安雪蓮，董文建，楊祥春，李霞

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266100）

海洋生物污損是指海洋生物在浸入海水中的任何固體表面的黏附[1-2]，生物體在海洋設(shè)備上的積累會(huì)加速表面腐蝕，增加船舶質(zhì)量和燃料消耗，還可能通過傳播入侵物種造成環(huán)境問題[3-5]，對(duì)經(jīng)濟(jì)、環(huán)境、生態(tài)和安全都產(chǎn)生了不利影響[6]。傳統(tǒng)的防止生物污損的方法是涂刷防污涂料，其防污機(jī)制是通過釋放有毒物質(zhì)來殺死污損生物，但這會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染和生態(tài)系統(tǒng)的破壞。

20世紀(jì)70年代，有機(jī)錫自拋光防污涂料因優(yōu)異的防污性能及減阻性能，占據(jù)了90%的市場(chǎng)份額。然而20世紀(jì)80年代的研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)錫的釋放會(huì)在海水中累積，并導(dǎo)致海洋生物的遺傳變異和畸形，甚至可能通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人類健康[7]。因此，國(guó)際海事組織（IMO）于2008年1月1日宣布禁止使用有機(jī)錫作為海洋防污涂料的防污劑。隨后又不斷有研究證明，廣泛應(yīng)用的氧化亞銅、百菌清等防污劑對(duì)環(huán)境存在著潛在的污染[8-9]，因此開發(fā)新型環(huán)境友好型防污劑是開發(fā)環(huán)保型防污涂料的重點(diǎn)內(nèi)容之一。

目前已有的環(huán)境友好型防污劑主要分為天然產(chǎn)物防污劑和人工合成防污劑，天然產(chǎn)物防污劑是從自然界多種陸生植物和海洋生物中提取的并且具有海洋防污活性的物質(zhì)，其中在辛辣型植物中提取的天然辣素因其抗菌、無毒且環(huán)保而備受關(guān)注[10]，辣素是一種香草酰胺類生物堿，其衍生物繼承了辣素良好的防污性能以及低毒性的特點(diǎn)，將其引入到防污體系中，能滿足防污涂料環(huán)境友好的要求[11-13]。盡管辣素及其衍生物的性能足夠優(yōu)異，但是并沒有在防污涂料中有較大的應(yīng)用。這是因?yàn)樘烊惶崛》ㄖ苽淅彼氐某杀据^高，并且不易得到高純度的辣素產(chǎn)品，而化學(xué)合成法可以彌補(bǔ)這一方面的不足。

本研究從天然辣素的結(jié)構(gòu)出發(fā)，通過化學(xué)合成的方法將功能基團(tuán)引入到酰胺類化合物中，設(shè)計(jì)合成了4種辣素衍生物，對(duì)其進(jìn)行了抑菌性能和抑藻性能的研究，并將合成的化合物作為防污劑配制成海洋防污涂料，通過實(shí)海掛板實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其海洋防污性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料與儀器

N-羥甲基丙烯酰胺、丙烯酸樹脂、松香、二甲苯：工業(yè)級(jí)，淄博市臨淄頤中森化工有限公司；2，3，5-三甲基苯酚、4-氯間苯二酚、3，5-二甲基苯甲醚、2，4-二羥基二苯甲酮、百菌清、濃硫酸、無水乙醇、氧化鐵紅、氧化鈣：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2216E液體培養(yǎng)基、2216E瓊脂：青島海博生物科技有限公司；海洋假單胞菌、海洋黃桿菌：中國(guó)海洋大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；新月菱形藻、三角褐指藻、旋鏈角毛藻：中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院藻種室。

AVATAR-360紅 外 光 譜 儀：Nicolet；JUMECP600核 磁 共 振 波 譜 儀：JEOL；B-545熔 點(diǎn) 儀：Buchi；U-2800紫外可見分光光度計(jì)：Hitachi；MLS-3750高溫滅菌鍋：三洋電機(jī)株式會(huì)社；HZQ-X100震蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；MLR-350H人工氣候培養(yǎng)箱：三洋電氣公司；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司。

