羅歡歡，馮澤宇，李 捷，謝艷華，田惠玲，肖會敏，王四旺*，李志平

1.西北大學生命科學與醫(yī)學部，西安 710069；2.陜西漢王藥業(yè)股份有限公司，漢中 723000；3.空軍軍醫(yī)大學中藥與天然藥物教研室，西安 710032

強力定眩片(Qiangli Dingxuan Tablets，QLDXT)是陜西漢王藥業(yè)股份有限公司獨家生產的復方制劑，系由天麻、杜仲、杜仲葉、野菊花、川芎5味中藥組成， 該藥能擴張血管，降低血黏稠度，臨床療效顯著[1-4]。其目前臨床應用最多的適應證主要集中在各種原因所致的眩暈性疾病[5-6]。中藥藥代動力學可以揭示多成分之間的相互作用，是中藥化學與中藥藥效學研究之間的橋梁和紐帶，為中藥物效基礎研究中的關鍵一步[7-8]。

為保證QLDXT的安全性和規(guī)范臨床用藥，課題組前期對QLDXT中的化學成分作了物質歸屬，其主要成分包含黃酮類、有機酚酸類、揮發(fā)油類等。并用HPLC法建立了制劑的指紋圖譜和13種成分的含量測定，有關QLDXT藥代動力學尚未報道。為明確QLDXT在體內含量的經時變化，本實驗以相關文獻報道和課題組對制劑中13個代表成分的含量研究為基礎，用HPLC法對QLDXT的入血成分進行研究。

迄今為止，有關QLDXT的報道多集中于臨床研究，而其在體內以何種成分、何種形式發(fā)揮作用，至今尚屬空白。本試驗建立快速、靈敏的HPLC法，并用于QLDXT大鼠血漿中天麻素(gastrodin, GAS)和藁本內酯(ligustilide, LIG)的測定，為闡明其藥效物質基礎，深入研究人體藥動學以及設計合理的用藥方案提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030plus高效液相色譜儀(SHIMADZU公司)；BSA124S電子分析天平(德國Sartorius)；氮吹儀(天津恒奧科技有限公司)；快速渦旋混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 試藥

強力定眩片藥粉(批號279011-006009，陜西漢王藥業(yè)股份有限公司)。對照品：天麻素(質量分數≥98%，批號HR16313B1)、藁本內酯(質量分數≥98%，批號HL09355198)，均購自寶雞辰光生物科技有限公司。肝素鈉(蘇州亞科科技有限公司)；甲酸(天津大茂化工有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國Fisher公司。

1.3 動物

雄性SD大鼠，SPF級，體質量(220±50) g，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK(陜)2019-001。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lamdo Stamsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，3%～7% B；2～20 min，7% B；20～30 min，7%～12% B；30～90 min，12%～30% B)。檢測波長：220、280 nm，進樣量：30 μL；流速為0.7 mL·min-1；柱溫為30 ℃。

2.2 強力定眩片灌胃藥液的制備

精密稱取強力定眩片藥粉適量，置于潔凈燒杯中，加入超純水適量，超聲(功率250 W，頻率：40 kHz)混勻，即得0.42 g·mL-1的強力定眩片灌胃藥液。

2.3 混合對照品母液及系列對照品溶液的制備

取GAS、LIG對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為0.508 、1.236 mg·mL-1的混合對照品母液。精密吸取混合對照品母液加甲醇稀釋成7個系列對照品溶液(GAS質量濃度分別為101.6、50.8、25.4、12.7、6.35、5.29、3.18 μg·mL-1，LIG質量濃度分別為247.20、123.60、61.80、30.90、15.45、12.88、7.73 μg·mL-1)，置于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品處理

精密吸取血漿200 μL，加入乙腈600 μL，渦旋2 min，離心10 min(4 ℃，13 000 r ·min-1)，小心吸取全部上清于40 ℃氮氣流下吹干，殘渣加200 μL 體積分數為50%的甲醇復溶，離心10 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，取上清，待測。

2.5 方法學考察

2.5.1專屬性實驗 分別取大鼠空白血漿、空白血漿加對照品和內標、給藥后的大鼠血漿樣品加內標，按2.4項下方法處理，并按2.1項下色譜條件進樣分析，得到空白血漿、空白血漿+對照品、給藥后血漿樣品色譜圖(圖1)。結果顯示，天麻素與藁本內酯的測定不受血漿中雜質及內源性物質的干擾，且待測成分可實現完全分離，表明建立的方法專屬性良好。

