03菌株菌絲均能正常生長，并且形成分生孢子；當培養(yǎng)溫度≤10 ℃時，菌株CG-N01和CG-N02菌絲不再生長，且無分生孢子形成，菌株CG-N03菌絲能正常生長但產(chǎn)孢量較少；當培養(yǎng)溫度≥35 ℃時，菌株CG-N01菌絲不能正常生長且無分生孢子形成。菌株CG-N01菌絲生長和孢子形成的最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，菌落直徑和產(chǎn)孢量分別為3.45 cm和2.30×107/(spore·mL)；菌株CG-N02和CG-N03菌絲生長和孢子形成的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，菌落直徑分別為4.52、5.06 cm，產(chǎn)孢量分別為3.56×107、3.81 ×107/(spore·mL)。

2.3.2 pH對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 如圖7所示，當pH介于4.0～11.0時，菌株CG-N01、CG-N02和CG-N03能正常生長和產(chǎn)孢。菌株CG-N01在pH 6.0時菌落直徑最大，產(chǎn)孢量最高，分別為3.78 cm和1.66×107/(spore·mL)；菌株CG-N02 在pH 7.0、pH 8.0時菌落直徑最大，分別為5.27、5.15 cm，pH 7.0時產(chǎn)孢效果最好，為4.42×107/(spore·mL)；菌株CG-N03在pH 6.0～8.0時菌落直徑最大，為4.42～5.31 cm，pH 7.0時產(chǎn)孢量最高，為3.49×107/(spore·mL)。菌株CG-N01最適培養(yǎng)pH 6.0，菌株CG-N02和CG-N03最適pH為7.0。

2.3.3 光照對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 由表1可知，光照對CG-N01、CG-N02和CG-N03 3株病原菌菌絲生長影響較大，對CG-N01產(chǎn)孢量無明顯影響，對CG-N02和CG-N03產(chǎn)孢量影響顯著。其中，光照黑暗交替(12 h光照/12 h黑暗)和全光照條件下菌株CG-N01菌絲生長和產(chǎn)孢量最佳，菌落直徑分別為3.53和3.47 cm，產(chǎn)孢量分別為1.67×107、1.62×107/(spore·mL)；全黑暗條件下，菌株CG-N02菌絲生長最快，菌落直徑為4.53 cm，而光照黑暗交替其分子孢子萌發(fā)率最高，產(chǎn)孢量為4.31×107/(spore·mL)；全光照條件和光照黑暗交替(12 h光照/12h黑暗)條件下菌株CG-N03菌絲生長最快，菌落直徑分別為5.32和5.19 cm，光照黑暗交替條件則有利于其分生孢子形成，產(chǎn)孢量為4.81×107/(spore·mL)。

3 討 論

炭疽屬(C.simmondsii)是一類重要的植物致病菌，其寄主范圍較廣，可危害辣椒[17]、草莓[18-19]、芹菜[20]、紅花[21]等經(jīng)濟作物和油料作物，炭疽病感染植株后表現(xiàn)癥狀一般為葉斑、葉枯等，病情嚴重時直接影響其產(chǎn)質(zhì)量。本研究中通過分析測試將炭疽屬(C.simmondsii)確定為草果炭疽病病原物，這也是國內(nèi)外關于炭疽屬侵染草果并引起炭疽病的首次研究報道。章一鳴等[8]發(fā)現(xiàn)姜葉點霉(P.zingiberiHori)能侵染草果并導致葉斑病，張云霞等[7]報道了變異梨孢(P.variabilisBus-saban)引起草果葉瘟病，筆者從具有典型病狀草果植株葉片上分離到病原物，并通過致病性測定和分子生物學鑒定，明確梨孢屬(P.costina)和莖點霉屬(P.matteuciicola)能分別侵染草果健康葉片組織，并引起葉瘟病、葉斑病。目前，國內(nèi)外有關于梨孢屬、莖點霉屬和炭疽屬生物學特性的研究尚未見報道，在致病菌株生長和產(chǎn)孢的最佳條件方面，不同菌株的生物學特性存在一定的相似性和差異性，為破解此類疑惑還需進一步研究探索。

