劉海成,程金平,馮培媛,劉曉剛,馬嘉欣,田普江,田 蕾,李培富

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

【研究意義】鐵是人體中參與氧的運(yùn)輸和存儲(chǔ)、參與細(xì)胞色素和某些金屬酶的合成、維持正常造血功能等新陳代謝中的重要元素，其中65%的鐵以血紅蛋白的形式存在紅細(xì)胞中，10%的鐵以肌紅蛋白和酶的形式存在肌肉中，其余的鐵存在于肝、脾等組織器官中[1]。人體缺鐵會(huì)導(dǎo)致貧血、呼吸急促、心跳加速以及嗜睡等微量元素缺失綜合征[2]。水稻是世界上食用人口最多的主食，也是能量和營(yíng)養(yǎng)的來(lái)源之一[3]。鐵元素在水稻細(xì)胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近幾年來(lái)，水稻籽粒礦質(zhì)元素含量研究成為了國(guó)內(nèi)外水稻研究的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)已表明，水稻體內(nèi)鐵含量主要受遺傳控制[6]。已有研究表明，水稻不同部位鐵含量不同，并且水稻鐵含量受基因的加性效應(yīng)和非加性效應(yīng)影響，主要以加性效應(yīng)為主[7]。王輝[8]以“京香1號(hào)/寧農(nóng)黑粳”為親本雜交再自交獲得的F2為材料，將控制水稻鐵含量的QTL定位在3、4、5、7和9號(hào)染色體上，并且位于4號(hào)染色體的3個(gè)QTL在相鄰的區(qū)段內(nèi)。黃瑩瑩等[9]也得出6號(hào)染色體上的QTL具有此特點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鐵含量是受多基因控制的數(shù)量性狀。挖掘控制鐵含量的QTL是富鐵水稻選育的基礎(chǔ)，對(duì)改善水稻品質(zhì)具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選用鐵含量差異較大的兩個(gè)材料作為親本進(jìn)行雜交再自交獲得124個(gè)RIL家系，從后代籽粒所含鐵含量入手，研究其遺傳規(guī)律，采用SSR標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，進(jìn)行鐵含量的QTL定位。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)以“寧農(nóng)黑粳”(鐵含量46.23 mg/kg)為母本，“高粱稻-1”(鐵含量14.32 mg/kg)做父本，構(gòu)建以“寧農(nóng)黑粳/高粱稻-1”雜交再自交培育出的F6重組自交系124 個(gè)株系為材料。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn) 于2019年4月14日育秧。5月15日種植在寧夏大學(xué)繁殖基地。每個(gè)家系采用單株插秧，每行10株，行長(zhǎng)1.2 m，行距0.3 m，株距0.1 m，其田間管理同大田管理。在分蘗期進(jìn)行田間取樣，每個(gè)家系取2片新鮮葉片進(jìn)行DNA的提取，等植株到完熟期時(shí)，進(jìn)行籽粒的收獲，供表型的測(cè)定。

1.2.2 水稻糙米中鐵含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與測(cè)定 將1 mL鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)準(zhǔn)確吸入于100 mL容量瓶中，然后用1%的稀硝酸定容，配制成10 μg/mL母液備用。準(zhǔn)確吸取0、1、2、4、6、8 mL的母液到6個(gè)50 mL棕色容量瓶中，再以1%的稀硝酸定容，配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻待測(cè)。

水稻糙米中鐵含量的測(cè)定參照王輝[8]的方法，按照 Z-2000 型原子吸收分光光度計(jì)的操作要求，打開儀器，設(shè)置測(cè)定條件，打開真空泵和乙炔氣并調(diào)整氣壓，點(diǎn)火調(diào)零。以 1%的稀硝酸為空白對(duì)照，依次按上述溶液進(jìn)樣，測(cè)定樣品的吸光值。利用 Microsoft Excel 2010以鐵濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 將所測(cè)數(shù)據(jù)輸入到Microsoft Excel 2010 中，計(jì)算鐵含量，并計(jì)算3個(gè)重復(fù)的平均值，利用 SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行鐵含量的統(tǒng)計(jì)分析。具體計(jì)算方法如下：