注：A.空白血漿；B.空白血漿加對照品；C.大鼠含藥血漿色譜圖；1.天麻素；2.藁本內酯。

2.5.2標準曲線和線性范圍 分別吸取2.3項下的系列對照品溶液各20 μL，加入200 μL空白血漿中，配制成相應的系列質量濃度含藥血漿樣品，按照2.4項下方法處理，按2.1項下的色譜條件進樣。以各成分質量濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸，線性方程和范圍見表1。結果表明，天麻素和藁本內酯在各自質量濃度范圍內線性關系良好，r≥0.999 5。

表1 天麻素和藁本內酯標準曲線及線性范圍

2.5.3精密度和準確度 取200 μL大鼠空白血漿共6份，加入2.5.2項下配制的高、中、低3個質量濃度的GAS、LIG溶液20 μL，制成制成高、中、低3個質量濃度的質控樣品(QC)，再按照2.4項下方法處理，日內組1 d內連續(xù)測定6次，日間組每天測定1次，連續(xù)6 d，記錄GAS和LIG的峰面積，根據標準曲線計算其質量濃度。結果，血漿中2種成分的日內、日間準確度RE在-13.07%～7.70%之間，日內、日間精密度RSD在0.95%～10.03%之間，均符合生物樣品分析測定方法的要求。見表2。

表2 大鼠血漿中GAS和LIG的精密度和準確度 (n=6)

表3 大鼠血漿中GAS和LIG的回收率 (n=6)

2.5.5穩(wěn)定性實驗 按2.5.3項下含藥血漿樣品的制備方法，對高、中、低質量濃度的血漿樣品進行穩(wěn)定性考察。室溫放置4 h，考察其室溫穩(wěn)定性；-20 ℃冰箱中反復凍融3次，考察其反復凍融穩(wěn)定性；-80 ℃冰箱中冷凍30 d，檢測其長期穩(wěn)定性。結果，樣品在短期、長期、反復凍融穩(wěn)定性試驗中RSD均在1.07%～10.15%之間，RE在-10.56%～12.70%之間，說明血漿樣品在上述考察條件下均穩(wěn)定，符合生物樣品檢測的要求，結果見表4。

表4 大鼠血漿中GAS和LIG的穩(wěn)定性 (n=6)

2.6 藥代動力學研究

選取健康雄性SD大鼠，實驗前禁食12 h，自由飲水，按6 g·kg-1(按15 mL·kg-1)的劑量灌胃給藥，每只大鼠于給藥前及給藥后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10 h眼眶靜脈叢取血，每次取血約0.5 mL，置于用10 μL 10 g·L-1肝素鈉浸潤過的EP管中，以3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血漿，按2.4項下方法處理，按2.1項下條件進樣分析。用DAS2.0軟件進行藥代動力學擬合計算，獲得天麻素、藁本內酯平均藥時曲線與相關藥代動力學參數。擬合結果GAS與LIG藥動學特征符合二室模型，藥動學參數與各組分藥-時曲線見圖2、表5。結果顯示，大鼠給藥5 min后血中可以檢測到GAS和LIG，二者均在0.5 h左右達峰，半衰期較短，分別為8.47 、7.70 h。Cmax分別為(32.37±1.23)、(230.32±2.99) mg·L-1。LIG的Cmax和AUC均較大，有利于發(fā)揮療效。CLz/F分別為(20.22±5.52)、(11.61±1.11) L·h·kg-1，Vz/F分別為(220.41±30.51)、(114.42±153.15) L·kg-1，兩者的MRT(0～t)、 MRT(0～∞)較??；提示在體內的滯留時間短，消除速度快。綜上表明，2種成分在大鼠體內吸收迅速，起效快，不易蓄積；提示QLDXT臨床用藥時二次用藥時間的間隔不能太長，否則難以維持有效血藥質量濃度。