rDNA-ITS基因序列在真菌種屬系統(tǒng)學中的廣泛運用，為病原真菌相關物種的分類鑒定及系統(tǒng)進化分析提供了強有力的證據(jù)。但rDNA-ITS也存在一定的局限性，由于絕大多數(shù)的近緣種或集合種構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹在某些關鍵節(jié)點上的支持率較低，不能準確識別和分類鑒定[22]。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，研究者們對病原物的分類鑒定不再只依賴于單基因系統(tǒng)發(fā)育分析，多基因序列分析(Multigene sequence analysis)已成為植物病原菌分類鑒定可信度較高的技術手段[23]。李河等[24]采用形態(tài)學鑒定和rDNA-ITS、CAL和GAPDH多基因譜系分析方法對油茶炭疽病病原物進行分類鑒定，結果表明分離得到的23株病原菌均為果生刺盤孢菌(C.fructicola)，為油茶炭疽病的系統(tǒng)防治提供了科學依據(jù)。為對海南橡膠樹炭疽菌復合群進行種屬的詳細分類鑒定，林春花等[25]運用rDNA-ITS、CHS-1、GAPDH、ACT、GS和Ap MAT 6個基因序列進行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，為膠孢炭疽菌的分類鑒定提供了理論依據(jù)。代永東等[26]結合nr SSU、LSU、tef-1α、rpb1、rpb2 多基因序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中棒束孢屬(Isaria)及近緣物種的分子序列，對棒束孢屬進行系統(tǒng)發(fā)育分析，明確相關種屬間的差異性和相似性，為此類微生物的分類鑒定提供充足的科學依據(jù)。本研究采用rDNA-ITS、LSU、tub2和tef-1α 4個基因序列對分離自草果植株葉部病害標樣進行多基因序列分析，快速準確地了解病原物的詳細分類信息，為此類病原物的分類鑒定提供充足的理論基礎。

表1 不同光照條件下菌株菌絲生長和產(chǎn)孢結果

據(jù)梨孢屬、莖點霉屬和炭疽屬生物學特性測定結果表明，在黑暗潮濕條件下可促進菌株菌絲生長和分生孢子形成，說明此類環(huán)境有利于草果葉瘟病、葉斑病和炭疽病的發(fā)生流行，濕潤多雨是此類病害為害的主要環(huán)境因子。怒江傈僳族自治州屬于低緯高原季風氣候，具有獨特的立體氣候條件，濕潤多雨，適宜梨孢屬、莖點霉屬和炭疽屬生長繁殖，因此草果各類葉部病害發(fā)生流行的潛在危險性較高。草果多生長于溫暖潮濕且避陰的山區(qū)氣候環(huán)境，而陰暗的環(huán)境條件又有利于莖點霉屬和炭疽屬分生孢子的快速萌發(fā)，郁閉度較高的區(qū)域有利于草果葉部病害的發(fā)生流行。綜上，應合理控制草果植株的種植密度，調(diào)整適宜的郁閉度，保持草果種植地透光通風率，加強排水管理，定期清除種植地塊內(nèi)的病枯葉，減少病原菌的侵染源；增施有機肥，草果植株生長旺盛，增強植株抗病抗逆性能。草果葉片被侵染發(fā)病時，大部分病原物從氣孔處開始侵染，嚴重時整個葉片枯黃脫落，甚至植株死亡，對草果植株的老葉造成嚴重損害，而新葉發(fā)病率在感病初期相對較低，后期較為嚴重[27]，這與本研究室內(nèi)草果致病性測定結果相一致。在草果種植過程中，夏季高溫多雨，土壤水分較高，此時草果生長旺盛，但也是葉部病害高發(fā)期，因此很有必要通過控制草果的種植密度和苗圃的溫濕度，提高植株間的透光性和通風能力，可在草果葉片、花序上噴灑一定量0.5%的波爾多液保護植株[28]；必要時需科學合理的噴灑殺菌藥劑，如代森鋅、百菌清、多菌靈等[29]，預防病害的發(fā)生流行，保證草果種植產(chǎn)業(yè)的綠色穩(wěn)定發(fā)展。

4 結 論

通過形態(tài)學與分子生物學鑒定，確定云南草果葉瘟病致病菌為梨孢屬，葉斑病致病菌別為莖點霉屬和炭疽屬。病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢明顯受溫度、pH和光照條件影響。