1.2 辣素衍生物的合成

取100 mL乙醇作溶劑，在室溫條件下，加入0.1 mol 2，3，5-三甲基苯酚和0.24 molN-羥甲基丙烯酰胺，在電磁攪拌條件下反應(yīng)0.5 h后，逐滴加入10 mL濃硫酸，20 min后升溫至35℃進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)程由薄層色譜TLC[展開劑為石油醚和乙酸乙酯混合物，V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶2]監(jiān)控，直至出現(xiàn)大量固體，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)生的淡黃色固體過濾，并用去離子水充分洗滌粗產(chǎn)品至中性，使用無水乙醇重結(jié)晶得到純凈產(chǎn)物A，烘干密封保存。

參照上述化合物A的合成方法，將2，3，5-三甲基苯酚依次改為4-氯間苯二酚、3，5-二甲基苯甲醚、2，4-二羥基二苯甲酮，從而得到其他3種化合物（B、C、D）。

合成的4種辣素衍生物產(chǎn)物信息如下。

2，4-二丙烯酰胺基-3，5，6-三甲基苯酚（A）：產(chǎn)率71.56%，淡黃色粉末狀，熔點(diǎn)209.8～211.2℃；2，6-二丙烯酰胺基-4-氯間苯二酚（B）：產(chǎn)率61.33%，白色粉末狀，熔點(diǎn)：203.8～205.2℃；2，4-二丙烯酰胺基-3，5-二甲基苯甲醚（C）：產(chǎn)率57.42%，白色粉末狀，熔點(diǎn)：246.9～248.1℃；3，4-二丙烯酰胺基-2，4-二羥基苯甲酮（D）：產(chǎn)率65.68%，白色粉末狀，熔點(diǎn)175.9～177.5℃。

1.3 防污涂料樣板的制備

稱取10 g受試化合物、55 g丙烯酸樹脂、15 g百菌清、17 g顏料（氧化鐵紅、氧化鈣）、2 g輔助材料（松香）、12 g二甲苯，制備防污涂料。用240目砂紙對(duì)PVC樣板表面進(jìn)行拋光打磨，擦拭干凈后涂刷自制的防污涂料，約300 μm厚，置于通風(fēng)處自然晾干。并以不涂任何防污涂料的樣板作為空白組，以不添加辣素衍生物的防污涂料作為對(duì)照組，對(duì)照組將受試化合物用等量的百菌清替代。

1.4 性能測(cè)試與結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 辣素衍生物的結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜：取少量烘干后的辣素衍生物，采用溴化鉀壓片法，在4 000～380 cm-1范圍內(nèi)測(cè)試?yán)彼匮苌锏募t外吸收光譜。

核磁共振氫譜：選擇氘代二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，基準(zhǔn)物質(zhì)為TMS，通過核磁共振波譜儀測(cè)試，經(jīng)MestReNova軟件分析數(shù)據(jù)繪制譜圖。

1.4.2 抑菌性能測(cè)試

（1）培養(yǎng)基和菌懸液制備。

用接種環(huán)刮取培養(yǎng)基上在37℃下充分活化的菌株，接種到液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)24 h。

（2）抑菌率的測(cè)定。

采用稀釋涂布平板法[14]，將新鮮菌懸液進(jìn)行稀釋置于試管中，然后加入一定量的3 mg/mL的辣素衍生物的丙酮溶液，置于震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，之后將培養(yǎng)樣品的菌液用無菌且過濾后的海水依次進(jìn)行10倍的稀釋并混合均勻。吸取200 μL樣品菌液于固體培養(yǎng)基上，并用三角涂布棒均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面至菌液完全被吸收，各樣品每個(gè)濃度均重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，37℃下恒溫培養(yǎng)18 h，計(jì)算活菌數(shù)Tn；以不添加化合物的試管為對(duì)照樣，計(jì)算活菌數(shù)T0，并根據(jù)式（1）計(jì)算抑菌率[15-16]。

1.4.3 抑藻性能測(cè)試

（1）藻液的擴(kuò)種培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)時(shí)將新鮮海水通過纖維素濾膜進(jìn)行過濾后置于121℃高溫下滅菌10 min，將受試藻種加入至營(yíng)養(yǎng)液中，每100 mL營(yíng)養(yǎng)液含50 μL維生素、50 μL痕量元素、100 μL硝酸鈉、100 μL硅酸鈉、100 μL磷酸鈉。接種后的藻種在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為4000 lux，光暗比為12 h∶12 h，溫度為21℃，pH約為8.0[17]。