Fe=ppm×v/w×10-4

式中，ppm是在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品液濃度；v是樣品制備成溶液的體積；w是樣品重量(g)；10-4是將ppm換算成百分含量的應(yīng)乘因數(shù)。

1.2.4 DNA的提取、PCR擴(kuò)增及染色 利用簡(jiǎn)化的CTAB法進(jìn)行葉片DNA的提取。PCR反應(yīng)體系總計(jì)20 μL，DNA 2 μL，ddH2O 13.7 μL，10×DNATaqbuffer 2 μL，dNTP 0.4 μL， SSR 引物1.5 μL，Taq酶0.4 μL。具體PCR程序與染色參照Sun等[10]的方法。

1.2.5 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位 根據(jù)3.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，讀取F6群體帶型，與“寧農(nóng)黑粳”一樣的讀2，與“高粱稻-1”一樣的讀0，雜合的讀1，缺失讀-1。利用QTL iciMapping 3.0軟件進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL定位，QTL命名按照McCouch等[11]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F6群體的鐵含量表現(xiàn)

通過(guò)Z-2000型原子吸收分光光度計(jì)對(duì)水稻糙米鐵含量的測(cè)定，結(jié)果(表1)表明親本的鐵含量分別為46.23和14.32 mg/kg，雙親鐵含量差異較大，F(xiàn)6群體鐵含量平均為18.53 mg/kg。對(duì)F6群體鐵含量進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)并對(duì)最大值、最小值和標(biāo)準(zhǔn)差等基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析。結(jié)果(圖2)表明F6代群體中鐵含量呈正態(tài)的單峰連續(xù)分布，介于親本之間且偏向于“高粱稻-1”，說(shuō)明水稻籽粒鐵含量是受多基因控制的數(shù)量性狀。

表1 親本及F6群體的鐵含量

2.2 引物多態(tài)性的篩選與遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

通過(guò)上網(wǎng)查詢已經(jīng)公布的水稻分子遺傳圖譜和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的1558 對(duì)SSR標(biāo)記在“寧農(nóng)黑粳”和“高粱稻-1”之間篩選多態(tài)性，共獲得多態(tài)性引物130對(duì)，多態(tài)率為8.34%，引物多態(tài)性數(shù)目較少，多態(tài)率偏低，是因?yàn)榇嗽囼?yàn)所運(yùn)用的材料是雙親都為粳稻的雜交組合后代群體，遺傳背景相似所導(dǎo)致的。由表2可知，其中第8號(hào)染色體擴(kuò)增的引物數(shù)最多為14對(duì)，多態(tài)率8.19%；第4號(hào)染色體擴(kuò)增引物最少為8對(duì)，多態(tài)率僅有5.8%，其他染色體擴(kuò)增引物數(shù)相對(duì)均勻(9～12對(duì))，其中第10號(hào)染色體多態(tài)率最高為10.28%。本試驗(yàn)選擇雙親間有多態(tài)，擴(kuò)增效果好，條帶清晰的SSR引物，共計(jì)130對(duì)，用于“寧農(nóng)黑粳/高粱稻-1” F6群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。

2.3 SSR引物在F6群體中的分離

選取多態(tài)性較好的130個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行3.6%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳完成后在凝膠成像儀上進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)(圖3)。與母本“寧農(nóng)黑粳”帶型相同的記作A，與父本“高粱稻-1”帶型相同的記作B，雙親雜合帶型記作H,模糊不清或者缺失的記作-。

2.4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

利用 QTL iciMapping 3.0軟件對(duì)130對(duì)SSR引物劃分連鎖群，根據(jù)每個(gè)SSR引物之間交換率，計(jì)算各標(biāo)記間的連鎖遺傳距離，繪制連鎖遺傳圖譜。構(gòu)建了一張包含130個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜(圖4)，覆蓋了水稻全基因組1209.77 cM，平均為9.31 cM。除第4號(hào)染色體(8對(duì)SSR)和第8號(hào)染色體(14對(duì)SSR)外，其他染色體的標(biāo)記分布均勻(9～12對(duì)SSR)。在整個(gè)遺傳連鎖圖譜中，最小和最大