注：A.天麻素；B. 藁本內酯。

3 討論

3.1 測定成分的選擇

灌胃后血漿中主要檢測到天麻素(gastrodin, GAS)、藁本內酯(ligustilide, LIG)、東莨菪內酯、沒食子酸4 種成分，且這4 種成分均為LC-MS物質歸屬中檢測到的成分。研究表明GAS為君藥天麻中的主要成分，具有抗眩暈、降壓、降血脂、降血糖、降低血液黏稠度、腦缺氧保護、抗血小板聚集等多種藥理效應[9-14]。川芎苯酞類成分具有保護心腦血管、改善血液流變和調節(jié)血脂代謝的作用，而LIG則是這些藥效成分之一[15-16]。

表5 GAS和LIG的主要藥代動力學參數

由于沒食子酸和東莨菪內酯的分離度較差，且內源性干擾較大，峰面積較小，該條件下提取回收率較低，因此未能對其進行定量研究。研究表明，達峰質量濃度(Cmax)和血藥質量濃度-時間曲線下面積(AUC0～∞)是評價活性成分體內暴露量的2個重要指標，藥效活性較強且體內暴露顯著的成分可能為復方中的藥效物質基礎[17-18]，故選擇GAS、LIG作為QLDXT藥動學研究的指標成分。

3.2 色譜條件選擇

實驗中嘗試了不同品牌和規(guī)格的色譜柱，如：Thermo Syncronis C18(50 mm×2.1 mm，5 μm)、Lamdo Stamsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，最終以Lamdo Stamsil C18柱(250×4.6 mm，5 μm)分離效果較理想。

3.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法是測定生物樣品時常用的樣品前處理方法。蛋白沉淀法因具有操作簡單、經濟實用的特點，故目前最常用。本實驗中比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇-乙腈(1∶1)、甲醇-乙酸乙酯(1∶1)等不同的處理方法。結果顯示，以上條件下目標峰峰面積無顯著差異，但乙腈沉淀蛋白較為完全，且重復性好，內源性干擾較少，目標峰的提取回收率較高，峰形良好，故用乙腈作為蛋白沉淀劑。實驗初期采用乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水(B)為流動相時，發(fā)現目標峰嚴重拖尾，而采用甲酸后，峰形得以改善。因此，最終選擇乙腈除去血漿中的蛋白，乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水(B)作為流動相。氮吹是富集成分、提高檢測質量濃度的常用方法[19]。為提高目標峰的檢測質量濃度，采用了氮吹復溶的方法。

3.4 藥動學結果分析

強力定眩片6 g·kg-1灌胃給予大鼠后0.5 h左右GAS和LIG在血漿中即達到較高的質量濃度，Cmax分別為32.37 mg·L-1和230.32 mg·L-1，藁本內酯的Cmax和AUC均較高，有利于發(fā)揮療效。CLz/F分別為20.22 L·h·kg-1和11.61 L·h·kg-1，Vz/F分別為220.41 L·kg-1和114.42 L·kg-1，兩者的MRT(0～t)、 MRT(0～∞)較低；提示在體內的滯留時間短，消除速度快。實驗前期對10 批強力定眩片樣品進行檢測時LIG在樣品中的含量并不是最高，可能是LIG脂溶性較大，更易透過生物膜進入體內。綜上表明，GAS和LIG在大鼠體內吸收迅速，起效快，不易蓄積；提示強力定眩片臨床用藥時的二次給藥時間不能間隔太長，否則難以維持有效成分的血藥質量濃度。

4 結論

本實驗首次研究了QLDXT中GAS和LIG在大鼠體內的藥代動力學特點，發(fā)現其體內藥代動力學過程符合二室模型，分布消除迅速,半衰期和血漿清除率均比較穩(wěn)定。這些結果為QLDXT的組織分布研究奠定了基礎。

綜上，本實驗建立了一種簡便、快速的HPLC法，并用于QLDXT血漿中GAS和LIG的測定，為闡明其物效基礎等提供依據。但該方法僅檢測了血漿中的兩種成分，可能原因一是成藥中的含量低，HPLC檢測限不能檢出；二是有可能代謝成其他產物，且目前各成分在機體內的暴露和藥效與靶器官之間的相互作用規(guī)律還不明確。后續(xù)將重點研究入血成分體內暴露量和藥效與靶器官之間的聯系及QLDXT中的其他成分的藥代動力學特征。