（2）藻液細(xì)胞濃度-吸光度線性關(guān)系的測(cè)定。

取培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，加入營(yíng)養(yǎng)液稀釋混合均勻后，在最大吸收波長(zhǎng)處對(duì)各稀釋藻液的吸光度進(jìn)行測(cè)量。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到不同稀釋藻液的藻細(xì)胞個(gè)數(shù)，作藻液細(xì)胞濃度-吸光度曲線，得線性回歸方程[11]。

（3）辣素衍生物對(duì)藻類生長(zhǎng)曲線的影響。

將培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液稀釋至合適細(xì)胞濃度，量取200 mL稀釋藻液于錐形瓶中，移取1 mL質(zhì)量濃度3 mg/mL的受試化合物溶液加入到錐形瓶中，混合均勻。以不加受試化合物的藻液作為空白對(duì)照，每隔24 h在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量各藻液的吸光度，根據(jù)藻液細(xì)胞濃度-吸光度曲線繪制藻液細(xì)胞濃度-時(shí)間曲線，測(cè)定化合物對(duì)藻類生長(zhǎng)曲線的影響，并根據(jù)式（2）計(jì)算抑藻率[18]。

式中：N0—對(duì)照組的藻類細(xì)胞濃度；Nx—實(shí)驗(yàn)組的藻類細(xì)胞濃度；N—抑藻率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.4 防污性能測(cè)試

參照GB/T 5370—2007《防污漆樣板淺海浸泡實(shí)驗(yàn)方法》，在海洋生物蓬勃生長(zhǎng)的7—9月，將制備好的涂層樣板浸入在中國(guó)青島海灣的浮伐上，深度為1 m，樣板表面平行于海水的主潮流，定期對(duì)樣板進(jìn)行觀察。根據(jù)樣板上附著生物的物種和數(shù)量等評(píng)價(jià)涂料的防污性能。

指標(biāo)含義：10（20）千伏接入的新能源消納率=規(guī)劃期內(nèi)已接入電網(wǎng)或完成接入系統(tǒng)方案評(píng)審的用戶數(shù)/規(guī)劃期內(nèi)申請(qǐng)接入的分布式光伏等新能源用戶總數(shù)。新能源消納率要求達(dá)到100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 辣素衍生物的結(jié)構(gòu)表征

圖1、圖2為合成的4種辣素衍生物的紅外光譜和核磁共振氫譜。

以辣素衍生物A（2，4-二丙烯酰胺基-3，5，6-三甲基苯酚）為例進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，由圖1（a）可知，在3 307.34 cm-1處出現(xiàn)O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，在3 075.32 cm-1處出現(xiàn)N—H的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 649.58 cm-1處出現(xiàn)仲酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 616.60 cm-1、1 531.81 cm-1、1 457.59 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 228.57 cm-1處出現(xiàn)C—O的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 100.09 cm-1處出現(xiàn)C—N的伸縮振動(dòng)吸收峰，在803.24 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)中CH的面外彎曲伸縮振動(dòng)吸收峰。由圖2（a）可知，除去溶劑峰，各峰的歸屬都比較容易確定。CH3的δ為2.10、2.15和2.27，CH2的δ為4.30，—CH=的δ是5.61，=CH2的δ是6.19苯環(huán)上氫的化學(xué)位移為7.98，N—H的δ是9.16，O—H的δ是9.94。結(jié)合紅外光譜和核磁共振氫譜的數(shù)據(jù)可以得出合成了預(yù)期結(jié)構(gòu)的化合物A。

圖1 合成的4種辣素衍生物的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectra of four derivatives of capsaicin synthesized

圖2 合成的4種辣素衍生物的核磁共振氫譜Fig.2 NMR hydrogen spectra of four synthesized capsaicin derivatives