表2 檢測(cè)的親本間多態(tài)性標(biāo)記

遺傳距離的表現(xiàn)在第3號(hào)染色體上，標(biāo)記RM8203和RM8267之間是最小的距離為0.44 cM，標(biāo)記RM8277與RM7117之間是最大的距離達(dá)42.94 cM，基本滿足 QTL 定位的要求。

2.5 水稻糙米鐵含量的QTL定位分析

利用所繪制出的遺傳連鎖圖譜和 QTL iciMapping 3.0 軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，LOD值為2.5對(duì)控制水稻籽粒鐵含量的QTL進(jìn)行定位。有3個(gè)QTL位于第1、8和12號(hào)染色體上(表3)，分別命名為qFe1、qFe8和qFe12，其貢獻(xiàn)率在14.31%～18.44%，其中第1和8號(hào)的QTL加性效應(yīng)為負(fù)值，第12號(hào)染色體的QTL加性效應(yīng)為正，而貢獻(xiàn)率最高qFe8增效基因來(lái)自鐵含量高的親本“寧農(nóng)黑粳”。運(yùn)用 ICIM-ADD 的復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)控制水稻籽粒鋅含量的主效 QTL 進(jìn)行區(qū)間作圖(圖5)，對(duì)富鐵水稻育種有一定的指導(dǎo)意義。

表3 “寧農(nóng)黑粳/高粱稻-1” F6群體鐵含量QTL定位結(jié)果

3 討 論

3.1 水稻籽粒鐵含量的遺傳分析

鐵作為人體生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的礦質(zhì)元素之一，其在水稻籽粒中的含量研究備受青睞。孫明茂[12]利用“龍錦1號(hào)/香軟米1578”為組合繁育的F3代196個(gè)株系為材料，用原子吸收光譜法測(cè)定其含量和頻率分布，研究表明后代鐵含量平均值為35.1 mg/kg且介于兩親本之間，表現(xiàn)出連續(xù)的正態(tài)分布。崔文剛[13]對(duì)“香黑糯195/中花紫香糯”作親本雜交的F2代188個(gè)群體為試驗(yàn)材料，用原子吸收光譜法測(cè)定了鐵含量，結(jié)果表明水稻籽粒鐵元素的含量出現(xiàn)偏低親本的偏態(tài)分布。鐘林[14]以“川香29B/Lemont”為親本衍生的184個(gè)RIL群體為研究對(duì)象，利用全普直讀等離子光譜儀測(cè)定了鐵含量并發(fā)現(xiàn)，鐵含量呈連續(xù)變異。黃瑩瑩等[9]分析了“紅香1號(hào)/松98-131”F3代鐵含量，研究表明籽粒含量介于兩者之間呈正態(tài)分布且表現(xiàn)出明顯的雙向超親分離現(xiàn)象。本研究以“高粱稻-1/寧農(nóng)黑粳”的124個(gè)F6代為研究對(duì)象，采用原子吸收光譜法測(cè)定鐵含量，其“高粱稻-1”為14.32 mg/kg，“寧農(nóng)黑粳”為46.23 mg/kg，后代平均為18.87 mg/kg。對(duì)124 個(gè)株系做正態(tài)分布檢驗(yàn)，表明鐵含量偏向低值親本且呈正態(tài)分布。此結(jié)果與前面所述學(xué)者研究結(jié)果基本相符。因此可推斷鐵含量受多基因控制的數(shù)量性狀。

水稻籽粒鐵含量與稻米顏色、水稻品種等存在一定的聯(lián)系。Koh等[15]研究表明，黑米色素沉積性狀隨著水稻中鐵含量增加而增加。呂文英[16]研究發(fā)現(xiàn)，水稻籽粒中鐵含量與粒色有一定的相關(guān)性，黑米鐵含量最高，紅米次之。Gregorio等[17]研究發(fā)現(xiàn)，水稻香味與鐵含量有一定的相關(guān)性。而Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，精米中鐵含量與食味值無(wú)顯著相關(guān)性。本研究選用的寧農(nóng)黑粳為黑米，其鐵含量較高，這一結(jié)果與前人結(jié)果[8]相似。因此利用稻米中鐵含量與米皮中色素的結(jié)合關(guān)系，可以通過(guò)米皮顏色的判斷來(lái)篩選富鐵種質(zhì)。這為在研究實(shí)踐中對(duì)富鐵水稻的初步篩選提供了依據(jù)，從而可以提高篩選效率。