分析紅外和核磁其他數(shù)據(jù)可知，成功制備了辣素衍生物B、C、D。

2.2 化合物的生物活性測(cè)試結(jié)果

在大型污損生物附著之前，浸水設(shè)施的表面往往會(huì)附著一層由細(xì)菌和單細(xì)胞生物組成的微生物黏膜，它會(huì)產(chǎn)生一些化學(xué)分泌物和增加表面粗糙度，從而對(duì)大型污損的附著有促進(jìn)作用。基于污損生物附著原理，對(duì)防污涂料及主要成分進(jìn)行抑菌抑藻性能測(cè)試可以初步評(píng)價(jià)其防污性能[19]。

2.2.1 抑菌率測(cè)試合成的4種辣素衍生物的抑菌率和抑菌效果如表1和圖3所示。

圖3 含辣素活性結(jié)構(gòu)衍生物對(duì)海洋假單胞菌和海洋黃桿菌的抑制作用Fig.3 Inhibition of capsaicin-containing active structure derivatives against Marine Pseudomonas and Marine Flavobacterium

表1 含辣素活性結(jié)構(gòu)衍生物對(duì)海洋細(xì)菌的抑制率Table 1 Inhibition rates of capsaicin-containing active structure derivatives against marine bacteria

2.2.2 抑藻率測(cè)試

藻液細(xì)胞濃度-吸光度的線性關(guān)系如圖4所示。

由圖4可知，藻液細(xì)胞濃度與吸光度呈線性關(guān)系，可以將測(cè)得的吸光度轉(zhuǎn)化為藻液細(xì)胞濃度。圖5為藻液細(xì)胞濃度-時(shí)間曲線，表2為根據(jù)第7天的數(shù)據(jù)計(jì)算得到抑藻率。

表2 含辣素活性結(jié)構(gòu)衍生物對(duì)藻類的抑制率Table 2 Inhibition rate of capsaicin-containing active structure derivatives on algae

圖4 吸光度-藻液細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.4 Standard working curves of concentration versus absorbance

圖5 含辣素活性結(jié)構(gòu)衍生物對(duì)3種藻類的抑制曲線Fig.5 Inhibition curves of capsaicin-containing active structural derivatives against 3 algaes

由圖5和表2可知，4種化合物對(duì)3種藻的抑制效果類似，均表現(xiàn)出一定的抑藻活性。其中化合物A和B均表現(xiàn)出良好的抑藻性，化合物B有含氯基團(tuán)，對(duì)藻類有較強(qiáng)的抑制作用；化合物A的電負(fù)性大，分子極性和疏水性較大，其特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其容易進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)損壞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)功能，抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.3 防污性能測(cè)試結(jié)果

由抑菌性實(shí)驗(yàn)和藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)可知，4種化合物均有一定的抑制生物活性，以受試化合物作為防污劑添加到海洋防污涂料中，防污涂料的海上掛板實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 添加受試化合物的防污涂料海上掛板3個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of the offshore hanging board experiment of antifouling coatings with tested compounds

從圖6可以看出，在海洋生物生長(zhǎng)旺季掛板3個(gè)月后，空白組表面被大量的藻類、動(dòng)物幼蟲和貽貝等海洋污損生物覆蓋，污損嚴(yán)重。對(duì)照組防污涂層表面附著了藤壺及海藻，而添加了新型辣素衍生物的防污涂層表面光潔，僅有少量污損生物附著，且各涂層表面未出現(xiàn)起泡、脫落等現(xiàn)象，證明新型辣素衍生物作為防污劑與百菌清復(fù)配使用，防污性能優(yōu)于百菌清。

3 結(jié)語

以N-羥甲基丙烯酰胺和芳香族化合物為原料，通過傅克烷基化反應(yīng)合成了4種新型辣素衍生物，產(chǎn)率均在50%以上。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4種化合物對(duì)海洋假單胞菌和海洋黃桿菌均具有一定的抑制能力，其中化合物A和B對(duì)2種菌的抑菌率均可達(dá)到90%以上。抑藻實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物A和B對(duì)三種受試藻的抑制率均可達(dá)到80%以上。將4種化合物作為防污劑，并與百菌清進(jìn)行復(fù)配添加到海洋防污涂料中進(jìn)行實(shí)海掛板，表現(xiàn)出較好的防污效果。由此可見，合成的新型辣素衍生物具有較好的應(yīng)用發(fā)展前景，為進(jìn)一步研發(fā)環(huán)保型防污涂料奠定了基礎(chǔ)。