3.2 水稻籽粒鐵含量的QTL定位分析

現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，合理的標(biāo)記數(shù)有利于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，當(dāng)標(biāo)記之間的遺傳距離為5和21 cM時(shí)被估計(jì)的QTL的位置和效應(yīng)結(jié)果無(wú)差異，遺傳距離太大或者太小都不利于檢測(cè)QTL[19-20]。研究[21]表明，遺傳連鎖圖譜的平均遺傳距離不超過(guò)20 cM為宜。本研究用“高粱稻-1/寧農(nóng)黑粳”的F6群體構(gòu)建了含有130 對(duì)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，覆蓋了水稻全基因組1209.77 cM，平均為9.31 cM，與上述學(xué)者所述基本吻合，適合用于QTL定位。

鐵作為水稻營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)生物體新陳代謝有不可替代的作用。因此對(duì)水稻籽粒鐵含量的QTL定位有重要意義。Dixit等[22]使用RP-Bio226/Sampada回交的BC2F5群體及108個(gè)SSR繪制出了2317.5 cM，平均標(biāo)記21.5 cM的遺傳連鎖圖譜，研究發(fā)現(xiàn)，控制鐵元素的QTL有2個(gè)，分別位于第1和第6號(hào)染色體上，LOD值在2.6～10，貢獻(xiàn)率在5.1%～17.1%。Norton等[23]使用Bala/Azucena雜交的RIL群體，利用164個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了一個(gè)覆蓋水稻12條染色體1833 cM的遺傳連鎖圖譜，對(duì)田間生長(zhǎng)的水稻群體的葉片和籽粒進(jìn)行了多元素分析，測(cè)定了控制鐵、鋅等17個(gè)礦質(zhì)元素的QTL,結(jié)果表明，在葉片中檢測(cè)到3個(gè)與鐵相關(guān)的QTL，分別位于1、3和6號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率分布范圍為10.4%～12.4%。Anuradha等[6]以Madhukar/Swarna衍生的RILs群體對(duì)控制水稻鐵含量的QTL進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)有7個(gè)控制鐵含量的QTL，位于第1、5、7和12號(hào)染色體，其中12號(hào)染色體RM17-RM260標(biāo)記的QTL貢獻(xiàn)率最高為71%，LOD值33.8。本實(shí)驗(yàn)中，共檢測(cè)到3個(gè)控制鐵的QTL，位于第1、8和12號(hào)染色體上，LOD值為2.5，貢獻(xiàn)率在14.31%～18.44%。在檢測(cè)到的3個(gè)QTL中，第1號(hào)染色體上RM5～RM488區(qū)間的qFe1與Anuradha等[6]檢測(cè)RM243～RM488和RM488～RM490的位置相近；第8號(hào)染色體qFe8的區(qū)間RM432～RM331與孫明茂[12]檢測(cè)到的區(qū)間RM547～RM72相鄰；位于12號(hào)染色體上的QTL在Anuradha等[6]檢測(cè)的RM17～RM7120區(qū)間內(nèi)。

4 結(jié) 論

本研究利用“寧農(nóng)黑粳”和“高粱稻-1”為親本雜交再自交獲得124個(gè)單株F6群體為材料，結(jié)合130個(gè)SSR(Simple sequence repeat)分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)3個(gè)與鐵含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別位于1、8、12號(hào)染色體。本研究未能在其他染色體上定位到相關(guān)的QTL，由于QTL受遺傳因素的影響，不同材料、不同條件下種植檢測(cè)到的QTL各不相同。因此，挖掘控制鐵的QTL對(duì)今后富鐵水稻育種提供了理論依據(jù)，為揭示水稻籽粒鐵含量的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。